一案搞定PCR-2025年高考生物复习热点背练清单（原卷版）

清单04PCR专题一次摘定PCR

面圆回国1

「岁匚二

5'1

9（TC以上变性，DNA双链解开

第“50。（:左右复性，引物与DNA结合

3'[

次《5'[

72（延伸，新DNA合成

循

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环

15T

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进行第三次循环变性、复性

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L【PCR基因定点突变】重叠延伸PCR

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有个地方不清楚可沿引物3引物43'端延伸

我直接拿手写这样方便大家熟悉这个过程，以免高考题出信息情境题，所以这个方法还是要了解一下流程。

2.（实时）荧光定量PCR技术

先从样本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生

物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA,并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物

以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核昔酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针

完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚

合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个

荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸

浓度越高，Ct值越小（如图）。

3.RT-PCR技术

如果想克隆一段已知mRNA序列的cDNA,可使用反转录酶PCR（reversetranscriptasePCR,RT-PCR）技术。

RT-PCR与刚才介绍的PCR技术的主要区别在于它是从mRNA而不是双链DNA开始的。先利用反向引物在反转录酶催

化下将mRNA反转录成单链DNA；DNA-RNA杂交链变性后，再用正向引物将单链DNA转换成双链DNA；接着在DNA聚

合酶催化下，正向引物起始cDNA第二链合成，将单链DNA转换成双链DNA；最后用常规PCR技术扩增足量的cDNA

用于克隆。

J■■ZZ)

反引物)

（bi|«ft：。正臼见的退火

小向方物I

sHMy

^■■■■^_）

归）DNA*fHW

M)UffiM^IWiihPCR

理］因凰氏］

一、单选题

1.（24-25高三上•天津•阶段练习）某种二倍体植物的Pi和P2植株杂交得Fi,Fi自交得F?。对不同个体的DNA

进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①〜⑧为部分F?个体，上部两条带是一对等位基因的扩增产物，下

部两条带是另一对等位基因的扩增产物，这两对等位基因位于非同源染色体上。下列相关叙述错误的是（）

ppFF

r1121___________________1____________

①②③④⑤⑥⑦⑧

电源负极

电源正极

A.①②个体均为杂合体，F,中③所占比例大于⑤

B.还有一种握个体的PCR产物电泳结果有三条带

C.①自交子代的PCR产物电泳结果有1/2与④电泳结果相同

D.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同

2.（24-25高三上•湖北•期中）图1是某单基因遗传病的遗传系谱图，该病在人群中的发病率为1/8100„科研

人员提取了四名女性的DNA,用PCR扩增了与此病相关的基因片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个

限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。相关叙述正确的是（）

bpI-1n-3n-5

I

□正常男性

o正常女性

口

■•患者

m?

图1

A.该病的遗传方式可能为伴X染色体隐性遗传

B.II-1与II-2婚配生一个患病男孩的概率为1/91

C.该突变基因新增的酶切位点可能位于310bp或118bp中

D.扩增II-2与此病相关的基因片段，酶切后电泳将产生3种条带

3.（23-24高三上•浙江•阶段练习）实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）是指先逆转录得到DNA,然后进行PCR

扩增。加入的Taqman荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，每复制一次，就有一个荧光分子生成，当荧光强度

达到一定程度就可以被仪器检测到，原理如图所示。下列叙述错误的是（）

（注：Ct值是指PCR扩增过程中，缓冲液中的荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。）

A.图中的TaqDNA聚合酶具有5'外切酶活性

B.荧光报告基团连接在Taqman探针的5'端

C.该PCR过程只需要加入1种足量的引物

D.Ct值越小，说明体系中目标RNA越多

4.（22-23高三下•河南焦作•阶段练习）RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚

合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（）

T

5'Bn-

3<—S,Tn

3<_

3S'y

57

A.过程I获得cDNA的过程与DNA复制过程中存在的碱基配对方式相同

B.图中A、B两种引物的核甘酸序列不同，但参与子链合成的酶均相同

C.图中子链的合成均是以四种核糖核甘酸为原料从引物的一端开始的

D.过程II中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个

二、多选题

5.（24-25高三上•湖北•阶段练习）某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻番茄新品种。设计含有非特异性

碱基配对的引物，将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中，获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是（）

拟突变位点

通多/艮5'3型

3年至------3，5,---------------A------------:

—T--------------5，3'---------------T------------

5'-----3'②弓物斗③

引物1I।

f3'、5"3'

八5，^^④1^3八5'

,__________是快变性后，杂交

--------------5'

（⑤

5'・______A______3'

3人______A______5'

突变后的基因

注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程②还需要四种脱氧核甘酸和耐高温的DNA连接酶

B.过程③至少需要进行2次循环才能得到两条链等长的DNA分子

C.过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因

D.常采用显微注射法将获得的目的基因导入番茄细胞培育抗冻新品种

三、非选择题

6.（2024•广东深圳•模拟预测）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶

原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。请据图回答下列问题：

注।BamHIxHindHI、EcoRI

为限制髀

tsr为雌丝醵抗性基因

女制原点

⑴若导入到原核生物大肠杆菌中，但由于原核细胞中缺少（细胞器），影响表达产物进一步加工，可能会影

响蛋白质的功能。

⑵已知kit基因的部分序列如下图，采用PCR技术进行扩增时，选用的引物为（填字母）。为使基因与质粒

成功连接，需要在引物的端添加两种限制酶识别序列。

-5'-CGGGATCCA...................................AGAATTCCG-3'

3'-GCCCTAGGT.....................................TCTTAAGGC-5'

A.5,-GCCCTAGGT-3，B.5'—CGGAATTCT-3'

C.5'-CGGGATCCA-3'D.5'—GCCTTAAGA-3'

(3)酶切kit基因，并与质粒中长度为170bp片段进行置换，构建重组质粒pET-28a(+)-kit,用HindHI酶分

别酶切pET-28a(+)和pET-28a(+)-kit,获得如下表所示片段，

质粒类型pET—28a(+)pET—28a(+)—kit

HindHI酶切片段lOOObp、2550bplOOObp、2000bp>700bp

则kit基因长度为，由此判定kit基因上有个HindHI酶切位点。

（4）菌液PCR是直接以菌体热解后的DNA为模板、以目的基因两端序列为引物进行扩增的方法，PCR产物需要用

法进行鉴定，若结果出现大量杂带，其原因可能有。(答出两点)

7.(24-25高三上•天津滨海新•阶段练习)四尾栅藻是一种淡水藻类，繁殖快、适应性强，可作为制备生物柴油

的重要原料之一。为提高四尾栅藻油脂含量，研究人员将从含油量高的紫苏中获得的二酰甘油酰基转移酶基因

(DGAT1)与pBI121质粒构建表达载体，经转化成功获得高产油脂四尾栅藻，主要研究过程如下图，其中DGAT1-F

(5-GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC—3')和DGATl-RC5f-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTITTC-3,)

是以DGAT1基因为依据设计的一对引物，lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落

呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请回答下列问题。

①DGAT1

紫苏总RNA卫波

卡那霉素启动子

RT-PCR抗性基因,

DGAT1-FPBI121

DGAT1-R载体终止子

复制原点(4349bp)力转换DGAT1(14756bp)

端选大肠杆菌I复制原点

氨苇青霉素

抗性基因④

限制酶识别序列及切割位点

转化表达

BamHI5,GfGATCC3'四尾栅藻二一载体

SacI5'GAGCTfC3'

Xba\5，TlCTAGA3'

EcoRI5'GfAATTC3'

(1)过程①中需要的酶有.和，过程②应选用的限制酶是._____和一

(2)在保存DGAT1基因时，将克隆载体导入大肠杆菌的优点有.(多选)。

①稳定保存②准确复制③快速表达④方便取用

(3)过程③经转化的大肠杆菌通过(方法)接种到培养基上继续培养。为筛选获得目标菌株，培养基应加入

的成分有=

(4)为检测表达载体转化四尾栅藻的情况及确定目的基因是否表达，研究人员进行了如下实验，请完成下表。

实验步骤简要操作过程

经转化后的四尾栅藻接种于含①_____的BGH固体培养基并放置于人工气候箱培养，一段时间后观

初筛培养

察其生长情况

扩大培养在BG11固体培养基上分别挑取数个单藻落接种至BG11液体培养基中光照摇床培养，编号备用

收集四尾栅藻藻体，提取基因组DNA,以DGAT1-F和DGAT1-R为引物，进行PCR验证，未转化的四尾

PCR验证

栅藻作对照

油脂含量测

利用索氏抽提法，分别测定②_____的油脂含量

定

结果处理统计并比较PCR验证结果及藻体中油脂的含量

8.(24-25高三上•江西赣州•阶段练习)番茄不耐寒，冬季容易冻坏，难以储藏。我国科研人员从某植物中提取

了一种抗冻基因AtC0R15a,经过一系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。回答下列问题：

转基因的

番茄幼苗

（1）用PCR技术扩增AtCORl5a基因时需要添加引物，引物的作用是。

（2）如果要将AtCORl5a基因与质粒构建重组DNA分子，一般采用双酶切法，据图分析选用的两种限制酶组合

是O

（3）图中是采用法将目的基因转移到番茄细胞中，并将其整合到该细胞的上。

⑷为了提高AtCOR15a基因的表达能力，可将AtCOR15a基因与外源强启动子连接，如下图所示。

—

强启动子一AtCOR15as因（注：图中①、②、③、④表示引物）

④③

利用PCR检测上述连接是否正确，可选择的引物组合是（填字母），该PCR反应体系中需加入—

酶。

A.①+②B.①+③C.②+③D.③+④

9.（22-23高二下•江苏扬州•阶段练习）引起新冠肺炎的新冠病毒是一种带包膜的RNA病毒，包膜表面有与人体

细胞膜表面的ACE2受体结合的S蛋白。疫苗接种和病毒检测是当前新冠肺炎疫情防控工作的重要举措。请回答下

列问题：

I、疫苗的研发和接种

（1）灭活疫苗。工业生产上利用Vero细胞能无限增殖的特性培养新冠病毒，可实现的目的。

（2）腺病毒载体疫苗。该疫苗主要成分是活的、有复制缺陷、能表达S蛋白的重组人5型腺病毒。这种方式生产的

疫苗由于重组腺病毒，从而提高了疫苗的安全性。

（3）重组亚单位疫苗。其技术线路是：提取新冠病毒RNA-通过RT酶PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛

选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因一构建基因表达载体一导入CHO细胞并培养一提取并纯化

RBD蛋白一制成疫苗。利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入酶；扩增RBD蛋白基因时，应选择的

引物为。PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker）,2号泳道是以为材料做的

阳性对照组，3号泳道为实验组。图3中3号泳道出现杂带，原因一般有（至少答出两点）。基因表达载体构

建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图1中选择的限制酶是o

123

EcoRISmaIEcoRI

标记基因BamHIHindDIEcoRI

引物1引物引物4

5'Z±1口川川川鹏川二：

…4引物6引物71引物8图2运载体片段示意图

X

BamHIRBD蛋-W基因~'HindID

图1RBD蛋白基因结构与引物位置示意图

图3

II、新冠病毒的检测

（4）核酸检测

图4是我国自主设计的新冠病毒核酸检测平台示意图，图5为RT-PCR（实时荧光逆转录聚合酶链式反应）示意图。

当探针完整时，荧光基团（R）发出的荧光信号被淬灭基团（Q）吸收而不发荧光；当Taq酶遇到探针时会使探针水

解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。

病毒样品RNA------------------------------------------------

I

[a的困§脂曾

坪木♦病毒.样本信♦自动化+自动%+自动WR.RT双链DNA=

样本+灭活十息录入.分装♦核酸提取+体系配置.暗刊引物、探针与模板链疆扇“aqMan探针

—|施

全自动分杯全自动核酸自动化液体

处理系统提取纯化仪处理系统新链延伸遇到探包一圾八嘎、

I1I

Taq酶切割嬴

厂样」荧光：眼、®，嘀洞、

实验室信息管理系统

新仪链器聚检-测完成毛牛恤।）।佥一.J二

图4

初徒不口兀取______________I_________________________________

图5

①在自动化PCR体系配置中加入引物和探针，引物和探针与模板结合发生在PCR循环中的阶段。

②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TaqMan探针，设置R发出的荧光信号的

值为L若经n次的PCR扩增，实时荧光信号强度（填“增强”“减弱”或“不变”），说明样液中病毒的核

酸数量为0；

（5）抗原和抗体检测：为了及早发现新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测

的有效补充措施。对于已注射过灭活疫苗的人员，应选择（填字母）检测。

a、核酸检测b、抗原检测c、抗体检测

10.（22-23高三上•江苏扬州•阶段练习）科研人员发现在人类肿瘤细胞中LMNA基因表达异常，LMNA基因编码

的核纤层蛋白与维持细胞核的正常形态有关。科研人员利用CRISPR/Cas9技术对体外培养的HepG2（人源肺癌细胞）

细胞株进行基因编辑，获得了LMNA基因敲除的稳定细胞系。

（l）Cas9是一种核酸内切酶，它与sgRNA（向导RNA）构成的复合体能与DNA分子特定碱基序列结合，如图1。作用

时sgRNA与DNA单链进行碱基互补配对，然后Cas9催化水解，从而使DNA在PAM序列（几乎存在于所有

基因中）的（填“上游”或“下游”）被切断。

，Cas9

73'_

J-5'-fsgRNA

NGGPAM序列

（N表示任意碱基）

UHL基因组DNA

&Cas9切点

图1

⑵一般来说，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和（填“相同”或“不同”）

的sgRNA结合构成复合体进行相关基因的编辑，其中Cas9对DNA的切割（填“具有”或“不具有”）

类似于限制酶的“限制性”。

（3）HepG2细胞中没有编码Cas9的基因，需将Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并与质粒结合导入HepG2

细胞，sgRNA的合成需要酶的催化。

⑷用图2中的质粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段构建表达载体时，应选用进行酶切。将构建好的表

达载体与用处理的细菌置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含的平板培养

基上，37℃培养，24h后挑取菌落，提取质粒作为模板，选择图3中引物组合和，通过PCR和电

泳技术鉴定是否重组成功。

拼接基因插入位置

5，一“CCGTGT…"■■”•ATGCCT…-3，5-...GGGATG'—3'

3'—.GGCACA-H--TACGGA--5'3'—"CCCTAG--5'

I_______________™______________III

插入部位两端拼接.因

|-I5'-…GATCCC”•-3'

EcoRIEcoRIBamHI

3种引物-II5'-…AGGCAT…-3'

-III5--CCGTGT…-3'

Cas9-sgRNA拼接基因

图3

图2

(5)用鉴定成功的工程菌对HepG2细胞进行转染，培养三天后收集HepG2细胞，从分子水平和细胞水平检测导入是

否成功。

①提取HepG2细胞的基因组，对DNA分子的序列进行检测。

②请写出细胞水平的一项检测指标：o

11.(2024高三上•广东江门•专题练习)在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，其凝乳功能可使奶制品形成独特

风味和质地，因此被广泛应用于奶酪和酸奶生产。现利用生物工程大量生产牛凝乳酶，如图为目的基因及质粒的示

意图，请回答相关问题。

PlP2

a链R，--一

b链;二

—.—

P3牛凝乳酶cDNA04注：

P1〜P4:引物

Ampt氨羊青霉素抗性基因

LacZ:B-半乳糖甘酶基因，编

码的酶能将无色化合物X-盟1切

割成半乳糖和蓝色物质，使菌落

呈现蓝色；否则菌落为白色

(1)图中的牛凝乳酶cDNA是由未断奶小牛胃细胞中分离出的mRNA经过程获得。

(2)已知牛凝乳酶cDNA中的b链为转录的模板链，为实现牛凝乳酶基因与质粒的准确连接，PCR扩增牛凝乳酶cDNA

时需选择适当的引物并在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。请据图分析并完成下表：

应选择的引物5'端添加序列所对应的限制酶

©______NeoI

P2②_______

(3)将构建的表达载体导入受体菌后，用含的培养基培养受体菌，进行鉴定。含重组质粒的菌落将呈现白色，

原因是=

(4)与细菌相比，选用具有酵母菌作为受体菌更能对目的基因的表达产物进行(填“转录”或“翻译”)后

修饰，使凝乳酶具有更优的生物学活性。由于不同物种对编码相同氨基酸的不同密码子的使用频率存在差异，当外

源基因的密码子对应的在受体细胞中数量较少时就会影响翻译的效率。

12.（24-25图三上•浙江杭州•阶段练习）研究人员从分解纤维素的细菌（A菌）中提取出一种纤维素酶基因（CBHH）

并进行PCR扩增，然后与高效表达载体DUT质粒（图1）连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能

力更强的工程菌（B菌），请回答下列问题：

Bgin

高效表达启动子n

弓鹭

SacI抗生素MCBHnA链5'______________^3，

抗性基因

基因15链3二一廊L'

MspIPUT质粒

引物11连接

抗生素N

pUT质粒||启动子

抗性基因

BamHI

图1图2

标准DNACBHII123

23130bp

9416bpWU

4557bp6

S1

4361bp和

O

2233bp量8

1356bp

%)4

1120bp

0-

对照组1对照组2B菌

图3图4

限制酶识别序列及酶切位点

Bglll5'-A1GATCT-3'

BstEH5*-GIGTNACC-3'（N为任意碱基）

SacI5'-G\AGCTC-3'

MspI5'-C3CGG-3'

BamHI5'-G\GATCC-3"

几种限制酶识别序列及酶切位点

（1）构建成重组质粒时，应选择限制酶对PUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段（X和Y）,X

两端的黏性末端分别为-CTAG和-CAATG,则Y两端的黏性末端分别为-CTAG和。

（2）CBHII基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，PCR扩增过程

中，最早经过轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。PCR的产物一般通过琼

脂糖凝胶电泳来鉴定。为了能在波长为300nm紫外灯下检测出DNA分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的。

（3）为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素（填“M”或"N”）的培养

基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示（片段过小时检测不

到条带）。据图分析，菌落中成功导入了重组质粒。

（4）为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段

时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种,说明o

13.（2024•四川巴中•一模）巢式聚合酶链式反应（NestedPCR）属于普通PCR的衍生技术，相较于普通PCR,

巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例，增加PCR的灵敏度和特异性。巢式PCR通常包括两个连续的扩增反应，

每个反应使用不同的一对引物。第一次PCR用一对外引物进行扩增，其产物会被用作第二次PCR的模板，第二次PCR

由一对内引物（结合位点位于外引物对结合点的内部）扩增目的基因，过程如下图所示。

目的菁因序列

31

模板DNA

51

3,

5,

第一次

PCR

第二次

PCR

（1）巢式PCR反应体系所需的试剂如下，请补齐空白处：

PCR反应缓冲液（含有MgCk）

dNTP混合液（所有四种dNTP,即dATP、dTTP、dCTP、dGTP）

引物：内引物1,内引物2,外引物1,外引物2

模板DNA

H20

其中PCR反应缓冲液中Mg"的作用是，相比直接使用4种脱氧核甘酸，在反应体系中加入dNTP的优势有

（2）与普通PCR相比巢式PCR中设计的引物只是在模板DNA的结合位置有所差异。进行巢式PCR前，根据已知的模

板DNA序列，可设计合成内外引物对，引物设计的要求有（答出两点即可）；同时，为方便扩增产物后续的

操作，可在引物的（填“5,端”或“3,端”）添加限制性内切核酸酶位点。

（3）将题（1）中试剂按顺序加入扩增离心管中，按下表参数在PCR仪中进行扩增：

周期数变性复性延伸

1-3094℃下30s50℃下30s72℃下2.5min

在扩增后对PCR的产物进行电泳鉴定时发现出现较多的非特异性条带，此时可适当（填“提高”或“降低”）

复性温度来减少非特异性条带，原因是o

（4）巢式PCR可大大提高扩增特异性的原因是o

14.（2024•湖南长沙•二模）对某冠状病毒进行核酸检测其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方

法为实时荧光RT-PCR（逆转录-聚合酶链式反应）法。为检测某人是否感染了该冠状病毒，需要进行以下相关操作：

①分析PCR扩增结果；②从组织样本中提取RNA；③RT（逆转录）成cDNA；④采集样本（咽拭子或鼻拭子）；⑤利

用PCR扩增DNA片段。回答下列问题：

(1)若要得到正确的核酸检测结果，正确的操作顺序应该是(用数字序号表示)。核酸检

测样本多采集于咽、鼻，这些部位存在多种微生物，提取物中核酸种类可能有多种，但通过PCR技术可专一地对该

冠状病毒的核酸序列进行扩增，原因是o

(2)操作⑤中，需设计2种引物，需要提供引物的原因是；复性时温度的设定是该步操作

成败的关键，而复性的作用是。

(3)PCR扩增时，在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针，其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团,

如图所示：

,正向引物_/探针&2

,5

,YMrrW\滔;芸会3

5

3

合反向引物

1^=报告基团(?=淬灭基团

5

3

5

2.链取代

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；在催化子链延伸时，还具有外切

酶活性，它可以沿着(填“5'-3'”或"3'-5'")方向将探针酶切，使报告基团和淬灭基团分离，

随着DNA扩增次数的增加，荧光的强度会逐渐增大，从而实现荧光信号的变化与的形成完全

同步。

(4)除了荧光检测法，还可以通过法分析PCR扩增结果。

15.(23-24高三上•广东•阶段练习)研究表明，Lm-PHB2蛋白在细胞核内起调节细胞周期的作用。为研究Lm-PHB2

蛋白的生物学活性，研究人员进行了以下实验。RT-PCR是将RNA的反转录(逆转录，RT)和cDNA的聚合酶链扩

增(PCR)相结合的技术，LacZ基因的编码产物在x-gal和IPTG存在下，可使大肠杆菌菌落呈现蓝色，否则菌

落呈现白色。回答下列问题.

Lm-PHB2①：_

基因mRNART-PCRLm-PHB2

基因

(1)过程①需要的酶有该过程需要在目的基因上添加适宜的酶切位点，扩增时，引物和酶切位点的设

计依据分别是Lm-PHB2基因两侧的脱氧核甘酸序列和0

(2)过程③中筛选和培养大肠杆菌的培养基中需要加入和碳源、氮源、水和无机盐等物质，挑取色

菌落中的微生物培养并提取质粒，用限制酶进行酶切，再对产物进行检测。

(3)为检测过程⑤得到的大肠杆菌是否表达Lm-PHB2基因，研究人员以注射了后获得的小鼠B淋巴细胞和骨

髓瘤细胞制备单克隆抗体，之后再用制备的单克隆抗体与大肠杆菌中蛋白质进行实验。

16.(22-23高二下•湖南•阶段练习)聚乳酸(PLA)具有良好的生物可降解性与相容性，其机械性能及物理性能

良好，被认为是传统石化来源类塑料的环保替代品。PLA可以以三种立体结构存在：聚L一乳酸(PLLA)、聚D一乳

酸(PDLA)和聚DL一乳酸(PDLLA),它们分别是L一乳酸、D一乳酸和DL-乳酸的聚合物。几乎所有的乳酸菌都同

时具有L一乳酸脱氢酶(L—LDH)和D一乳酸脱氢酶(D—LDH)。

(1)已知乳酸芽抱杆菌可生产纯度相对较高的D一乳酸，其在无氧情况下，能将葡萄糖分解为乳酸，反应简式

为。

(2)为得到足够浓度的乳酸芽抱杆菌，研究者对其进行富集培养，并且每间隔一段时间采用法进

行活菌计数。某次实验时，甲、乙两组研究者分别吸取经稀释10倍的菌液0.1mL进行涂布后计数，甲组统计的菌

落数分别为45、40、37,乙组统计的菌落数分别为280、350、295,请计算出此时培养液中乳酸芽抱杆菌浓度为一

(保留小数点后一位)个/mL。

(3)为增加D—乳酸的产量,科学家对乳酸芽抱杆菌的D-LDH基因特定位点进行了定点突变，以增强D-LDH的活性。

重叠延伸PCR技术是常见的定点突变手段之一，其过程如下图所示：

/「拟突变位点

5•4:v—Li

3-__________M____________yD-L