酶联免疫吸附实验讲义全解

吕梁市兽医试验室培训酶联免疫吸附试验EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA吕梁市动物疫病防止控制中心刘裕田1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）简介1.1、基本概念：抗原、抗体、抗原抗体的特性1.2、ELISA措施简介：1.3、ELISA措施的原理1.4、ELISA措施的分类2、ELISA试剂的构成2.1、ELISA试剂盒的构成2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；

2.1.2、酶标识的抗原或抗体（酶标识物）；

2.1.3、酶的底物；

2.1.4、参照原则品（定量测定）；

2.1.5、酶标识物及样本的稀释液；

2.1.6、洗涤液；

2.1.7、酶反应终止液。3、ELISA试验过程3.1、试剂的准备

3.2、加样

3.3、保温

3.4、洗涤

3.5、显色和比色4、ELISA试验的质量控制4.1分析前质控

4.1.1人员培训

4.1.2仪器质控4.1.3标本采集及处理过程的质控4.2分析中质控2、ELISA试剂的构成2.1、ELISA试剂盒的构成2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；

2.1.2、酶标识的抗原或抗体（酶标识物）；

2.1.3、酶的底物；

2.1.4、参照原则品（定量测定）；

2.1.5、酶标识物及样本的稀释液；

2.1.6、洗涤液；

2.1.7、酶反应终止液。3、ELISA试验过程3.1、试剂的准备

3.2、加样

3.3、保温

3.4、洗涤

3.5、显色和比色4、ELISA试验的质量控制5、胶体金试纸5.1、免疫层析法简介及特点5.2、免疫层析法的构造及原理二、培训内容（操作部分）6、操作过程演示7、计算软件应用阐明1、酶联免疫吸附反应法（ELISA）1.1、基本概念：抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和对应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反应的等比例性1.2、ELISA措施简介ELISA属于标识免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简朴易行并可以定量，从而使其在食品安全和微生物检测中得到了广泛的应用。目前市场上有多种基于ELISA措施开发的用于病原微生物以及食品中抗生素检测的试剂盒产品。1.3、ELISA措施的原理基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体，在合适的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标识抗体或抗原（或先加入合适的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入对应的酶标识抗体或抗原），形成酶标识的抗原—抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标识物洗涤清除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件下，复合物上酶的量（也反应了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物展现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。1.4、ELISA措施的分类直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图2-17（a）间接性ELISA是将酶标识在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合状况，进而计算出抗原或抗体的量。间接性ELISA原理：显色夹心法是先将未标识的抗体包被在酶标板上，用于捕捉抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法同样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。包被鸡抗NP蛋白IgGIBV加IBV或被检加兔抗IBVIgG加羊抗兔IgG-HRP加底物显色加终止液双抗体夹心ELISA检测传染性支气管炎病毒（IBV）双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)

洗板待测抗体底物温育显色酶标抗原EE洗板YYYYYY固相抗原EYYYEEEYYYEEE液相阻断ELISA用于检抗体，得到的成果比间接ELISA可靠。其过程如下：抗原包被酶标板，加待检血清，后加酶标抗体，底物显色，终止。假如待检样阳性则与酶标板上包被的抗原结合，阻断酶标抗体与其反应。成果OD越高，为阴性，低为阳性试验中用原则阴性和阳性血清阻断率来判断试验精确度，得到的成果有很好的线形关2、ELISA试剂的构成2.1、完整的ELISA试剂盒应包括如下：

（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；

（2）酶标识的抗原或抗体（酶标识物）；

（3）酶的底物；

（4）系列参照原则品（定量测定）；

（5）酶标识物及样本的稀释液；

（6）洗涤液；

（7）反应终止液。2.2.1、固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料诸多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状重要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上原则的微量滴定板为8×12的96孔式。2.2、免疫吸附剂：已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA措施中的关键试剂。2.3、酶标识物：即酶标识的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标识物应当是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标识物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标识物中应尽量不具有或少具有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标识物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。2.4、酶的底物2.4.1、HRP的底物

HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+H2O2D+H2O

上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸取峰，敏捷度高，比色以便，是HRP结合物最常用的底物。OPD自身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般提成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中具有发泡助溶剂，使用更为以便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保留的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。此外，TMB又有无致癌性等长处，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸取波长为450nm。2.5、洗涤液洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而减弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质答复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的敏捷度。2.6酶反应终止液

常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式

ELISA中一般采用2mol/L。2.7参照原则品

定量测定的ELISA试剂盒应具有制作原则曲线用的参照原则品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。3、ELISA试验过程3.1试剂的准备

按试剂盒阐明书的规定准备试验中需用的试剂。ELISA试验中应用蒸馏水或去离子水。自配的缓冲液的PH应用pH计进行较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保留。3.2加样在ELISA试验中一般有5次加样步聚，即加原则品、加样本、加酶标识物、加底物、加反应终止液。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完毕。3.3保温在ELISA中一般加标本和加酶标识物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完毕需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并不是均有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一种逐渐平衡的过程，因此需经扩散才能到达反应的终点。在其后加入的酶标识抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为何ELISA反应总是需要一定期间的温育。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。为了便于操作目前绝大部分的试剂盒均采用室温进行温育反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，原则室温温度是指20-25℃，但详细操作时可根听阐明书的规定控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力争精确。3.4洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一种反应环节，但却也决定着试验的成败。ELSIA就是靠洗涤来到达分离游离的和结合的酶标识物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最重要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按规定洗涤，不得马虎。

洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作重要为浸泡式，过程如下：

a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.反复操作c和d，洗涤3-4次（或按阐明规定）。在间接法中如本底较高，可增长洗涤次数或延长浸泡时间。3.5显色和比色3.5.1、显色

显色是ELISA中的最终一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的原因。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力争精确。底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，约40分钟将到达显色的顶峰，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。3.5.2比色比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板对的放入酶标比色仪的比色架中。比色成果的体现以往通用光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光（absorbence，A），两者含义相似。一般的表达措施是，将吸取波长写于A字母的右下

角，如TMB的吸取波长为450nm，表达措施为"A450nm"或"OD450nm"。测读A值时，要选用产物的敏感吸取峰，用单波长进行测读。也可用双波长进行测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的位置。例如TMB用450nm为W1，625nm为W2，最终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等导致的光干扰。

多种酶标仪性能有所不一样，使用中应详细阅读使用阐明书。3.6.3酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，一般指专用于测读ELISA成果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不一样，有特制的合用于板、珠和小试管的设计。许多试剂企业配套供应酶标仪。酶标仪的重要性能指标有：测读速度、读数的精确性、反复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，精确性为±1%，反复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083±0.01（1.073~1.093），反复测定多次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不一样。酶标仪的检测范围一般在0.000—3.000之间，甚至更高。超过可测上限的A值常以"*"或"over"或其他符号表达。酶标仪不应安顿在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读成果更稳定。

4.ELISA试验的质量控制4.1、分析前质控4.1.1、人员培训

试验人员操作的技巧及纯熟程度直接影响到检查成果，因此检查人员需通过培训，纯熟掌握有关的技术知识和操作要点：

◎检查项目的基本原理（ELISA原理）；

◎熟悉检测技巧，理解试验的关键环节及操作要点；

◎熟悉检测试剂性能（包括试剂盒构成，包被片段及其构成）；4.1.2、仪器质控4.1.2、仪器质控

为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的原则操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。

◎移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其精确性直接影响试验成果，运用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量与否精确，一般应在±2%以内；

◎水浴箱：常常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度与否一致，容许有±1℃的误差；

◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔与否堵塞；

◎酶标仪：常常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。4.1.3、标本采集及处理过程的质控取样：保证取样有代表性，即要遵照一定的取样措施又要保证一定的取样比例（如：随机多点取样、四分法等）样品选用过程中需要防止产生交叉污染。如：处理不一样批次的样品时应更换使用的工器具或对使用的工具进行彻底的清洗。4.2、分析中质控◎ELISA试验的成果受操作影响很大，每个环节包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充足发挥ELISA的高敏捷，强特异的长处。

◎因此,应建立试验项目的原则操作程序(SOP)。加样

◎加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的底部防止加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加样枪的枪头不要触及微孔的内壁。

◎每次加样应更换吸嘴，做到同样一吸头，以免发生交叉污染。温育

◎大多数的试剂盒抗原抗体反应需要在室温度下，通过一定的时间才能到达反应的平衡点

◎ELISA边缘效应是由温育形成的。因此温育一般采用能

使反应液温度迅速到达平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。

洗涤◎ELISA是靠洗涤来到达分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标识物的目的，同步洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。

◎手工洗涤一般采用浸泡措施：1）甩去孔内反应液；

2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；

3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；

4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。

反复以上操作至少5次。注意多种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。

◎洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体所有吸干，同步要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，防止堵孔。显色HRP催化底物是一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，一定要按照阐明书规定的时间温度（一般为室温°C，15-20分钟）。到达规定的反应时间后需要立即终止。酶标仪判读成果

显色反应终止后应立即比色（一般在30分钟内有效）。

常见的显色系统有OPD和TMB二种，后来者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响成果。

TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，参比波长为630nm。

使用双波长的长处可以消除反应板条上