T-GRM 097-2024 耐盐深色有隔内生真菌筛选与鉴定技术体系

ICS13.020.01CCSD00/09GRM系ScreeningandIdentificationofSaltTolerantDIT/GRM097—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 3.1耐盐深色有隔内生真菌（SalttolerantDarkSeptateEndophytes，STDSE） 3.2耐盐性（SaltTolerance） 3.3筛选（Screening） 3.4分离（Isolation） 3.5形态学鉴定（MorphologicalIdentification 3.6分子学鉴定（MolecularIdentification 3.7菌落直径（ColonyDiameter） 3.8梯度盐胁迫固体培养基（SaltStressMedium） 3.9菌丝生长速率（MycelialGrowthRate） 23.10菌落抑制率（ColonyInhibitionRate） 24操作规程 24.1耐盐深色有隔内生真菌的分离纯化与保藏参照附录A执行。 24.2耐盐深色有隔内生真菌的鉴定参照附录B执行。 24.3耐盐深色有隔内生真菌的耐盐性参照附录C执行。 25耐盐性评价 25.1形态学特性 25.2分子鉴定 25.3耐盐性 26包装、运输和贮存 26.1包装 26.2运输 26.3贮存 2附录A（规范性）耐盐深色有隔内生真菌的分离纯化与保藏 3A.1供试材料 3A.2仪器设备 3A.3筛选步骤 3附录B（规范性）耐盐深色有隔内生真菌的鉴定 4B.1供试材料 4B.2仪器设备 4B.3深色有隔内生真菌的形态学鉴定 4B.4深色有隔内生真菌的分子生物学鉴定 4附录C（规范性）耐盐深色有隔内生真菌的耐盐性 5C.1供试材料 5T/GRM097—2024C.2仪器设备 5C.3操作步骤 5C.4结果计算 5T/GRM097—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。耐盐深色有隔内生真菌（SalttolerantDarkSeptateEndophytes，STDSE）是一类存在于植物体内、具有特殊生态适应性的重要微生物资源，广泛分布于盐碱地及其他逆境环境中。该类真菌在提高宿主植物耐盐性、促进植物生长、改善盐碱地土壤生态功能方面具有重要潜力。耐盐深色有隔内生真菌的筛选与鉴定流程团体标准的制定，包括样品采集、真菌分离培养、耐盐性评价及真菌鉴定等关键步骤，建立科学、易操作的筛选和鉴定技术体系，为耐盐真菌资源的开发与利用提供科学依据与技术指导。这不仅有助于提高耐盐深色有隔内生真菌的筛选效率和鉴定准确性，也为盐碱地生态环境的恢复与可持续发展提供了可行的技术支持。本文件由中关村绿色矿山产业联盟提出并归口。本文件起草单位：西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院、中国矿业大学（北京）矿山生态修复研究院、天山实验室、北京合生元生态环境工程技术有限公司。本文件主要起草人：毕银丽、彭苏萍、张士双、谭海、全文智、武超、解琳琳、肖礼、王坤、柯增鸣、白雪蕊、张延旭1T/GRM097—2024耐盐深色有隔内生真菌筛选与鉴定技术体系本文件规定了耐盐深色有隔内生菌分离筛选样品的采集、分离、培养、耐盐性评价及鉴定贮存等要本文件适用于从盐碱地区植物内生组织中分离筛选耐盐深色有隔内生真菌。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T5009.5-2016食品中还原糖的测定《微生物分类鉴定手册》NY/T3833-2021微生物肥料菌种保藏技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1耐盐深色有隔内生真菌（SalttolerantDarkSeptateEndophytes，STDSE）耐盐深色有隔内生真菌是指一类能够在高盐环境中生存、与植物共生而不引起病害的真菌，其菌丝体呈现深色且具有明显的横隔结构。3.2耐盐性（SaltTolerance）微生物或植物在一定浓度盐分（如NaCl）存在下维持正常生长和代谢活动的能力。3.3筛选（Screening）通过设定不同盐浓度梯度，比较菌株的生长特性，从中筛选出耐盐性强的目标真菌。3.4分离（Isolation）从植物样本中获取单一菌种的过程，包括样本处理、消毒、培养及分离纯化步骤，最终得到内生真菌的纯培养物。3.5形态学鉴定（MorphologicalIdentification）：通过观察微生物的物理特征（如形状、大小、颜色、菌丝和孢子结构）和生长特性识别和分类微生物的方法。3.6分子学鉴定（MolecularIdentification）：通过分析微生物的DNA或RNA序列来确定其种类和关系的方法。3.7菌落直径（ColonyDiameter）真菌在固体培养基上培养一定时间后，菌落的直径大小，通常作为表征菌体生长状况的重要指标之3.8梯度盐胁迫固体培养基（SaltStressMedium）2T/GRM097—2024盐胁迫培养基是指培养基中添加了一定浓度的盐（如NaCl模拟极端盐胁迫环境，研究微生物在盐碱条件下的生长、适应性和耐盐性。3.9菌丝生长速率（MycelialGrowthRate）指单位时间内真菌菌丝在培养基表面或内部的延伸速度，通常通过测量菌落直径的日增长量来表示。3.10菌落抑制率（ColonyInhibitionRate）指在特定盐胁迫环境条件下，菌株菌落直径相比对照组的生长抑制程度。4操作规程4.1耐盐深色有隔内生真菌的分离纯化与保藏参照附录A执行。4.2耐盐深色有隔内生真菌的鉴定参照附录B执行。4.3耐盐深色有隔内生真菌的耐盐性参照附录C执行。5耐盐性评价5.1形态学特性菌丝呈深色，显微镜下观察到明显的有隔结构，符合深色有隔真菌的形态特征。5.2分子鉴定分子鉴定结果显示，菌株ITS序列与已知的深色有隔真菌类群相似性≥95%。5.3耐盐性在≥3%（w/v）的NaCl浓度下，菌株能正常生长，菌落直径显著高于对照组50%以上，且具有较强的耐盐适应能力（在6%以上仍能生长）。若分离菌株满足以上三个方面的标准，即可判定为耐盐深色有隔内生真菌，并可纳入后续应用或资源库保藏。6包装、运输和贮存6.1包装液体状态产品使用0.2μm滤膜的透气盖棕色培养瓶进行包装。固体产品使用直径90mm的培养皿封装，并用无菌封口膜对培养皿进行密闭处理，操作在无菌环境中进行。孢子粉末产品使用EP管或者使用密封性良好的玻璃瓶（内加干燥剂）进行包装。6.2运输运输过程中液体状态产品勿倒置，固体产品避免重压和碰撞，所有产品皆需低温（2-8℃)运输并且必须按照货物运输规定进行，切勿与人体和土壤有害的物品混装。6.3贮存液体和固体产品应放于低温（2-8℃)避光的环境中。湿度保持在50%-70%范围内，保持保存环境的密闭性。孢子粉应放于低温（2-8℃)避光干燥的环境中并保持保存环境的密闭性。3T/GRM097—2024（规范性）耐盐深色有隔内生真菌的分离纯化与保藏A.1供试材料植物材料：选取盐碱环境下的健康植物的细根。分离培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potatodextroseagar，PDA）实验试剂：无水乙醇，次氯酸钠，氨苄青霉素、硫酸链霉素。A.2仪器设备电子天平（感量0.01g），无菌操作台，超纯水系统，高压蒸汽灭菌锅（137℃,0.25MPa），恒温培养箱。A.3筛选步骤A.3.1样本采集随机选取样地内长势良好的植物，去除植株根围枯枝落叶层，在距植株主干0-30cm范围内选取新鲜的健康的细根样品，并标记（取样植物，取样时间，取样地点）。A.3.2内生真菌的分离将植物根段用去离子水洗涤干净，在75%（v/v）乙醇中消毒5min；然后用10%（v/v）次氯酸钠消毒5min，去无菌水漂洗3次并在无菌滤纸上干燥。灭菌处理后的根段用无菌的剪刀将根段剪成3-5cm左右的小段放入PDA培养基（50mg·L-1氨苄青霉素和50mg·L-1硫酸链霉素）中，在27℃下倒置黑暗培养，并每天观察。将根段上长出的深色菌丝转接到新的PDA培养基再行培养和纯化。A.3.3深色有隔内生真菌的纯化培养基上有新菌丝长出时，及时用灭过菌的接种针将菌丝边缘连同少量培养基挑到新的PDA平板上，反复挑取3~A次，直至获得单一菌株，并对菌株命名编号。A.3.4深色内生真菌的纯化判定标准菌落的形态和颜色一致，无杂色；并通过显微镜观察，确认菌丝形态特征是有横隔结构。A.3.5消毒可靠性检验将洗涤液涂布于PDA固体培养基，设为对照，用于检查消毒效果。具体操作步骤如下：取100μL表面消毒最后一次冲洗后的无菌水，涂布在PDA培养基上，28℃恒温培养，观察是否有菌丝长出，检验表面消毒效果。如果对照有菌丝长出，视为试验失败，需重新进行分离。A.3.6菌种保藏对分离的深色有隔内生真菌进行4℃保存和冷冻干燥保藏。具体操作参照标准NY/T3833-2021。4T/GRM097—2024（规范性）耐盐深色有隔内生真菌的鉴定B.1供试材料菌株：分离菌株。活化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potatodextroseagar，PDA）实验试剂：无水乙醇，次氯酸钠，氨苄青霉素、硫酸链霉素、氯化钠、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、DreamTaq-TMDNAPolymerase、dNTP、琼脂糖、SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒、DNALadderMixmaker引物、枪头、PCR管、离心管、pMDl8-TVector连接试剂盒和SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒。B.2仪器设备电子天平（感量0.01g），超纯水系统，高压蒸汽灭菌锅（137℃,0.25MPa），恒温摇床，恒温培-8℃~10℃)。B.3深色有隔内生真菌的形态学鉴定将纯化后的内生真菌继续接种到PDA培养基上，依据《真菌鉴定手册》中形态学鉴定的方法对内生真菌的颜色、生长速度和菌落形态进行定期观察和记录。B.4深色有隔内生真菌的分子生物学鉴定B.4.1菌种活化将鉴定得到的深色有隔内生真菌活化，用无菌打孔器在菌落边缘切取直径5mm的菌饼，置于PDA培养基中，28℃黑暗培养10d，以保证其菌丝和孢子的活力。B.4.2DNA提取挑取50mg左右的深色有隔内生真菌菌丝，参照真菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工）的方法提取深色有隔内生真菌DNA。B.4.3扩增提取出的DNA用于ITS序列的扩增。扩增引物为真菌ITS基因序列通用引物，上游引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），下游引物：ITS4-R（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反应体系如下（25μL）：10XPCRbuffer、dNTP（各10mM）、TaqPlusDNAPolymerase），PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30sec,57℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30个循环；72℃修复延伸10min。B.4.4测序PCR扩增产物电泳后，凝胶成像仪下观察，可以看到700bp左右的条带。PCR产物回收参照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书，回收产物送商业公司测序。B.4.5序列比对利用Blast（/Blast.cgi）将待测菌株的ITS序列与Genbank中已知真菌的ITS序列进行比对。将测序结果与标准菌株的序列导入到ClustalX1.83中进行校准对齐，通过MEGA5.05将待测菌与标准菌的序列进行对比，计算出进化距离并用neighbor-joining法建树，BacillussubtilisNCDO1769作为外群，采用Bootstrap法，重复次数为1000。5T/GRM097—2024（规范性）