3.2基因工程的基本操作程序 课件高二下学期生物人教版选择性必修3

从社会中来1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。

你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？P77

转基因抗虫棉与普通棉花3.将目的基因导入受体细胞苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建4.目的基因的检测与鉴定第3章基因工程

第2节基因工程的基本操作程序

高二生物组1.利用PCR获取和扩增目的基因2.基因表达载体的构建过程本节主要解决的困惑原核细胞基因的结构示意图真核细胞基因的结构示意图原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续编码区非编码编码区：编码蛋白质的合成非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达包括：编码区上游编码区下游知识回顾1：基因的结构原核细胞基因的结构示意图真核细胞基因的结构示意图启动子：RNA聚合酶结合位点，

转录起始的信号终止子：终止RNA的合成外显子：内含子：能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列非编码序列=非编码区+内含子知识回顾1：基因的结构知识回顾1：基因的结构新合成的子链DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋酶游离的脱氧核苷酸解旋需要细胞提供能量需要解旋酶的作用结果：氢键断裂，双链打开合成子链知识回顾2：DNA的复制过程

真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图

知识回顾3：基因的表达1转录时，DNA链完全解开吗？整个DNA都转录？转录不是转录整个DNA，是转录其中要表达的基因，以基因的一条链为模板，2不同基因的模版链是否相同？不同基因模板链不同3.同种生物的不同细胞中，由于基因的选择性表达，mRNA的种类和数量一般是不相同的，但tRNA和rRNA的种类一般没有差异。边解旋边转录点拨提升1【思考1】：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？成熟mRNA相应酶去除内含子转录翻译真核基因：编码区（外显子+内含子）多肽链前体mRNA蛋白质加工一般不能产生原来的蛋白质①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）深度思考【思考2】:如果把真核基因导入原核细胞中表达，不考虑蛋白质加工的问题，如何产生与原来结构相同的蛋白质？去除内含子成熟mRNA转录真核基因：编码区（外显子+内含子）前体mRNA相应酶mRNA单链提取逆转录酶DNA单链DNA双链酶把真核基因的cDNA导入到原核细胞中表达。这种双链DNA是不含内含子的DNA，叫做cDNA深度思考1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或得预期表达产物等的基因，主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2.实例：与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）与毒物降解相关的基因与工业用酶相关的基因等3.目的基因获取方法：（一）从基因文库中获取；（二）通过DNA合成仪直接合成；（三）利用PCR技术扩增；目的基因的筛选与获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。2.基因文库类型：（未知序列）基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（cDNA文库）（包含一种生物的一部分基因）某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因（二）人工合成目的基因（已知序列）1.前提：2.方法：困惑点一：利用PCR获取和扩增目的基因PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。1.概念：DNA复制所需的基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶（体外用高温代替）打开DNA双链DNA两条母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链与两条母链结合的2种引物使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸2.方式：3.条件：以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2n作用（1）什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？

（2）PCR扩增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？（3）PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。不需要，只要知道目的基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。探究要求：思考以下问题，小组合作交流，派代表展示成果，时间3min。合作交流（1）设计一对与目的基因两侧的部分脱氧核苷酸序列互补配对的引物

（保证以DNA的两条链为模板进行扩增）：①为方便构建重组质粒，需在引物5’端添加适当的限制酶的识别序列/酶切位点；②为保证目的基因与载体正向连接，常在两种引物上设计不同的酶切位点；③为避免引物自身折叠，设计引物时需避免引物之内部形成碱基互补配对。④为避免引物自连，设计引物时需避免引物之间形成局部碱基互补配对。50℃引物1引物2DNA引物95℃4.利用PCR获取和扩增目的基因过程变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成_________b.复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，

形成局部________氢键单链DNA双链模板DNA引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶c.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的

。

DNA链5′3′5′3′退火温度低会造成非特异性条带比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成知识小结：PCR技术与细胞内DNA复制的比较第一次循环90℃以上，DNA双链解开50℃左右，引物与DNA结合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循环5’3’5’5’3’5’高温变性、低温复性中温延伸第二次循环3’5’高温变性、低温复性第三次循环3’5’中温延伸第三次循环3’5’（2）图形显示一轮循环产生的子链长度小于模板链的长度，到第三轮循环时，才开始出现2个两条脱氧核苷酸链等长的子代DNA。点拨提升1：PCR中的数量关系学以致用1B1.基因表达载体的组成a.目的基因b.启动子c.终止子d.标记基因（抗生素抗性基因）表达特定性状位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞e、复制原点：困惑点二：基因表达载体的构建（核心）探究要求：思考基因表达载体的组成的相关问题，小组合作交流，派代表展示成果，时间3min。合作交流DNA聚合酶结合位点2.基因表达载体的构建过程2.基因表达载体的构建过程（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出_________。（2）用_____________切断目的基因，使其产生_________________。（3）再加入适量___________，将切下的目的基因片段插入质粒的______处，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶切口DNA连接酶相同的黏性末端2.基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种【思考1】使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接11’22’122’1’22’1’1深度思考【思考2】如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切EcoRⅠEcoRⅠBglⅡ防止质粒重新环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化深度思考①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。

表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。②工具酶：限制酶、DNA连接酶两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。点拨提升2游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。点拨提升3:重组载体的筛选蓝色菌落舍掉，白色菌落有的是需要的菌落，有的并不是所需菌落，所以后续一般还需要PCR等方式确认。1.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列说法错误的是(

)A．图示对质粒和目的基因切割用到了两种限制酶B．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来C．构建基因表达载体时需要用到限制酶SmaⅠD．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构C学以致用22.方法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法（最多）花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞（Ca+处理）1.转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程稳定表达受体细胞第三步：将目的基因（重组质粒）导入受体细胞探究要求：思考有关转化的相关问题，小组合作交流，派代表展示成果，时间3min。合作交流Ca2+转化法（导入微生物）使用Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（感受态细胞）过程微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子操作程序：取受精卵显微注射胚胎移植为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。显微注射法（导入动物细胞）病毒介导法（主要用于导入动物细胞）

科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。花粉管通道法（我国独创）②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；适用生物：开花植物农杆菌转化法农杆菌细胞内含有的

Ti质粒上的

T-DNA可转移至受体细胞，并且将其整合到该受体细胞染色体DNA上两次拼接两次转化①转基因植物用

；②转基因动物用

(一般不能用体细胞)；

原因是：

。③微生物常用

等。微生物作为受体细胞的优点是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为

原因是

；⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是

。真核细胞分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工受精卵有发育的全能性无核，无器，不能合成蛋白质体细胞(叶、芽、根)或受精卵受精卵大肠杆菌、酵母菌繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作知识小结：受体细胞的选择点拨提升4或受精卵基因枪技术:又被称为生物弹道技术或微粒轰击技术,是用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的组织或者细胞中的一种技术。它是基因转移技术中的一种方法。其基本原理就是采用一种微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨(它们比重大,而且化学性质都很稳定)颗粒获得足够的动量打入靶细胞或组织。1.在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，叙述正确的是(

)A.导入植物细胞时均采用农杆菌转化法B.转基因动物的获得多数运用基因枪法C.大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理D.导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物C学以致用3思考按前面三个步骤进行了操作，1.是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？2.是否可以确定目的基因一定能够进行表达？3.是否可以确定得到了新的性状？不一定！如何判断？（分子探针与DNA杂交后显示出来）（分子探针与mRNA杂交后显示出来）第四步：目的基因的检测与鉴定（1）定义：（2）特点：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。（3）核酸杂交：可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。知识拓展：基因探针①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增DNA半保留复制原理：基本思路：1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增；2.提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；3.高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：第四步：目的基因的检测与鉴定②.检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术