MicroRNA-现代专题讲座2012

MicroRNA

及其研究进展

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RNA的分类细胞核和胞质线粒体功能核蛋白体RNArRNAmtrRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA剪接、转运小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分3小RNA分子本身又包含若干种RNA，根据小RNA的生成、结构和功能可分为三类：miRNA（microRNA)siRNA(shortinterferingRNA)

其他小RNA4一、miRNA定义及特征5命名原则(1)将物种缩写置于miRNA之前，如hsa-miR-195。(2)确定命名规则之前发现的miRNA，如let-7，则保留原来名字。(3)microRNA简写成miR，再根据其被克隆的先后顺序加上阿拉伯数字，如miR-21。(4)高度同源的miRNA在数字后加上英文小写字母(a、b、c⋯⋯)，如miR-199a和miR-199b。6WhataremicroRNAs？（1）miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，由19-25个核苷酸组成的单链RNA（3´端可有1-2个碱基长度变化）；miRNA表达具有组织特异性和阶段特异性。78WhataremicroRNAs？（2）miRNA具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体；miRNA独有的特征：其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏CmiRNA执行一定的生物学功能：对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用；一些偏大miRNA可能参与基因组的重组装（27nt）；910miRNA的成熟体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：

1）由长的内源性转录本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA)，该过程发生在细胞核;2)将pre-miRNA加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质。11121314151617Pre-miRNAPre-miRNA是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来,它是一种长约70nt的非编码RNA,具有茎-环结构也即发夹状结构。Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA只是pre-miRNA茎中的一个臂18miRNA与靶mRNA的作用模式：二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-4二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译作用。如let-7果蝇/线虫19miRNA与siRNA的作用机制：20miRNA与siRNA的区别：

miRNA产生：细胞内RNA的固有组分之一（正常）来源：内源转录本直接来源：发夹状pre-miRNA结构：单链互补性：不完全互补，存在错配现象对靶RNA特异性：相对较低，一个突变不影响miRNA的的效应途径：miRNA途径对RNA的影响：在RNA代谢的各个层面进行调控功能：调节内源基因的表达在蛋白质合成水平发挥作用，与mRNA的稳定性无关

siRNARNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）

转基因或病毒ＲＮＡ（外源）长dsRNA双链，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU完全互补较高，一个突变即引起RNAi沉默效应的改变

RNAi途径降解靶mRNA抑制转座子活性和病毒感染在转录后水平发挥作用，影响mRNA的稳定性21miRNA与siRNA的联系：均为Dicer的产物：长度均为22nt左右

5＇端是磷酸基

3＇端是羟基均需Argonaute家族蛋白的存在同为RISC的组分二者进化关系上可能的两种推论：

siRNA是miRNA的补充

miRNA进化过程中替代了siRNA沉默机制有重叠22二、microRNAs的生物学功能2324252627282930miR-155与炎症反应miR-155基因的表达与炎性刺激因子密切相关。在巨噬细胞中，炎症介质（聚肌胞苷酸Poly（I:C）、干扰素-β（IFN-β））；细菌脂多糖(LPS)；Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）配体诱导miR-155大量表达。31类风湿性关节炎（RA）

Stancyzk等用TNF-α处理RA病人滑液成纤维细胞，miR-155表达水平明显上调。用炎症因子IL-1β、polyI:C、LPS和细菌脂蛋白刺激RA病人后，miR-155在滑液中表达水平明显高于骨关节炎病人。RA滑液单核细胞中miR-155表达明显高于外周血单核细胞。MMPs1、MMPs3属于蛋白水解酶类，是RA损伤程度的标志。miR-155表达增加能抑制由TOLL样受体配体和细胞因子诱导的MMPs1、MMPs3生成。miR-155可能作为一种保护性的miRNA下调特定MMPs的表达，减少组织损伤引发的炎症反应。32miR-155与免疫反应

活化的B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突细胞中bic/miR-155表达显著增加。在骨髓CD14+单核细胞中，miR-155表达水平是外周血中的4.4倍。Tili等发现miR-155在Th细胞分化、T细胞依赖性抗体反应、细胞因子生成的免疫过程中起着重要作用。33miR-155与肿瘤在甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌等实体瘤中，miR-155高表达，预示预后不良。miR-155在B细胞淋巴瘤、急性髓性白血病M4、M5型中、慢性淋巴细胞白血病表达增加。Nikiforava等检测甲状腺癌的乳头状型、滤泡状癌型、末分化癌型中，miR-155表达分别上调9.5、5.5、13.2倍。3435DLBCL:弥漫大B细胞淋巴瘤CLL:慢性淋巴细胞白血病

ABC：活化B淋巴细胞GC：生发中心363738http://microrna.sanger.ac.uk/39

三、miRNA研究方法40miRNA研究思路表达谱分析生物信息学分析miRNA研究miRNA表达调控miRNA功能研究miRNA作用机理表观遗传学过表达实验抑制表达实验靶标确认信号通路探讨41面临的挑战：寻找一种有效方法来研究miRNA将是目前面临的首要问题。同时又将产生一系列问题：如何分离miRNA分子？如何寻找miRNA分子作用的靶基因？如何研究miRNA与靶mRNA之间的关系？423.1寻找miRNA的方法：A.分子信息学的方法应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。B.分子生物学的方法miRNABioinfoanalysis1:miRNA序列及同源性分析2:miRNA靶标的计算机分析相关数据库：miRBase:microrna.ac.ukPICTAR:TARGERSCAN:43A.分子信息学筛选miRNA原理出发点为miRNA前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。有时几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.提高寻找miRNA基因准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守模序的存在。44B.分子生物学的方法NothernblotMicroarrayQuantitativeReal-timePCR新一代测序45qPCR的方法每次RT只能检测1种miRNA特异性高多个样品中检测同一miRNA价格较高每次RT能检测所有miRNA通用性高适合miRNA的高通量检测经济、方便Loop反转录PolyA加尾法46miRNA表达量的高通量筛选47

miRNAQ-PCRArrayWorkflow48miRNA功能研究的方法：

A分子信息学的手段：MIT的BartelandChrisBurge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间关系的新的计算机方法—TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。

B分子生物学方法495051miRNAfunctionanalysis功能获得研究：把miRNA导入到细胞，进行研究-miRNAmimics-miRNAexpressionclones功能缺失研究：抑制miRNA的表达-miRNA抑制剂miRNA抑制剂表达克隆miRNA的靶标确证52miRNA过表达实验------miRNA表达克隆ExpressionTranslationSuppressionAnd/OrmRNACleavageandDegradation53使用案例------miRNA前体表达克隆54miRNA抑制表达实验------miRNAinhibitorclone55miRNA抑制表达实验------MechanismofmiRNAinhibitorclone抑制翻译封闭miRNA的调节56miRNA靶标确证------靶标确证克隆构建的载体为含双荧光报告基因；萤火虫荧光素酶（hLuc)同miRNA靶标融合表达，用于监控miRNA对靶标的作用效果；海肾荧光素酶