《环境微生物学》第十三章-微生物与环境监测

2025/3/31第十三章微生物与环境监测2025/3/32第十三章微生物与环境监测第一节水体质量的微生物学检测

一、水体质量的微生物学检测

二、粪便污染指示菌及其检测第二节空气质量的微生物学检测

一、空气细菌检测方法

二、空气细菌总数指标

2025/3/33第三节化学污染物的微生物学检测

一、污染物毒性的细菌学检测

二、污染物致突变性的细菌学检测第四节目标微生物的分子生物学检测

一、PCR－DGGE技术

二、BIOLOG技术

三、FISH技术

四、基因芯片技术

2025/3/34环境监测(environmentalmonitoring):了解环境现状的重要手段，包括化学分析、物理测定和生物监测。微生物监测(microbialmonitoring):利用微生物对环境污染所发出的各种信息来判断环境污染状况的过程。第十三章微生物与环境监测返回2025/3/35第一节水体质量的微生物学检测一、有机物污染指示菌及其检测

（一）细菌总数细菌总数:指将1mL水样(原水样或经稀释的水样)放在营养琼脂培养基上，于37℃培养24小时后，所生长的细菌菌落总数。细菌总数表征:测定结果用“CFU(colonyformationunit/mL”或“个/mL”表示。2025/3/36

根据细菌总数划分天然水体：极清洁水体，101~102CFU

/mL；清洁水体，102~103CFU

/mL；不太清洁水体，103~104CFU

/mL；不清洁水体，104~105CFU

/mL；极不清洁水体，大于105CFU

/mL。生活饮用水国家标准(GB5749-19852006)规定，生活饮用水细菌总数不得超过102

CFU/mL。2025/3/37

（二）腐生细菌数自然水体中的腐生细菌数与有机物浓度成正比，测得腐生细菌数或腐生细菌数与细菌总数之比值，可以推断水体有机污染状况。根据水体中腐生细菌数量，可将水体划分为多污带、中污带和寡污带。按照腐生细菌数与细菌总数的比值，可将水体分为

-腐生带、

-腐生带和多-腐生带。2025/3/38污水带的划分及其特征污水带、特征多污带甲型中污带乙型中污带寡污带腐生细菌数（个/mL-1)数十万至数百万数十万数万数十至数万有机物含大量有机物，主要是蛋白质和碳水化合物主要是氨和氨基酸，有机物含量少有机物含量极微溶解氧极低或几乎没有，厌氧性少量，半厌氧性较多，需氧性很多，需氧性BOD5非常高较高较低很低2025/3/39细菌数与腐生带的划分样点号细菌总数（106/mL-1）腐生细菌数（103/mL-1）腐生菌数／总菌数（％）腐生水波动范围平均波动范围平均11.7~3.32.50.2~1.91.10.04β-腐生带21.6~3.42.40.9~3.02.00.08β-腐生带31.9~3.02.50.2~6.02.90.11β-腐生带44.3~5.04.69.7~16.513.30.30α-腐生带51.8~3.62.61.4~6.23.00.11β-腐生带63.5~6.84.859.2~175.2116.02.42多-腐生带73.1~4.43.719.2~20.520.00.54α-腐生带82.0~2.72.310.3~36.220.20.84α-腐生带92.3~6.94.010.8~147.664.91.62多-腐生带返回2025/3/310

二、粪便污染指示菌及其检测

为何检测粪便污染？人畜粪便中携带着多种微生物，其中一些是肠道内的正常菌群，对人类健康无害；一些是病原菌，对人类健康有害。如果将带有致病菌的粪水排入水体，就会污染水源，引发多种肠道疾病，甚至导致水传性疾病暴发流行。因此，监测水体粪便污染情况很有必要。2025/3/311

为何检测粪便指示菌？污染水中的病原菌量很少，直接检测不仅操作烦琐，检测困难，而且结果阴性也不能保证水样中不含致病菌。在水质卫生学检查中，通常采用易检出的肠道细菌作为指示菌，取代对致病菌的直接检测。若水样中检出指示菌，即认为水体曾受粪便污染，有可能存在致病菌。2025/3/312

（一）指示菌筛选条件①大量存在于人粪中，数量高于病原菌；②易在受人粪污染的水体中检出；③不会在水体中自行繁殖；④在水体中存活时间长于病原菌，对氯与臭氧等消毒剂以及其他不利因素的抵抗力强于病原菌；⑤检测方法简捷；⑥适用于淡水、海水等各种水体。2025/3/313

（二）较适合的指示菌为何说大肠菌群（coliformgroup，简称coliform）是较为适宜的粪污指示标菌？粪便中数量较多；体外存活时间与肠道病原菌大致相同；检验方法简单易行。2025/3/314

（三）大肠菌群

1.大肠菌群特征

大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。在37℃培养24小时，能使乳糖发酵产酸产气。大肠菌群以埃希氏菌（Escherichia）为主，其他还有柠檬酸杆菌（Citrobacter）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等。在粪便中，大肠菌群数量很大，成人每日随粪便排出的菌数多达(5~100)1010个。在环境中，大肠菌群的存在与人类活动有关。在人迹罕到的高山土中，几乎不存在大肠菌群。在经常施用粪肥的菜园土中，大肠菌群非常丰富。2025/3/315大肠菌群的鉴别菌种吲哚试验甲基红试验VP试验柠檬酸钠利用试验氧化酶试验运动性试验大肠埃希氏菌++

弗氏柠檬酸杆菌

+

+

+产气肠杆菌

++

+克雷伯氏菌

++

在某些情况下，需对大肠菌群做进一步鉴定。常用的鉴定试验有：吲哚试验、甲基红试验、VP试验（Voges-Proskauertest）以及柠檬酸钠利用试验。检出大肠埃希氏菌，说明水体最近曾被粪便污染。2025/3/316

为了排除自然环境中原有大肠菌群的干扰，在检测中可将培养温度提高至44℃。粪大肠菌群(fecalcoliform):能在44℃生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群主要来自粪便，称为粪大肠菌群。总大肠菌群(totalcoliform):能在37℃生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群，称为总大肠菌群。在人粪中，粪大肠菌群占总大肠菌群数比例为96.4％。2025/3/3172.大肠菌群检测常用的大肠菌群检测方法有发酵法与滤膜法。（1）发酵法制备不同稀释度的样品。以各稀释度的样品接种乳糖胆盐发酵培养基（或其他乳糖发酵培养基）数管。培养24小时，观察培养结果。观察到乳糖发酵产酸产气现象，判为阳性反应，记下阳性反应的试管数。查专用统计表，求出大肠菌群的最大可能数（MPN）。2025/3/318滤膜法检测大肠菌群数量(引自PrescottLMetal,2002)

（2）滤膜法选用0.45~0.65

m微孔滤膜，抽滤一定数量水样。将滤膜贴在选择性培养基上培养。计数滤膜上的大肠菌群菌落。算出每1000mL水样中含有的总大肠菌群数。2025/3/3193.大肠菌群指标

大肠菌群指数：指100mL水中所含的大肠菌群细菌的个数。

大肠菌群值：指检出1个大肠菌群细菌的最少水样量(毫升数)。大肠菌群值与大肠菌群指数之间的关系为：2025/3/320

国家生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)：总大肠菌群0个/100mL。粪耐热大肠菌群0个/100mL。大肠埃希氏菌0个/100mL。在100mL水样中3个指标都不得检出。返回2025/3/321第二节空气质量的微生物学检测空气中的微生物附着于固体尘埃或液体水滴上，随载体悬浮于空气中。受微生物污染的空气可成为呼吸道传染病的传播媒介，造成传染病流行。直接检测空气中的病原菌尚有困难，取而代之，常以细菌总数作为指标。返回2025/3/322

一、空气细菌检测方法空气中细菌总数检测常用撞击法和平皿沉降法。（1）撞击法用气泵抽吸，使一定量空气通过一狭缝或喷嘴，在出口处形成高速喷射气流。空气中携带微生物的悬浮颗粒撞击并黏附于琼脂培养基平皿上。

37℃下培养24小时。计数菌落，结果以“CFU/m3”表示。2025/3/323

（2）平皿沉降法空气中携带微生物的悬浮颗粒沉降到琼脂培养基平皿中。

37℃下培养24小时。计数菌落，结果以“CFU/[皿(9cm)]”表示。平皿沉降法误差较大，已被逐渐淘汰。返回2025/3/324

二、空气细菌总数指标人群在室内聚集20分钟，室内空气中细菌总数可达4000CFU/m3和33CFU/皿，二氧化碳浓度达0.08%，24.1%的人员会产生异臭感和不舒适感。当细菌总数达6000CFU/m3或75CFU/皿、二氧化碳浓度达1.5%时，55％的人员会产生异臭感和不舒适感。2025/3/325前苏联细菌总数指标：清洁空气，冬季细菌总数少于4.5×103CFU/m3，夏季细菌总数少于1.5×103CFU/m3；污染空气，冬季细菌总数高于7×103CFU/m3，夏季细菌总数高于2.5×103CFU/m3。日本细菌总数指标：清洁空气，细菌总数少于30CFU/皿；普通空气，细菌总数少于75CFU/皿。中国室内空气质量标准(GB/T18883－2002)：细菌总数少于2.5×103CFU/m3。返回2025/3/326第三节化学污染物的微生物学检测一、污染物毒性的细菌学检测（一）发光细菌检测法的原理

在环境不良或存在有毒物质时，发光细菌发光能力减弱，衰减程度与毒物毒性及其浓度成一定的比例关系。通过灵敏的光电测定装置，检测发光细菌受毒物作用时的发光强度变化，可以评价待测物质毒性的大小。这种采用发光细菌检测污染物毒性的方法，称为发光细菌检测法。2025/3/327

FMNH2＋RHO＋O2

——→FMN＋RCOOH＋H2O+光荧光素（FMN）、长链醛（RHO）和萤光酶是细菌发光的基本要素。细菌荧光酶

目前应用最多的发光细菌是明亮发光杆菌（Photobacteriumphosphoreum）T3小种，其发光反应为：2025/3/328

基于发光细菌检测法的测定结果，可进行毒性等级划分。IC50毒性级别等级<25%*很毒125%~75%*有毒275%~100%*微毒3>100%*无毒4毒性等级划分标准返回2025/3/329

二、污染物致突变性的细菌学检测

1.Ames试验法的原理

Ames试验法:美国Ames教授创立的一种致突变测定法。该法利用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）可发生回复突变的性能。在没有受到致突变物质作用时，这些菌株不能在不含组氨酸的培养基上生长。受到致突变物质作用后，它们通过基因突变而回复为野生型，可在不含组氨酸的培养基上生长。

2025/3/330

野生型与组氨酸营养缺陷型沙门氏菌间的关系：野生型his＋

正向突变回复突变营养缺陷型his-2025/3/331Ames试验法检测结果（引自MadiganMTetal,2006）

上图对照滤纸圈上不加化学物质，下图试验滤纸圈上添加化学物质。添加化学物质后，滤纸圈周围的菌落数明显增加。2025/3/3322.Ames试验法的优点（1）准确性高。将175种已知致癌物进行Ames试验，157种呈阳性反应，吻合率达90％。将108种已知非致癌物进行测定，94种呈阴性反应，吻合率为87％。（2）样品量少。可检出微克至毫微克水平污染物的致突变性。（3）综合性强。可检出多种污染物混合物的致突变性，反映其联合效应。2025/3/3333.Ames试验法的应用实例

1964年日本开始使用呋喃基糠酰胺作为食品添加剂。采用大鼠、小鼠做致癌性试验，结果阴性。

1974年采用Ames试验法做致突变性试验，结果阳性。大规模动物实验印证，呋喃基糠酰胺确属致癌性物质。日本政府宣布禁用呋喃基糠酰胺作为食品添加剂。返回2025/3/334第四节目标微生物的分子生物学检测一、PCR-DGGE技术

PCR-DGGE技术是PCR（polymerasechainreaction）技术和DGGE（denaturinggradientgelelectrophoresis）技术的组合。该技术已成为环境微生物研究的重要手段，在污染菌跟踪检测中的作用也越来越大。2025/3/335

（一）PCR-DGGE技术的原理

16SrRNA是原核生物核糖核蛋白体的组成成分，其大小约为1500bp。每种原核微生物都有特定的16SrRNA序列。从样品中提取微生物总DNA，用特异性引物对16SrDNA（编码16SrRNA的基因）进行PCR扩增，再采用DGGE技术分离扩增产物，通过测序获得样品中的16SrDNA序列信息，再与16SrDNA数据库中的序列数据进行比对，建立系统发育树，即可鉴定样品中的原核微生物种类。2025/3/336PCR-DGGE技术原理（引自MadiganMTetal,2006）

2025/3/337

（二）PCR-DGGE技术的应用

1.检测致病菌单核细胞增生利斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）是一种引起人类脑膜炎的致病菌，广泛存在于蔬菜、肉类和家禽上。1992年，Niederhauser等人应用PCR-DGGE技术扩增该致病菌中的hlyA和iap基因，检测时间只需几个小时。采用这种技术检测100个样品，阳性检出率显著高于经典培养法。2025/3/3382.检测基因工程菌

1989年，Chaudry等人将一个基因工程菌接种于经过过滤除菌的湖水及污水中，定期取样，采用PCR-DGGE技术扩增该工程菌的标记物（0.3kbDNA片段）。跟踪监测结果表明，接种10~14天后，仍可在样品中检测到该基因工程菌。返回2025/3/339

二、BIOLOG技术

BIOLOG技术由美国BIOLOG公司于1989年研发成功，最初根据各种细菌的代谢指纹（metabolicfingerprint）来鉴定被分离纯化的微生物种群，至今已能鉴定包括细菌、酵母和霉菌在内的2000多种环境微生物。

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（一）BIOLOG技术的原理

BIOLOG技术通过微孔板（microplate）实施。微孔板上有96个孔穴，预先在96个孔穴内加四唑染料，并在其中95个孔穴内分别加95种碳源物质，剩下1个孔穴不加碳源物质作为对照。将微生物接种至微孔板的各孔穴内，若微生物能够利用其中的碳源物质，则可通过氧化还原反应使四唑染料变为紫色，颜色深浅可反映微生物对碳源物质的利用程度。由于微生物对不同碳源物质的利用能力取决于菌种特性，因此反过来可以根据微生物对95种碳源物质的利用能力来鉴定菌种。2025/3/341

（二）BIOLOG技术的操作BIOLOG技术的操作程序操作程序说明平板选择样品制备样品添加培育与读数针对G+和G-细菌选择不同平板（BIOLOGGP或BIOLOGGN）。从环境介质中提取微生物，控制适宜浓度（以浊度表示）。取一定体积菌液（一般150μL/孔），平行加入各孔穴。恒温培育，用微平板读数器记录各孔穴吸光度值的变化。返回2025/3/342

三、FISH技术

FISH（fluorescenceinsituhybridization）技术是20世纪80年代在原位杂交技术基础上发展起来的分子细胞学技术，至今已成为污染菌检测的有效工具。

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（一）FISH技术的原理

FISH技术的基本原理是利用荧光素标记的DNA探针直接在染色体、细胞或组织水平与特定靶核酸序列的分子进行杂交，再通过荧光显微镜检测技术，确定靶核酸序列在各个结构水平上的空间分布。由于每种细菌的16SrRNA都有独特的序列，利用这些独特序列制成探针，还可鉴别或跟踪样品中的目标细菌。2025/3/344同一样品的相差显微照片（a）和FISH显微照片（b）（引自MadiganMTetal,2006）（a）（b）2025/3/345

（二）FISH技术的操作

FISH技术的操作程序：（1）探针