2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体课件【知识精研】高二下学期生物人教版选择性必修3

2.2动物细胞工程二、动物细胞融合技术与单克隆抗体“生物导弹”追踪癌细胞抗体植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。

什么是动物细胞融合技术？单克隆抗体是如何制备的?在临床上有哪些应用？本节聚焦12

靶向药物是指被赋予了靶向（Targeting）能力的药物或其制剂。其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。

制备靶向药物的其中一种思路是将抗体等适配体能够与靶标分子特异性结合的探针分子通过化学或物理方法偶联到药物或其载体表面，从而赋予药物或其载体主动与靶标结合的能力时间成果19世纪30年代观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞1858年观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。1876年在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。1962年日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1965年英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)动物细胞融合技术的发展历史动物细胞工程2.动物细胞融合

人体血液中的树突状细胞是一种具有很强的抗原呈递功能的淋巴细胞。近年来的研究发现，树突状细胞与肿瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，既能表达肿瘤抗原，又能合成激活T细胞的相关刺激分子。用此方法制成的肿瘤疫苗可以诱导机体产生较强的特异性免疫反应，这为癌症的治疗提供了新的方法。讨论：1.但如何才能让两个不同的细胞融合?2.细胞融合技术在生产实践中有哪些应用?

到社会中去19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象?旁栏思考P49病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。动物细胞工程2.动物细胞融合阅读课本P48，回答以下问题1.什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？2.所形成的杂种细胞有什么特点？3.诱导动物细胞融合的方法有哪些？4.动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？（1）动物细胞融合技术：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术诱导原生质体融合

物理方法：电融合法、离心法

化学方法：聚乙二醇融合法、

高Ca2+-高pH融合法（2）原理：细胞膜具有流动性

诱导动物细胞融合

物理方法：电融合法

化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：灭活的病毒诱导法动物细胞工程2.动物细胞融合病毒的灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）灭活病毒诱导细胞融合的原理

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。动物细胞工程2.动物细胞融合1965年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。（3）过程动物细胞工程2.动物细胞融合杂种细胞经第一次有丝分裂两个核才融合细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核(4)

结果：形成单核细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。思考：诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。动物细胞工程2.动物细胞融合①突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。②成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。③利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。

(5)意义：植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导融合的方法意义和用途克服远源杂交的障碍，获得杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理：电融合法、离心法化学：聚乙二醇融合法、

高Ca2+-高pH融合法物理：电融合法化学：PEG融合法生物方法：灭活的病毒诱导法制备单克隆抗体动物细胞工程2.动物细胞融合【典例1】如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是()A.若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去壁再诱导融合B.若a细胞和b细胞为植物原生质体，则可用灭活的病毒诱导融合C.c细胞的形成与a、b细胞膜的选择透过性有关D.c细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因A动物细胞工程2.动物细胞融合一个捐献者200~300ml的血浆，如果合格，只能治疗2~3个患者，如何大量制备？动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用

前段时间，全国在抗击COVID-19疫情的时候，我们从新闻里看到很多康复者在捐献血浆，用来治疗其他病人。那么，血浆里到底是什么东西能够治疗新型冠状病毒感染？

能够引起机体产生特异性免疫应答的物质叫做抗原。

例如花粉、病菌、病毒等。有时自身的组织或细胞也会成为抗原，如癌细胞等。★什么是抗原？★什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里?起何作用？当机体受到抗原刺激后由浆细胞产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白——抗体。

抗体主要分布于血浆中，也分布于组织液及外分泌液中。动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用从血清中分离抗体B细胞浆细胞抗原传统抗血清(多克隆抗体)(一种抗原可存在多种抗原决定簇)增殖分化（多种）反复注射刺激（多克隆抗体）动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（1）早期获得抗体的方法血清抗体（也称多克隆抗体）由血清中提取的抗体是由不同浆细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上。特点：产量低、纯度低、特异性差、

反应不够灵敏。（2）一个大胆的设想

将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。那这样就能够提高抗体的产量、同时提高纯度和灵敏性。杰尼丹麦科勒德国米尔斯坦英国创立抗原选择抗体学说，发明了单克隆抗体技术，因此获得了1984年的诺贝尔生理或医学奖。动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用①获得单一的纯抗体？每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体②大量？让B细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。③B细胞不能无限增殖？癌细胞动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（2）一个大胆的设想一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞动物细胞融合杂交瘤细胞动物细胞培养大量的特定抗体阅读P48-49图2-16，思考以下问题：①为什么给小鼠注射特定的抗原？②会有几种细胞融合方式（只考虑两个细胞融合）？③杂交瘤细胞是如何筛选出来的？④是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？⑤有几次筛选过程？目的是什么？⑥如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（3）单克隆抗体的制备过程动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。多种杂交细胞诱导融合用特定的选择培养基进行筛选①为什么给小鼠注射特定的抗原？②会有几种细胞融合方式（只考虑两个细胞融合）？资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。B淋巴细胞骨髓瘤细胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、AA、B、BB、AB1、AB2、AB3骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合多种杂交细胞筛选杂交瘤细胞（3）单克隆抗体的制备过程动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用HAT培养基既能产生抗体，又能大量增殖③杂交瘤细胞是如何筛选出来的？氨基喋呤动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。（3）单克隆抗体的制备过程【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞。多孔细胞培养板抗体检测板阳性孔④是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体？注射到小鼠腹腔内体外培养⑤有几次筛选过程？目的是什么？⑥如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？两次一筛：筛选出既能迅速大量增殖，又能产生抗体的杂交瘤细胞二筛：筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用单克隆抗体二筛杂交细胞杂交瘤细胞体外细胞培养小鼠腹腔内增殖一筛骨髓瘤细胞诱导细胞融合能分泌所需抗体的杂交瘤细胞培养液中提取经过免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖特点：特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原免疫结合课文P53-54页“单克隆抗体制备”部分和图2-24，构建单克隆抗体制备过程模型图：动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用单克隆抗体腹水中提取HAT培养基克隆化培养抗体检测动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（4）单克隆抗体的应用①作为诊断试剂——最广泛应用资料1.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。用于多种疾病的诊断和病原体鉴定。甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备__________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。抗原抗AFP单克隆抗体AFP肿瘤动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（4）单克隆抗体的应用资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。②用于治疗疾病和运载药物动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（4）单克隆抗体的应用1.ADC和抗体和药物各具有有什么作用？2.除了细胞毒素，还有那些无知理论可以作为ADC偶联的药物？抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物

可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（4）单克隆抗体的应用P50思考与讨论单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性强和灵敏度高。ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（4）单克隆抗体的应用P50思考与讨论A.特异性强、灵敏度高生物导弹

——单克隆抗体＋抗癌药物B.疗效高、毒副作用小动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用（4）单克隆抗体的应用②用于治疗疾病和运载药物【典例2】核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径(如下图)。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。关于筛选原理的叙述，正确的是()A.免疫B细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖B.骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖C.杂交瘤细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖D.HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度目标抗体B【典例3】（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ)）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：（1）上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_________________。（2）写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_________________。诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液【典例3】（2020年全国统一高考生物试卷（新课标Ⅰ)）为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：（3）为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于_____________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_________________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是_________________。选择培养基只有杂交瘤细胞能够生存抗原与抗体的反应具有特异性（4）若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有________________________________________（答出2点即可）。将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外培养

练习1.单抗制备过程分哪几步？请用箭头把以下各步骤的字母按正确顺序连接起来。练习2.(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自小鼠体内的

细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射______类物质。（2）d过程是一个______________的过程，该过程的进行常用_____________或_____________诱导。(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成

种类型的C细胞，因此需用__________培养基筛选出D细胞用于培养，D细胞的名称是

___

，其特点是_________________________________________。B淋巴

抗原

动物细胞融合

聚乙二醇

选择性3既能无限增殖又能产生特异性抗体

杂交瘤细胞灭活病毒练习2(4)在培养时通过________分裂方式大量繁殖。D细胞体外培养需要注意的条件是（要求答4项）___________________________________________。（5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是_________________特异性强、灵敏度高，并可能大量制备有丝无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pH；适宜的气体环境

练习3.由单克隆抗体研制而成的“生物导弹”由两部分组成，一是“瞄准装置”，二是杀伤性“弹头”，下列对此描述不正确的是()A.“瞄准装置”是由识别肿瘤的单克隆抗体构成B.“弹头”是由放射性同位素、化学药物和毒素等物质构成C.“弹头”中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能D.“生物导弹”是利用细胞工程制出来的练习4.在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是A.结果是相同的B.杂种细胞的形成过程基本相同C.操作过程中酶的作用相同D.诱导融合手段的手段相同CB练习5.犬细小病毒(CPV)单克隆抗体(CpvMcAb)可抑制病毒对宿主细胞的侵染及病毒的复制，进而杀灭幼犬体内病毒。下列相关叙述，错误的是()A．在CpvMcAb的制备过程中用到了动物细胞培养和动物细胞融合技术B．给幼犬注射CPV后，CPV抗体检测呈阳性，说明发生了体液免疫反应C．经选择性培养基筛选出来的杂交瘤细胞即可直接生产CpvMcAbD．对杂交细胞培养时，需要无菌无毒环境，且温度、气体环境等要适宜练习6.科学家以COVID－19(新冠病毒)的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述，正确的是(

)A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染COVID－19B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对COVID－19的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体CA练习7.人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白,可通过孕妇血液循环而随尿排出,利用HCG单克隆抗体诊断是否妊娠的灵敏度很高,回答下列问题:(1)在人体内,糖蛋白可分布在体液、

等处,其中后者的糖蛋白具有

(至少答两点)作用。

(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同,利用了

。动物细胞融合可利用灭活病毒,灭活是指

。

(3)在制备单克隆抗体过程中获得杂交瘤细胞其目的是解决

等问题。从杂交瘤细胞中筛选获得足够数量能分泌所需抗体的细胞需要进行

。

(4)在体外培养杂交瘤细胞时,需要控制其培养条件,若采用无血清培养,则需要在基本培养基中添加