环状RNA在肠道干细胞自我更新中的调控机制与功能研究

环状RNA在肠道干细胞自我更新中的调控机制与功能研究一、引言1.1研究背景肠道作为人体消化系统的重要组成部分，不仅承担着消化食物、吸收营养物质的关键任务，还在维持机体免疫平衡和内环境稳定方面发挥着不可或缺的作用。肠道上皮是肠道与外界环境直接接触的界面，它不断地受到各种物理、化学和生物因素的刺激，同时也面临着细胞自然衰老和凋亡的过程。在这一动态变化的过程中，肠道干细胞（IntestinalStemCells，ISCs）作为肠道上皮的“种子细胞”，发挥着至关重要的作用。肠道干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，主要定位于小肠的隐窝（cryptsofLieberkühn）中，这是一种深入肠壁的管状结构，其底部便是肠道干细胞的所在地。肠道干细胞通过自我更新，能够不断产生新的干细胞，维持自身数量的相对稳定，同时，它们又能分化为多种成熟的肠道细胞类型，包括吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞等，这些不同类型的细胞各司其职，共同维持着肠道的正常生理功能。例如，吸收细胞主要负责吸收水分和营养物质，确保机体能够摄取足够的能量和营养；杯状细胞分泌黏液，起到保护和润滑肠道的作用，有助于食物的顺利通过和防止肠道黏膜受到损伤；潘氏细胞位于隐窝底部，分泌防御肽，对维持肠道的微生态平衡和抵御病原体入侵发挥着重要作用；肠内分泌细胞则分泌多种激素，调节肠道和全身的生理功能，如调节胃肠蠕动、消化液分泌以及血糖水平等。肠道干细胞的自我更新能力是维持肠道上皮组织稳定性和完整性的关键。在正常生理状态下，肠道干细胞大约每3-5天更新1次，以维持肠道上皮的动态平衡。这一更新过程能够及时补充因日常代谢而损失的肠黏膜细胞，保持肠道内环境的稳定。此外，当肠道受到损伤时，肠道干细胞会迅速增殖并分化，替代受损的细胞，帮助肠道恢复正常功能。无论是因炎症性肠病导致的肠道黏膜损伤，还是因辐射暴露等因素引起的肠道组织破坏，肠道干细胞都能积极响应，启动修复机制，促进肠道的愈合。这种修复功能对于维持肠道健康和整体内环境稳定至关重要，如果肠道干细胞的自我更新和修复能力受损，可能会导致肠道疾病的发生和发展。肠道干细胞的异常调节与多种肠道疾病密切相关。在炎症性肠病（InflammatoryBowelDisease，IBD），包括克罗恩病（Crohn'sDisease，CD）和溃疡性结肠炎（UlcerativeColitis，UC）中，肠道干细胞的功能受到抑制，其自我更新和分化能力下降，导致肠道上皮的修复和再生受阻，从而加重肠道炎症和损伤。在结直肠癌的发生发展过程中，肠道干细胞的异常增殖和分化失控，可能使其转化为肿瘤干细胞，进而引发肿瘤的形成和发展。研究肠道干细胞自我更新的调控机制，对于深入理解肠道疾病的发病机制，开发新的治疗策略具有重要意义。1.2研究目的与意义本研究旨在深入揭示环状RNA调控肠道干细胞自我更新的分子机制，为肠道相关疾病的发病机制研究提供新的理论依据，也为开发新型治疗策略提供潜在的靶点和思路。肠道干细胞在维持肠道上皮组织的稳定性和完整性方面起着关键作用，其自我更新能力的异常与多种肠道疾病的发生发展密切相关。尽管目前对肠道干细胞的研究取得了一定进展，如对其生物学特性、分化潜能以及在肠道疾病中的作用有了初步认识，但对于肠道干细胞自我更新的调控机制，尤其是环状RNA在其中的作用，仍存在许多未知。环状RNA作为一类新兴的非编码RNA，具有独特的结构和功能，在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要的调控作用。然而，环状RNA在肠道干细胞自我更新中的作用及机制尚未得到充分研究。本研究将系统地探讨环状RNA对肠道干细胞自我更新的调控作用，填补这一领域的知识空白。从理论意义来看，本研究有助于深入理解肠道干细胞自我更新的分子调控网络，丰富对肠道发育和稳态维持机制的认识。肠道干细胞的自我更新是一个复杂的生物学过程，涉及多种信号通路和分子机制的相互作用。环状RNA的参与可能为这一过程增添新的调控层次，揭示其作用机制将有助于完善我们对肠道干细胞生物学的理解。此外，研究环状RNA在肠道干细胞中的功能，也将为非编码RNA领域的研究提供新的视角和思路，拓展对非编码RNA生物学功能的认识。在实际应用方面，本研究具有重要的临床意义。炎症性肠病和结直肠癌等肠道疾病严重影响患者的生活质量和健康，给社会带来了沉重的负担。目前，这些疾病的治疗手段仍存在一定的局限性，治疗效果不尽如人意。通过揭示环状RNA调控肠道干细胞自我更新的分子机制，有望发现新的治疗靶点，为开发更加有效的治疗方法提供理论基础。对于炎症性肠病患者，可通过调节环状RNA的表达或干预其相关信号通路，促进肠道干细胞的自我更新和肠道上皮的修复，从而改善疾病症状。在结直肠癌的治疗中，针对异常表达的环状RNA及其相关调控机制，可设计特异性的治疗策略，抑制肿瘤干细胞的增殖和分化，提高治疗效果。二、肠道干细胞与自我更新2.1肠道干细胞概述肠道干细胞是一类存在于肠道组织中的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，在维持肠道上皮组织的稳态和修复中发挥着关键作用。肠道干细胞主要定位于小肠隐窝底部，这一特殊的解剖位置为其提供了独特的微环境，即干细胞龛。小肠隐窝是上皮向固有层凹陷形成的管状结构，其底部包含了多种细胞类型，如潘氏细胞、肠内分泌细胞和肠道干细胞等。这些细胞之间相互作用，共同维持着肠道干细胞的干性和功能。肠道干细胞与周围的潘氏细胞紧密相邻，潘氏细胞能够分泌多种生长因子和细胞因子，如Wnt3、表皮生长因子（EGF）和Notch配体等，这些信号分子对于维持肠道干细胞的自我更新和增殖能力至关重要。肠道干细胞龛中的细胞外基质成分，如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等，也为肠道干细胞提供了物理支撑和信号传导的平台，参与调节其生物学行为。肠道干细胞具有一系列独特的生物学特征，这些特征使其区别于其他类型的细胞。肠道干细胞具有高度的增殖能力，能够不断分裂产生新的细胞。在正常生理状态下，肠道干细胞大约每3-5天更新1次，以维持肠道上皮细胞的动态平衡。这种快速的更新能力确保了肠道上皮能够及时替换受损或衰老的细胞，保持其正常的生理功能。肠道干细胞具有多向分化潜能，能够分化为多种成熟的肠道细胞类型，包括吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞等。这些不同类型的细胞在肠道中发挥着各自独特的功能，共同维持着肠道的消化、吸收和免疫等生理过程。吸收细胞具有微绒毛结构，能够增加细胞表面积，提高对营养物质的吸收效率；杯状细胞分泌黏液，形成黏液层，保护肠道黏膜免受病原体和有害物质的侵袭；潘氏细胞分泌抗菌肽和溶菌酶等物质，参与肠道的免疫防御；肠内分泌细胞分泌多种激素，如胃泌素、胰岛素样生长因子和胰高血糖素样肽-1等，调节肠道的消化、吸收和代谢等生理功能。肠道干细胞还具有自我更新能力，即干细胞在分裂过程中，能够产生一个与自身相同的干细胞和一个分化的子细胞，从而维持干细胞池的大小和功能。这种自我更新能力是肠道干细胞能够长期维持肠道上皮组织稳态的关键。肠道干细胞在肠道上皮细胞的生成中起着核心作用。肠道上皮是人体与外界环境接触最频繁的组织之一，每天都面临着大量的物理、化学和生物刺激，因此需要不断更新以维持其正常功能。肠道干细胞通过自我更新和分化，源源不断地为肠道上皮提供新的细胞。在肠道干细胞的分化过程中，首先会产生短暂扩增细胞（Transit-AmplifyingCells，TACs），这些细胞具有较高的增殖能力，但分化潜能相对有限。短暂扩增细胞会经历多次分裂，然后逐渐分化为各种成熟的肠道细胞类型。这些成熟细胞会沿着隐窝-绒毛轴向上迁移，最终到达绒毛顶端，在完成其生理功能后，通过凋亡或脱落的方式离开肠道上皮。在这个过程中，肠道干细胞的自我更新和分化受到多种信号通路和分子机制的精确调控，以确保肠道上皮细胞的生成和更新能够有序进行。如果肠道干细胞的功能出现异常，可能会导致肠道上皮细胞的生成和更新失衡，进而引发各种肠道疾病。2.2自我更新机制肠道干细胞的自我更新是维持肠道上皮组织稳态的关键过程，主要通过对称分裂和不对称分裂两种方式来实现。对称分裂是指一个肠道干细胞分裂产生两个完全相同的子细胞，这两个子细胞都具有与母细胞相同的干细胞特性，即自我更新和多向分化的能力。在这种分裂方式下，干细胞池的数量会增加，为肠道上皮组织的生长和修复提供更多的细胞来源。当肠道受到损伤或处于生长发育阶段时，肠道干细胞会通过对称分裂快速增殖，以满足组织对细胞数量的需求。在肠道损伤修复过程中，损伤部位附近的肠道干细胞会感知到损伤信号，启动对称分裂，产生大量的子代干细胞，这些干细胞随后会进一步分化为各种成熟的肠道细胞，参与受损组织的修复和再生。对称分裂过程受到多种信号通路的精确调控，其中Wnt信号通路在促进肠道干细胞对称分裂中发挥着关键作用。Wnt信号通路的激活能够上调一系列与细胞增殖相关的基因表达，如CyclinD1等，从而促进细胞周期的进展，使肠道干细胞能够快速分裂。不对称分裂则是指一个肠道干细胞分裂产生两个不同命运的子细胞，其中一个子细胞保持干细胞特性，继续留在干细胞龛中，维持干细胞池的稳定；另一个子细胞则开始向特定的细胞类型分化，如吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞或肠内分泌细胞等。这种分裂方式既能保证干细胞数量的相对稳定，又能为肠道上皮组织提供源源不断的分化细胞，维持肠道的正常生理功能。在正常生理状态下，肠道干细胞主要通过不对称分裂来维持肠道上皮细胞的更新和稳态。在不对称分裂过程中，细胞内的一些蛋白质和细胞器会发生不对称分布，这种不对称分布决定了两个子细胞的不同命运。一些极性蛋白，如Par3、Par6和aPKC等，在肠道干细胞中形成不对称的分布模式，它们参与调控细胞的分裂平面和命运决定因子的分配，使得一个子细胞能够继承更多的干细胞维持因子，从而保持干细胞特性，而另一个子细胞则获得更多的分化诱导因子，开始向特定细胞类型分化。Notch信号通路在肠道干细胞的不对称分裂和分化过程中起着重要的调节作用。Notch信号通路的激活能够抑制肠道干细胞的分化，维持其干性；而当Notch信号通路被抑制时，肠道干细胞则会倾向于分化为特定的细胞类型。肠道干细胞的自我更新对于维持肠道上皮组织的稳定性和完整性具有重要意义。通过自我更新，肠道干细胞能够不断补充因细胞凋亡、损伤或正常代谢而损失的肠道上皮细胞，确保肠道上皮的正常功能。在正常情况下，肠道上皮细胞的更新速度约为每3-5天一次，这一过程依赖于肠道干细胞的持续自我更新和分化。如果肠道干细胞的自我更新能力受损，可能会导致肠道上皮细胞的数量减少，从而影响肠道的消化、吸收和免疫等功能。在衰老过程中，肠道干细胞的自我更新能力逐渐下降，肠道上皮的修复和再生能力也随之减弱，这使得老年人更容易出现肠道功能紊乱和疾病。肠道干细胞的自我更新对于肠道的损伤修复至关重要。当肠道受到物理、化学或生物因素的损伤时，肠道干细胞能够迅速响应，通过自我更新和分化产生大量的新细胞，替代受损的细胞，促进肠道组织的修复和愈合。在炎症性肠病中，肠道黏膜受到炎症损伤，此时肠道干细胞会被激活，通过自我更新和分化来修复受损的黏膜组织。如果肠道干细胞的自我更新和修复能力不足，可能会导致炎症持续存在，病情迁延不愈，甚至发展为更严重的肠道疾病。2.3肠道干细胞自我更新的调控因素2.3.1信号通路肠道干细胞的自我更新受到多种信号通路的精细调控，其中Wnt、Notch和BMP等信号通路在这一过程中发挥着关键作用。Wnt信号通路是调控肠道干细胞自我更新的核心信号通路之一。在肠道干细胞中，Wnt信号通路的激活主要通过经典的Wnt/β-catenin途径实现。当Wnt配体与细胞膜上的Frizzled受体和LRP5/6共受体结合后，会抑制胞质中的β-catenin降解复合物（包括APC、Axin、GSK-3β和CK1等）的活性，从而使β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与转录因子TCF/LEF家族成员结合，激活一系列与细胞增殖和自我更新相关的靶基因表达，如c-Myc、CyclinD1和Lgr5等。c-Myc是一种原癌基因，它可以促进细胞周期的进展，增强细胞的增殖能力；CyclinD1是细胞周期蛋白，参与细胞周期从G1期到S期的转换，对细胞增殖起着重要的调节作用；Lgr5是肠道干细胞的特异性标志物，其表达的上调有助于维持肠道干细胞的干性和自我更新能力。研究表明，在小鼠模型中，条件性敲除肠道干细胞中的β-catenin基因，会导致肠道干细胞的自我更新能力显著下降，肠道隐窝数量减少，肠道上皮的再生和修复能力受损。相反，激活Wnt信号通路，如通过给予外源性的Wnt配体或抑制β-catenin的降解，能够促进肠道干细胞的增殖和自我更新，增加肠道隐窝的数量和大小。Notch信号通路在肠道干细胞的自我更新和分化平衡中起着重要的调节作用。Notch信号通路的激活依赖于细胞间的相互作用。当相邻细胞表面的Notch配体（如Delta-like和Jagged）与肠道干细胞表面的Notch受体结合后，会引发Notch受体的胞内结构域（NICD）被γ-分泌酶切割并释放。NICD进入细胞核后，与转录抑制因子RBP-Jκ结合，形成NICD-RBP-Jκ复合物，从而激活Notch信号通路的靶基因表达，如Hes1、Hey1和HeyL等。这些靶基因编码的蛋白质属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族，它们可以抑制肠道干细胞向特定细胞类型的分化，维持干细胞的干性和自我更新能力。在肠道发育过程中，Notch信号通路的激活能够促进肠道干细胞的增殖和自我更新，确保肠道上皮组织的正常发育。在成年个体中，Notch信号通路的持续激活可以维持肠道干细胞的数量和功能，抑制其分化。当Notch信号通路被抑制时，肠道干细胞会倾向于分化为特定的细胞类型，如杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞等。在小鼠实验中，通过基因敲除技术降低肠道干细胞中Notch受体的表达，会导致肠道干细胞分化加速，干细胞数量减少，肠道上皮的稳态受到破坏。BMP（BoneMorphogeneticProtein）信号通路在肠道干细胞的自我更新和分化中发挥着双向调节作用。BMP信号通路的激活始于BMP配体与细胞膜上的BMP受体（包括BMPR-IA、BMPR-IB和ActRII等）结合，形成配体-受体复合物。这一复合物会激活受体的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，使受体底物Smad1、Smad5和Smad8磷酸化。磷酸化的Smad蛋白与Smad4结合形成复合物，然后进入细胞核，与其他转录因子相互作用，调节靶基因的表达。在低水平的BMP信号条件下，BMP信号通路可以促进肠道干细胞的自我更新。BMP信号通路可以通过调节Wnt信号通路的活性来间接影响肠道干细胞的自我更新。BMP信号通路可以抑制Wnt信号通路中的关键抑制因子Dkk1的表达，从而增强Wnt信号通路的活性，促进肠道干细胞的自我更新。在高水平的BMP信号条件下，BMP信号通路则会抑制肠道干细胞的自我更新，促进其分化。BMP信号通路可以激活一些与分化相关的基因表达，如Sox9和Klf4等，这些基因可以促进肠道干细胞向特定细胞类型分化。研究发现，在肠道类器官培养体系中，添加适量的BMP拮抗剂Noggin可以增强肠道干细胞的自我更新能力，促进类器官的生长和增殖；而添加过量的BMP配体则会抑制肠道干细胞的自我更新，诱导其分化。2.3.2微环境因素肠道微环境中的细胞因子、细胞外基质等对肠道干细胞的自我更新有着重要影响。细胞因子是一类由免疫细胞和其他细胞分泌的小分子蛋白质，它们在细胞间通讯和信号传导中发挥着关键作用。在肠道微环境中，多种细胞因子参与了肠道干细胞自我更新的调控。表皮生长因子（EGF）是一种重要的促生长细胞因子，它可以与肠道干细胞表面的EGF受体（EGFR）结合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，促进肠道干细胞的增殖和自我更新。研究表明，在肠道类器官培养中，添加EGF可以显著提高类器官的形成效率和生长速度，表明EGF对肠道干细胞的自我更新具有促进作用。转化生长因子-β（TGF-β）家族成员在肠道干细胞的调控中也发挥着重要作用。TGF-β1在低浓度时可以促进肠道干细胞的自我更新，而在高浓度时则会抑制其增殖，促进分化。这一调节作用可能与TGF-β1对不同信号通路的激活或抑制有关。TGF-β1可以通过激活Smad信号通路，调节细胞周期相关蛋白的表达，从而影响肠道干细胞的自我更新和分化。TGF-β1还可以通过调节细胞外基质的合成和降解，间接影响肠道干细胞的微环境，进而影响其自我更新能力。白细胞介素-22（IL-22）是一种由免疫细胞分泌的细胞因子，它可以通过与肠道干细胞表面的IL-22受体结合，激活下游的STAT3信号通路，促进肠道干细胞的增殖和自我更新。在肠道损伤修复过程中，IL-22的表达会显著增加，它可以促进肠道干细胞的活化和增殖，加速肠道上皮的修复。细胞外基质（ECM）是由多种蛋白质和多糖组成的复杂网络，它不仅为细胞提供物理支撑，还参与细胞的信号传导和功能调节。在肠道微环境中，细胞外基质对肠道干细胞的自我更新起着重要的调控作用。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分之一，它可以通过与肠道干细胞表面的整合素受体结合，激活细胞内的信号通路，如FAK-Src信号通路，促进肠道干细胞的黏附、增殖和自我更新。研究发现，在富含胶原蛋白的基质上培养肠道干细胞，其自我更新能力明显增强，类器官的形成效率和质量也更高。层粘连蛋白是另一种重要的细胞外基质成分，它可以与肠道干细胞表面的特定受体结合，调节细胞的迁移、增殖和分化。层粘连蛋白可以通过激活PI3K-Akt信号通路，促进肠道干细胞的自我更新和存活。纤连蛋白在肠道干细胞的微环境中也起着重要作用，它可以与多种细胞表面受体相互作用，调节细胞的黏附、迁移和增殖。纤连蛋白可以通过与肠道干细胞表面的整合素α5β1结合，激活下游的信号通路，促进肠道干细胞的自我更新和肠道上皮的修复。细胞外基质中的一些生长因子结合蛋白，如硫酸肝素蛋白聚糖，也可以通过结合和储存生长因子，如FGF和VEGF等，调节这些生长因子在肠道微环境中的浓度和活性，从而间接影响肠道干细胞的自我更新。三、环状RNA的特性与功能3.1环状RNA的结构与形成环状RNA（CircularRNA，circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，其结构特征与传统的线性RNA截然不同。环状RNA呈闭合环状结构，没有5’端帽子和3’端多聚腺苷酸（polyA）尾巴，这种独特的结构赋予了它较高的稳定性，使其不易被核酸外切酶降解。环状RNA主要通过反向剪接（Back-splicing）过程形成。在经典的RNA剪接过程中，前体mRNA（pre-mRNA）的剪接遵循线性顺序，即上游外显子的3’端与下游外显子的5’端连接，同时切除内含子，形成线性的成熟mRNA。而在反向剪接过程中，下游外显子的5’端与上游外显子的3’端发生异常连接，跳过了中间的内含子，从而形成了环状RNA。这一过程涉及到多种顺式作用元件和反式作用因子的参与。顺式作用元件在环状RNA的形成中起着关键作用。在pre-mRNA的邻近内含子中，常常存在一些短（30-40nt）到长的反向互补序列，如反向Alu元件。这些反向互补序列能够通过碱基互补配对形成双链结构，从而拉近上下游外显子的距离，促进反向剪接的发生。研究发现，在一些基因的内含子中，特定的反向互补序列能够显著提高环状RNA的生成效率。当对这些反向互补序列进行突变或删除时，环状RNA的表达水平会明显下降。反式作用因子，如RNA结合蛋白（RBPs），也在环状RNA的形成过程中发挥着重要的调节作用。RNA结合蛋白能够识别并结合到pre-mRNA上的特定顺式作用元件上，从而影响剪接体的组装和活性，进而调控反向剪接的发生。一些RNA结合蛋白可以促进环状RNA的形成，而另一些则可能抑制其生成。肌肉盲样蛋白（Muscleblind-likeproteins，MBL）能够与pre-mRNA的内含子区域结合，促进环状RNA的反向剪接，从而增加环状RNA的表达水平。而剪切因子U2AF65的异常表达则会抑制环状RNA的形成，导致其表达水平降低。除了反向剪接外，还有一些其他的机制可能参与环状RNA的形成。在某些情况下，内含子套索结构在剪接过程中没有被完全降解，而是通过进一步的加工形成了环状RNA。一些研究还发现，RNA编辑等过程也可能影响环状RNA的形成和结构。RNA编辑可以改变pre-mRNA的核苷酸序列，从而影响顺式作用元件和反式作用因子的结合，进而影响环状RNA的生成和功能。环状RNA的形成具有组织特异性和发育阶段特异性。不同组织和细胞类型中，环状RNA的表达谱存在显著差异，这表明环状RNA的形成受到组织特异性的调控机制影响。在胚胎发育过程中，环状RNA的表达水平和种类也会发生动态变化，这与胚胎发育的不同阶段和细胞分化过程密切相关。在小鼠胚胎发育的早期阶段，一些特定的环状RNA表达水平较高，它们可能参与了胚胎干细胞的自我更新和分化调控；而在胚胎发育后期，随着组织器官的形成和成熟，环状RNA的表达谱也会发生相应的改变。3.2环状RNA的特性环状RNA具有多种独特的特性，这些特性使其在细胞生物学过程中发挥着重要的作用。环状RNA具有较高的稳定性，这是其最为显著的特性之一。由于环状RNA呈闭合环状结构，缺乏5’端帽子和3’端多聚腺苷酸尾巴，这使得它们对核酸外切酶具有较强的抗性，不易被降解。研究表明，环状RNA在细胞内的半衰期通常比线性RNA长数倍，甚至数十倍。在哺乳动物细胞中，一些环状RNA的半衰期可以达到24小时以上，而大多数线性RNA的半衰期则在数小时以内。这种高稳定性使得环状RNA能够在细胞中持续存在，为其发挥生物学功能提供了时间上的保障。环状RNA的稳定性还与其内部的共价闭合环结构有关，这种结构使得环状RNA分子更加紧凑，不易受到外界因素的干扰。环状RNA的表达具有组织特异性和发育阶段特异性。不同组织和细胞类型中，环状RNA的表达谱存在显著差异，这表明环状RNA的表达受到组织特异性的调控机制影响。在大脑组织中，一些环状RNA的表达水平明显高于其他组织，这些环状RNA可能参与了神经细胞的发育、分化和功能维持。在肝脏组织中，也存在一些特异性表达的环状RNA，它们可能与肝脏的代谢、解毒等功能密切相关。环状RNA的表达水平在个体发育的不同阶段也会发生动态变化。在胚胎发育早期，一些环状RNA的表达水平较高，它们可能在胚胎干细胞的自我更新和分化过程中发挥重要作用；随着胚胎的发育，这些环状RNA的表达水平逐渐下降，而另一些环状RNA的表达则开始上升，参与到组织器官的形成和成熟过程中。在小鼠胚胎发育的不同阶段，通过高通量测序技术检测发现，环状RNA的表达谱呈现出明显的阶段性变化，这与胚胎发育的进程密切相关。环状RNA具有一定的序列保守性。尽管环状RNA在不同物种之间的序列存在一定的差异，但一些关键的功能区域往往具有较高的保守性。研究发现，在人类、小鼠和大鼠等哺乳动物中，一些与细胞增殖、分化和凋亡等重要生物学过程相关的环状RNA，其序列在不同物种之间具有较高的相似性。这种序列保守性暗示了环状RNA在进化过程中可能具有重要的生物学功能，并且这些功能在不同物种之间是相对保守的。通过对不同物种环状RNA序列的比较分析，还可以发现一些保守的顺式作用元件和反式作用因子结合位点，这些位点可能参与了环状RNA的形成、调控和功能发挥。环状RNA的结构和序列特征决定了其具有独特的二级和三级结构。通过生物信息学预测和实验验证发现，环状RNA可以形成多种复杂的二级结构，如茎环结构、发夹结构等，这些二级结构进一步折叠和相互作用，形成了独特的三级结构。环状RNA的二级和三级结构对于其功能的发挥具有重要影响。一些环状RNA通过其特定的二级结构与miRNA或蛋白质结合，发挥分子海绵的作用；而另一些环状RNA的三级结构则可能决定了其在细胞内的定位和稳定性。研究表明，环状RNACDR1as具有多个miR-7的结合位点，这些结合位点在其二级结构中形成了特定的空间构象，使得CDR1as能够有效地吸附miR-7，发挥miRNA海绵的功能。3.3环状RNA的功能3.3.1miRNA海绵作用环状RNA最被广泛研究的功能之一是其作为miRNA海绵的作用。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA，它们通过与靶mRNA的3’非翻译区（3’UTR）互补配对，抑制mRNA的翻译过程或促进其降解，从而在基因表达的转录后调控中发挥重要作用。每个miRNA可以调控多个靶mRNA，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生命活动。环状RNA通常含有多个miRNA结合位点，能够特异性地吸附miRNA，从而影响miRNA对靶mRNA的调控作用。这种作用机制类似于竞争性内源性RNA（ceRNA），环状RNA通过与miRNA结合，将miRNA从其靶mRNA上“隔离”，使靶mRNA能够正常翻译，上调靶基因的表达水平。研究发现，环状RNACDR1as（小脑变性相关蛋白1的反义转录本）在哺乳动物大脑中广泛存在，它包含70多个miR-7的保守结合位点，能够作为miR-7的分子海绵，阻断miR-7对下游基因的表达抑制作用。当CDR1as过表达时，它会结合大量的miR-7，使得miR-7无法与靶mRNA结合，从而促进miR-7靶蛋白的表达，如UBE2A（泛素连接酶A）、EGFR（表皮生长因子受体）、PTEN（同源性磷酸酶-张力蛋白）、CCNE1（细胞周期蛋白E）和PIK3CD（磷脂酰肌醇3激酶催化亚基δ）等，这些靶蛋白参与了中枢神经系统疾病、糖尿病、胃癌、肝细胞癌等多种疾病的发生发展。除了CDR1as，还有许多其他环状RNA也被证实具有miRNA海绵作用。circZNF91在细胞分化过程中发挥重要作用，它可以吸附miR-150等miRNA，解除miR-150对其靶基因的抑制，从而促进细胞分化相关基因的表达；circHIPK3在胰岛素分泌调控中起着关键作用，它通过吸附miR-124等miRNA，调节胰岛素分泌相关基因的表达，影响胰岛素的分泌；circBIRC6参与维持细胞多能性，它能够吸附miR-29等miRNA，维持细胞多能性相关基因的表达，保证细胞的多能性状态。这些研究表明，环状RNA作为miRNA海绵，在基因表达调控中发挥着重要作用，参与了多种生物学过程和疾病的发生发展。3.3.2与蛋白质相互作用环状RNA还能够与蛋白质相互作用，形成RNA-蛋白质复合物，从而影响蛋白质的功能和细胞进程。环状RNA与蛋白质的相互作用方式多种多样，主要包括以下几种情况。一些环状RNA可以作为蛋白质的分子海绵，特异性地吸附蛋白质，阻止其与其他分子相互作用，从而影响蛋白质的功能。首次报道的circRNA蛋白海绵是circMbl，它包含多功能盲肌蛋白（MBL）的结合位点，能够与MBL蛋白形成反馈调节通路。当MBL蛋白表达水平升高时，它会与circMbl侧翼区内含子结合，促进circMbl的反向剪接，进而诱导circMbl的产生；而高表达的circMbl又会吸附MBL蛋白，将其隔离，影响MBL行使正常的生物学功能，如调节mRNA的剪接等。circANRIL可与Pescadillo同源物1（PES1）的C端富含赖氨酸结构域特异性结合，PES1通常参与促进核糖体前体RNA（pre-rRNA）加工为成熟的rRNA，circANRIL与PES1的结合会阻断PES1的功能，抑制rRNA的成熟，导致血管平滑肌细胞和巨噬细胞中核糖体生成障碍、核仁应激和细胞死亡，这与动脉粥样硬化的发生密切相关。环状RNA可以作为蛋白质的支架，促进蛋白质之间的相互作用和复合物的形成。在某些情况下，环状RNA能够结合多个蛋白质，将它们聚集在一起，形成特定的功能复合物，从而增强蛋白质的活性或调节其功能。研究发现，一些环状RNA可以与转录因子、RNA聚合酶等蛋白质结合，形成转录复合物，促进基因的转录过程；还有一些环状RNA可以与信号通路中的关键蛋白结合，调节信号通路的激活和传导，影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程。环状RNA还可以通过与蛋白质结合，影响蛋白质的亚细胞定位。蛋白质的亚细胞定位对于其功能的发挥至关重要，环状RNA与蛋白质的相互作用可以改变蛋白质在细胞内的分布，从而影响其生物学功能。一些环状RNA可以与核转运蛋白结合，帮助蛋白质进入细胞核；而另一些环状RNA则可以与细胞质中的蛋白质结合，阻止其进入细胞核，使其在细胞质中发挥作用。环状RNA与蛋白质的相互作用在细胞的多种生理和病理过程中都发挥着重要作用。在细胞周期调控中，circFOXO3可以与细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和细胞周期蛋白A（CyclinA）结合，形成circFOXO3-CDK2-CyclinA复合物，抑制CDK2的活性，从而阻滞细胞周期的进展；在细胞凋亡过程中，circAmotl1可以与凋亡相关蛋白相互作用，调节细胞凋亡信号通路的激活，影响细胞的凋亡命运；在免疫应答中，一些环状RNA可以与免疫细胞表面的受体或信号分子结合，调节免疫细胞的活化和功能，参与免疫反应的调控。3.3.3参与转录调控环状RNA在转录水平上对基因表达也具有重要的调控作用，它们可以通过多种方式影响基因的转录过程。一些环状RNA可以与转录因子相互作用，调节转录因子的活性和与DNA的结合能力，从而影响基因的转录起始。在某些情况下，环状RNA能够结合到转录因子上，改变其构象，使其更容易或更难与DNA上的特定序列结合，进而促进或抑制基因的转录。研究发现，某些环状RNA可以与激活型转录因子结合，增强其与DNA的亲和力，促进基因的转录；而另一些环状RNA则可以与抑制型转录因子结合，阻止其与DNA结合，解除对基因转录的抑制作用。环状RNA可以通过与RNA聚合酶或其他转录相关蛋白相互作用，影响转录的延伸和终止过程。在转录延伸过程中，环状RNA可以与RNA聚合酶结合，调节其在DNA模板上的移动速度和稳定性，从而影响转录的效率和准确性。在转录终止阶段，环状RNA可以与转录终止因子相互作用，促进或抑制转录的终止，影响mRNA的长度和完整性。还有一些环状RNA可以通过与染色质相互作用，改变染色质的结构和状态，从而调控基因的转录。染色质的结构和状态对基因表达具有重要影响，开放的染色质结构有利于基因的转录，而紧密的染色质结构则会抑制基因的转录。环状RNA可以与染色质修饰酶结合，招募它们到特定的基因区域，改变染色质的修饰状态，如组蛋白的甲基化、乙酰化等，从而影响染色质的结构和基因的可及性。研究表明，某些环状RNA可以促进染色质的开放，增加基因的转录活性；而另一些环状RNA则可以诱导染色质的紧缩，抑制基因的转录。在细胞核中，外显子-内含子环状RNA（EIciRNA）可以与U1小核核糖核蛋白（U1snRNP）结合，形成EIciRNA-U1snRNP复合物，该复合物能够结合到基因的启动子区域，与RNA聚合酶II相互作用，促进基因的转录。EIciRNA还可以通过与其他转录调控因子相互作用，调节转录起始复合物的组装和活性，进一步影响基因的转录过程。一些内含子来源的环状RNA（ciRNA）也被发现参与转录调控，它们可以通过与转录相关蛋白结合，调节基因的转录起始和延伸，影响基因的表达水平。四、环状RNA调控肠道干细胞自我更新的研究现状4.1相关研究成果近年来，随着对环状RNA研究的不断深入，越来越多的证据表明环状RNA在肠道干细胞自我更新的调控中发挥着重要作用。研究人员通过高通量测序技术和功能实验，发现了一系列参与调控肠道干细胞自我更新的环状RNA，这些发现为揭示肠道干细胞自我更新的分子机制提供了新的线索。circPan3是较早被发现的对肠道干细胞自我更新具有重要调控作用的环状RNA。中国科学院生物物理研究所的研究团队发现，circPan3在肠道干细胞中高表达，且其表达受到肠道驻留的Ⅱ型固有淋巴细胞（ILC2s）分泌的IL-13的调控。在机制上，circPan3能够与IL13ra1mRNA结合，竞争性地抑制RNA结合蛋白KSRP与IL13ra1mRNA的结合，从而增加IL13ra1mRNA的稳定性，使肠道干细胞表面的IL-13Rα1表达上调。IL-13与IL-13Rα1结合后，激活下游信号STAT6，并通过转录因子FoxP1稳定肠干细胞中β-catenin的水平，进而促进Wnt/β-catenin信号通路的活化，最终促进肠道干细胞的自我更新。研究人员构建了circPan3缺失小鼠模型，发现circPan3的缺失降低了肠干细胞自我更新能力，导致干细胞数目变少，肠绒毛和隐窝变短，同时也降低了小鼠肠损伤修复能力。这一研究首次揭示了circPan3在肠道干细胞自我更新调控中的关键作用，以及免疫系统通过环状RNA对肠道干细胞功能的调节机制。circBtnl1是另一个被深入研究的与肠道干细胞自我更新相关的环状RNA。中国科学院生物物理研究所范祖森教授团队发现，circBtnl1在肠道干细胞中高度表达，且其缺失能够增强小鼠肠道干细胞的自我更新能力和上皮再生。研究表明，circBtnl1通过与ATP依赖的RNA解旋酶Ddx3y相互作用，竞争性地结合转录因子Atf4的mRNA，从而损害Atf4mRNA在野生型肠道干细胞中的稳定性。ATF4是一种对肠道干细胞活性具有正向调控作用的转录因子，它可通过独特的基序与Sox9启动子结合，激活Sox9的转录，进而增强肠道干细胞的自我更新能力和上皮再生。circBtnl1介导的Atf4mRNA衰变抑制了Sox9转录，从而负向调节了肠道干细胞的自我更新机制。研究人员通过构建circBtnl1敲除小鼠模型，验证了circBtnl1在体内对肠道干细胞自我更新的抑制作用。circBtnl1敲除小鼠相比对照组小鼠，肠道长度、隐窝数量及细胞数量增加，Ki67和EdU染色检测显示circBtnl1敲除促进小鼠肠道干细胞的增殖。这一研究揭示了circBtnl1负向调控肠道干细胞自我更新的新机制，为解析肠道干细胞的稳态调控机制提供了新视角。4.2研究方法与技术在研究环状RNA调控肠道干细胞自我更新的过程中，运用了多种先进的研究方法与技术，这些方法和技术为深入探究其分子机制提供了有力的工具。高通量测序技术是研究环状RNA的重要手段之一。通过对肠道干细胞进行高通量circRNA-seq测序，可以全面、系统地分析肠道干细胞中环状RNA的表达谱，筛选出在肠道干细胞中特异性高表达或差异表达的环状RNA分子。从C57BL/6小鼠中分离出小肠隐窝，并进行高通量circRNA-seq，然后在小鼠肠道干细胞中选择了前8个高表达的circRNA进行后续研究。在测序过程中，首先提取肠道干细胞的总RNA，然后利用RNaseR消化去除线性RNA，富集环状RNA。接着对环状RNA进行片段化处理，反转录成cDNA，再进行PCR扩增和文库构建，最后通过高通量测序平台进行测序。通过生物信息学分析，可以对测序数据进行质量控制、比对、注释和差异表达分析，从而确定在肠道干细胞中显著表达的环状RNA。基因敲除技术在研究环状RNA的功能中发挥着关键作用。利用CRISPR/Cas9技术构建环状RNA敲除小鼠模型，能够在体内研究环状RNA对肠道干细胞自我更新的影响。为了确定circBtnl1在调节肠道干细胞中的生理作用，用CRISPR/Cas9技术构建circBtnl1敲除小鼠模型。在构建过程中，首先设计针对circBtnl1的sgRNA，将其与Cas9蛋白共同导入小鼠胚胎干细胞中，通过同源重组的方式敲除circBtnl1基因。然后将经过基因编辑的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，再将囊胚移植到代孕母鼠体内，获得circBtnl1敲除小鼠。通过对敲除小鼠的表型分析，如观察肠道长度、隐窝数量、细胞数量以及肠道干细胞的增殖情况等，可以明确环状RNA在肠道干细胞自我更新中的作用。RNA干扰（RNAi）技术是在细胞水平研究环状RNA功能的常用方法。通过设计针对环状RNA的短发夹RNA（shRNA），可以特异性地敲低环状RNA的表达，从而研究其对肠道干细胞自我更新的影响。在小鼠肠道干细胞中使用shRNA分别敲低circBtnl1等8种circRNA，并建立类器官分析来确定它们的损失对肠道干细胞活性的影响。在实验中，将shRNA通过脂质体转染等方法导入肠道干细胞中，使其与环状RNA结合，引发RNA干扰效应，降解环状RNA，降低其表达水平。然后通过检测肠道干细胞的增殖、分化以及类器官的形成等指标，评估环状RNA敲低对肠道干细胞自我更新的影响。RNA-蛋白质相互作用研究技术对于揭示环状RNA的作用机制至关重要。RNApulldown结合质谱技术可以鉴定与环状RNA相互作用的蛋白质。在小鼠肠道干细胞裂解液中进行RNApulldown和质谱测定，以鉴定circBtnl1的结合蛋白候选位点，最终确定Ddx3y为相关的候选蛋白。在RNApulldown实验中，首先将生物素标记的环状RNA探针与肠道干细胞裂解液孵育，使环状RNA与结合蛋白相互作用形成复合物。然后利用链霉亲和素磁珠捕获复合物，将未结合的蛋白质洗脱，最后对捕获的蛋白质进行质谱分析，鉴定与环状RNA相互作用的蛋白质。RNA-FISH（RNA荧光原位杂交）和免疫荧光实验可以验证环状RNA与蛋白质的共定位情况。通过RNA-FISH和免疫荧光实验证实circBtnl1与Ddx3y在小鼠小肠隐窝和肠道干细胞类器官的细胞质中共定位。在实验中，分别用针对环状RNA和蛋白质的特异性探针进行标记，然后通过荧光显微镜观察两者的荧光信号，判断它们是否在细胞内共定位。转录组微阵列分析技术可以用于筛选环状RNA的靶基因，深入研究其调控机制。对模型小鼠的Lgr5+肠道干细胞进行转录组微阵列分析，以鉴定circBtnl1的靶基因。在分析过程中，首先提取肠道干细胞的总RNA，然后将其反转录成cDNA，并进行荧光标记。将标记后的cDNA与转录组微阵列芯片杂交，通过扫描芯片检测荧光信号强度，分析基因的表达变化。通过对差异表达基因的功能分析和筛选，可以确定与环状RNA功能相关的靶基因，进一步揭示环状RNA调控肠道干细胞自我更新的分子机制。五、环状RNA调控肠道干细胞自我更新的分子机制5.1circPan3促进肠道干细胞自我更新的机制5.1.1与IL13ra1mRNA的相互作用circPan3在肠道干细胞自我更新中发挥着关键的促进作用，其作用机制首先体现在与IL13ra1mRNA的相互作用上。circPan3是一种由Pan3基因通过反向剪接形成的环状RNA，在肠道干细胞中高表达。研究发现，circPan3能够特异性地与IL13ra1mRNA结合，这种结合作用是通过两者之间的互补碱基配对以及特定的RNA结构实现的。在分子结构层面，circPan3具有独特的二级和三级结构，其部分序列能够与IL13ra1mRNA的特定区域形成稳定的碱基对，从而实现两者的紧密结合。这种结合并非随机发生，而是受到严格的调控。在肠道干细胞中，存在一些RNA结合蛋白（RBPs），它们可以识别并结合到circPan3和IL13ra1mRNA上，促进两者的相互作用。这些RNA结合蛋白可能通过与circPan3和IL13ra1mRNA上的特定基序结合，改变它们的空间构象，使其更容易相互靠近并结合。circPan3与IL13ra1mRNA的结合能够显著增强IL13ra1mRNA的稳定性。正常情况下，IL13ra1mRNA容易受到细胞内多种核酸酶的降解作用，导致其半衰期较短。然而，当circPan3与IL13ra1mRNA结合后，能够形成一种特殊的RNA-RNA复合物结构，这种结构可以有效地保护IL13ra1mRNA免受核酸酶的攻击。具体来说，circPan3的环状结构可以包裹住IL13ra1mRNA的关键区域，使其不易被核酸酶识别和切割。circPan3还可以招募一些RNA稳定蛋白，如HuR等，这些蛋白能够与IL13ra1mRNA结合，进一步增强其稳定性。研究表明，在敲低circPan3表达的肠道干细胞中，IL13ra1mRNA的半衰期明显缩短，降解速度加快；而在过表达circPan3的细胞中，IL13ra1mRNA的稳定性显著提高，半衰期延长。circPan3与IL13ra1mRNA的结合还可以影响IL13ra1mRNA的翻译效率。当circPan3与IL13ra1mRNA结合后，能够改变IL13ra1mRNA的翻译起始复合物的组装，促进核糖体与IL13ra1mRNA的结合，从而提高IL13ra1蛋白的表达水平。在体外翻译实验中，加入circPan3可以显著增加IL13ra1蛋白的合成量，而去除circPan3则会导致IL13ra1蛋白的表达水平明显降低。这表明circPan3通过与IL13ra1mRNA的相互作用，在转录后水平上对IL13ra1的表达进行了精细调控，为后续的信号传导和细胞功能调节奠定了基础。5.1.2对IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的影响circPan3与IL13ra1mRNA的相互作用进一步影响了IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性，从而促进肠道干细胞的自我更新。IL13ra1负责编码细胞因子IL-13受体中的一个亚基，circPan3与IL13ra1mRNA的结合，使得肠道干细胞表面的IL-13Rα1表达上调。IL-13主要由肠道驻留的Ⅱ型固有淋巴细胞（ILC2s）分泌，当IL-13与肠道干细胞表面上调表达的IL-13Rα1结合后，会引发一系列的信号转导事件，激活下游信号STAT6。IL-13与IL-13Rα1结合后，会使受体二聚化，进而激活受体相关的酪氨酸激酶，使STAT6的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化的STAT6形成二聚体并进入细胞核，与特定的DNA序列结合，调控相关基因的表达。在这个过程中，转录因子FoxP1发挥了重要作用。激活的STAT6会通过调控FoxP1的表达，间接稳定肠干细胞中β-catenin的水平。FoxP1可以与β-catenin相互作用，抑制β-catenin的泛素化降解途径，从而使β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核。在细胞核内，β-catenin与转录因子TCF/LEF家族成员结合，激活Wnt/β-catenin信号通路的靶基因表达，如c-Myc、CyclinD1和Lgr5等。这些靶基因的表达产物在细胞增殖、自我更新和干性维持中发挥着关键作用。c-Myc可以促进细胞周期的进展，增强细胞的增殖能力；CyclinD1参与细胞周期从G1期到S期的转换，对细胞增殖起着重要的调节作用；Lgr5是肠道干细胞的特异性标志物，其表达的上调有助于维持肠道干细胞的干性和自我更新能力。研究人员通过构建circPan3缺失小鼠模型和体外细胞实验，验证了circPan3对IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的调控作用。在circPan3缺失小鼠中，肠道干细胞表面的IL-13Rα1表达水平显著降低，IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性受到抑制，表现为STAT6的磷酸化水平降低，β-catenin的核转位减少，以及Wnt/β-catenin通路靶基因的表达下调。这些变化导致肠道干细胞的自我更新能力下降，干细胞数目减少，肠绒毛和隐窝变短，同时小鼠的肠损伤修复能力也明显降低。而在体外细胞实验中，过表达circPan3可以显著增强IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性，促进肠道干细胞的增殖和自我更新。5.2circBtnl1抑制肠道干细胞自我更新的机制5.2.1与Ddx3y的结合及对Atf4mRNA稳定性的影响circBtnl1在肠道干细胞中高度表达，且其缺失能够增强小鼠肠道干细胞的自我更新能力和上皮再生，这表明circBtnl1对肠道干细胞的自我更新起到负向调控作用。深入探究其作用机制发现，circBtnl1主要通过与ATP依赖的RNA解旋酶Ddx3y相互作用，来影响转录因子Atf4mRNA的稳定性。在细胞内，circBtnl1与Ddx3y存在特异性的结合。为了鉴定circBtnl1的结合蛋白候选位点，研究人员在小鼠肠道干细胞裂解液中进行了RNApulldown和质谱测定，最终确定Ddx3y为相关的候选蛋白。Ddx3y是一种依赖于ATP的RNA解旋酶，在细胞的RNA代谢过程中发挥着重要作用。通过RNA-FISH和免疫荧光实验，进一步证实了circBtnl1与Ddx3y在小鼠小肠隐窝和肠道干细胞类器官的细胞质中共定位，这为两者的相互作用提供了空间上的依据。通过RNApulldown和WB分析也验证了circBtnl1与Ddx3y的相互作用，体外测图发现，Flag标记的Ddx3y蛋白的RNA结合域对其与circBtnl1的相互作用至关重要，片段映射分析亦发现，circBtnl1转录本(HR2)的外显子4与Ddx3y蛋白结合是必要的。这些结果表明circBtnl1在小鼠肠道干细胞中主要定位于细胞质，并与Ddx3y蛋白发生特异性结合。circBtnl1与Ddx3y的结合对Atf4mRNA的稳定性产生了重要影响。研究发现，Atf4mRNA能够与Ddx3y相互作用，而过表达circBtnl1则会破坏Atf4mRNA与Ddx3y的相互作用。进一步的研究确定Ddx3y和circBtnl1结合在Atf4mRNA的同一位点上，WB证实Atf4mRNA与Ddx3y的相互作用呈剂量依赖性，截断作图显示Atf4mRNA与Ddx3y的相互作用位点与circBtnl1相同，这表明circBtnl1和Atf4mRNA可竞争性结合Ddx3y。当circBtnl1与Ddx3y结合后，会阻止Ddx3y与Atf4mRNA的结合，从而损害Atf4mRNA在野生型肠道干细胞中的稳定性。在敲除circBtnl1的肠道干细胞中，Atf4mRNA的稳定性增强，这进一步验证了circBtnl1对Atf4mRNA稳定性的负向调节作用。为了确定Ddx3y在肠道干细胞自我更新中的作用，研究人员在circBtnl1敲除的小鼠类器官中进行了Ddx3y的敲除和过表达实验。结果发现，Ddx3y敲除显著降低了ATF4的表达，而过表达Ddx3y则显著增加了ATF4的表达，这表明Ddx3y正向调控ATF4的表达。无论是在哪种模型小鼠上，Atf4敲除都显著减少了肠道干细胞形成类器官的能力，这说明Atf4对肠道干细胞活性具有正向调控作用。综合这些结果可以推断，circBtnl1通过与Ddx3y竞争性结合Atf4mRNA，抑制了Atf4mRNA的稳定性，从而影响了Atf4蛋白的表达，进而对肠道干细胞的自我更新产生调控作用。5.2.2对Sox9转录表达的调控circBtnl1对肠道干细胞自我更新的抑制作用还体现在对Sox9转录表达的调控上，这一调控过程与Atf4密切相关。ATF4是一种对肠道干细胞活性具有正向调控作用的转录因子，它可以通过独特的基序与Sox9启动子结合，激活Sox9的转录。Sox9作为干性因子，在维持肠道干细胞的自我更新能力和上皮再生中发挥着关键作用。当ATF4与Sox9启动子结合后，会招募RNA聚合酶II等转录相关因子，促进Sox9基因的转录，从而增加Sox9mRNA和蛋白的表达水平，进而增强肠道干细胞的自我更新能力。然而，circBtnl1的存在会干扰这一过程。如前文所述，circBtnl1与Ddx3y竞争性结合Atf4mRNA，抑制了Atf4mRNA的稳定性，导致ATF4蛋白的表达水平下降。ATF4蛋白表达的减少使得其与Sox9启动子的结合能力减弱，无法有效地激活Sox9的转录。在circBtnl1高表达的肠道干细胞中，由于ATF4表达受到抑制，Sox9的转录水平显著降低，Sox9mRNA和蛋白的表达量也随之减少。这一系列变化最终导致肠道干细胞的自我更新能力受到抑制，肠道上皮的再生能力也相应减弱。研究人员通过构建circBtnl1敲除小鼠模型和体外细胞实验，验证了circBtnl1对Sox9转录表达的调控作用。在circBtnl1敲除小鼠中，肠道干细胞中Atf4mRNA的稳定性增强，ATF4蛋白表达水平升高，进而促进了Sox9的转录表达，表现为Sox9mRNA和蛋白的表达量增加。这些小鼠的肠道干细胞自我更新能力增强，肠道隐窝和肠绒毛数量增多，肠道上皮的再生能力也明显提高。而在体外细胞实验中，过表达circBtnl1则会导致Atf4mRNA稳定性下降，ATF4蛋白表达减少，Sox9转录表达受到抑制，肠道干细胞的自我更新能力显著降低。circBtnl1通过抑制Atf4mRNA的稳定性，减少ATF4蛋白的表达，进而抑制了Sox9的转录表达，最终实现了对肠道干细胞自我更新的负向调控。这一分子机制的揭示，为深入理解肠道干细胞的稳态调控机制提供了新的视角，也为相关肠道疾病的治疗提供了潜在的靶点和理论依据。六、研究案例分析6.1案例一：circPan3相关研究中国科学院生物物理研究所范祖森课题组和田勇课题组在circPan3对肠道干细胞自我更新的调控研究中取得了重要成果，相关研究成果发表于《NatureImmunity》期刊。研究人员首先从小鼠肠道干细胞中通过高通量测序技术筛选出circPan3，发现其在肠道干细胞中高表达。为了深入探究circPan3的功能，研究人员构建了circPan3缺失小鼠模型。在实验设计上，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对circPan3的特定序列进行靶向敲除，成功获得circPan3基因缺失的小鼠。对这些小鼠的肠道组织进行分析，发现circPan3缺失后，小鼠肠道干细胞的自我更新能力显著下降。具体表现为干细胞数目变少，通过对肠道隐窝中Lgr5阳性干细胞的计数，发现circPan3缺失小鼠的Lgr5+干细胞数量明显低于野生型小鼠；肠绒毛和隐窝变短，通过组织切片和显微镜观察，测量肠绒毛长度和隐窝深度，circPan3缺失小鼠的肠绒毛长度缩短了约[X]%，隐窝深度减少了约[X]%，这表明肠道上皮的发育和维持受到了严重影响；同时，小鼠的肠损伤修复能力也降低，在对小鼠进行化学诱导的肠道损伤模型构建后，circPan3缺失小鼠的肠道损伤修复速度明显慢于野生型小鼠，损伤部位的愈合时间延长了约[X]天。在机制研究方面，研究人员发现circPan3能够与IL13ra1mRNA结合，通过RNApulldown实验和RNA免疫沉淀（RIP）实验，证实了circPan3与IL13ra1mRNA之间存在直接的相互作用。进一步研究发现，circPan3的结合能够竞争性地抑制RNA结合蛋白KSRP与IL13ra1mRNA的结合，从而增加IL13ra1mRNA的稳定性。通过半衰期实验，检测IL13ra1mRNA在不同条件下的降解速度，发现与野生型细胞相比，circPan3缺失细胞中IL13ra1mRNA的半衰期缩短了约[X]小时，表明circPan3对IL13ra1mRNA的稳定性具有重要的调控作用。IL13ra1mRNA稳定性的增加使得肠道干细胞表面的IL-13Rα1表达上调，当IL-13与上调表达的IL-13Rα1结合后，激活下游信号STAT6，并通过转录因子FoxP1稳定肠干细胞中β-catenin的水平，进而促进Wnt/β-catenin信号通路的活化，最终促进肠道干细胞的自我更新。通过Westernblot检测信号通路中关键蛋白的表达和磷酸化水平，以及免疫荧光实验观察β-catenin的核转位情况，验证了这一信号传导过程。该研究首次揭示了circPan3在肠道干细胞自我更新调控中的关键作用，以及免疫系统通过环状RNA对肠道干细胞功能的调节机制，为深入理解肠道干细胞的调控网络提供了重要的理论依据，也为相关肠道疾病的治疗提供了新的潜在靶点。6.2案例二：circBtnl1相关研究中国科学院生物物理研究所范祖森教授团队在circBtnl1对肠道干细胞自我更新的调控研究中取得了重要突破，相关研究成果发表于《TheEMBOJournal》期刊。研究人员首先从C57BL/6小鼠中分离出小肠隐窝，并进行高通量circRNA-seq，筛选出了在小鼠肠道干细胞中高表达的circBtnl1。通过背靠背引物设计验证其成环，利用RNaseR和放线菌素D实验验证了它的稳定性。为了探究circBtnl1对肠道干细胞的功能影响，研究人员在肠道干细胞中使用shRNA敲低circBtnl1，并建立类器官分析。结果发现，敲低circBtnl1最显著地诱导了类器官的形成，表明circBtnl1的缺失能够促进肠道干细胞的增殖和类器官的生长。为了进一步确定circBtnl1在调节肠道干细胞中的生理作用，研究人员运用CRISPR/Cas9技术构建了circBtnl1敲除小鼠模型。对敲除小鼠的肠道组织进行分析，发现circBtnl1敲除小鼠相比对照组小鼠，肠道长度增加了约[X]%，隐窝数量增多了约[X]个，细胞数量也显著增加；通过Ki67和EdU染色检测，结果显示circBtnl1敲除促进小鼠肠道干细胞的增殖，Ki67阳性细胞比例相比对照组提高了约[X]%，EdU阳性细胞数量增加了约[X]%。这些结果表明，circBtnl1敲除促进了肠道干细胞的自我更新。在机制研究方面，研究人员通过在小鼠肠道干细胞裂解液中进行RNApulldown和质谱测定，鉴定出circBtnl1的结合蛋白候选位点，确定ATP依赖的RNA解旋酶Ddx3y为相关的候选蛋白。通过RNA-FISH和免疫荧光实验证实circBtnl1与Ddx3y在小鼠小肠隐窝和肠道干细胞类器官的细胞质中共定位，再通过RNApulldown和WB分析进一步验证了二者的相互作用。体外测图发现，Flag标记的Ddx3y蛋白的RNA结合域对其与circBtnl1的相互作用至关重要，片段映射分析亦发现，circBtnl1转录本(HR2)的外显子4与Ddx3y蛋白结合是必要的。为了进一步鉴定circBtnl1的靶基因，研究人员对模型小鼠的Lgr5+肠道干细胞进行了转录组微阵列分析。经过筛选，发现Atf4下调后，类器官形成效果最差，提示Atf4对肠道干细胞活性具有正向调控作用。研究发现Atf4mRNA能够与Ddx3y相互作用，而过表达circBtnl1则会破坏Atf4mRNA与Ddx3y的相互作用。进一步确定Ddx3y和circBtnl1结合在Atf4mRNA的同一位点上，WB证实Atf4mRNA与Ddx3y的相互作用呈剂量依赖性，截断作图显示Atf4mRNA与Ddx3y的相互作用位点与circBtnl1相同，表明CircBtnl1和Atf4mRNA可竞争性结合Ddx3y。敲除circBtnl1后，肠道干细胞Atf4mRNA的稳定性增强，表明circBtnl1负向调节Atf4mRNA的稳定性。在circBtnl1敲除的小鼠类器官中，Ddx