基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修34

第3章第2节人教版选择性必修3

从社会中来转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？P77相关信息：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。

从社会中来培育转基因抗虫棉的简要过程苏云金杆菌

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入与载体拼接重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取（前提）2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞（关键）4.目的基因的检测与鉴定Bt基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。一、目的基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因一第一步：目的基因的筛选与获取DNA片段基因1基因2基因3补充知识：真核生物基因的结构（基因通常是有遗传效应的DNA片段）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子放大（1）非编码区：位于编码区上游与编码区下游功能，不能转录为相应的mRNA,

不能编码蛋白质。（2）编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码蛋白质的合成。启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号。终止子：终止RNA的合成一第一步：目的基因的筛选与获取非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子内含子外显子转录前体mRNA成熟mRNA剪切、拼接不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子DNA片段基因1基因2基因3补充知识：真核生物基因的结构（基因通常是有遗传效应的DNA片段）放大（1）外显子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。（2）内含子：：能转录相应的mRNA，但不能编码蛋白质的DNA序列。一第一步：目的基因的筛选与获取补充知识：原核生物基因的结构非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区终止子：终止转录转录mRNA原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码实例：Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程思考：Bt抗虫蛋白的抗虫原理？抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？

一第一步：目的基因的筛选与获取二、筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因，是较为有效的方法之一。思考：Bt抗虫蛋白的抗虫原理？抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。认识基因结构和功能的技术方法

随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。序列数据库序列比对工具以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。一第一步：目的基因的筛选与获取二、筛选合适的目的基因一第一步：目的基因的筛选与获取三、获取目的基因的常用方法3.人工合成（1）化学合成法（2）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）1.直接从供体生物细胞中分离2.从基因文库中获取（1）基因文库的概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（2）基因文库的种类

基因组文库：部分基因文库：含有一种生物所有基因的文库只含有一种生物部分基因的文库(主要是cDNA文库）三、获取目的基因的常用方法

从基因文库中获取一第一步：目的基因的筛选与获取一第一步：目的基因的筛选与获取某种生物体内的

DNA适当的不同限制酶切割与质粒连接全部（3）基因组文库的构建一第一步：目的基因的筛选与获取某种生物体内的全部DNA适当的不同限制酶切割与质粒连接受体菌导入受体菌一第一步：目的基因的筛选与获取一第一步：目的基因的筛选与获取受体菌导入受体菌每个受体菌都含有了一段不同的

。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。该受体菌群为基因组文库某种生物体内的全部DNA适当的不同限制酶切割与质粒连接DNA片段一第一步：目的基因的筛选与获取（4）cDNA文库的构建一第一步：目的基因的筛选与获取包含某种生物部分基因。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。质粒质粒cDNA片段逆转录酶导入细菌中逆转录cDNAmRNAcDNA文库①前提：②方法：人工合成----化学合成基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因一第一步：目的基因的筛选与获取三、获取目的基因的常用方法(1)PCR的概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写,它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR扩增仪一第一步：目的基因的筛选与获取三、获取目的基因的常用方法人工合成----利用PCR获取和扩增目的基因（常用）苏云金杆菌Bt基因？快速获得大量Bt基因提取【重温】DNA体内复制的过程及条件合成子链解旋形成新DNA条件在DNA复制中的作用DNA母链4种脱氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸一第一步：目的基因的筛选与获取一第一步：目的基因的筛选与获取

PCR的进行需要的条件体内DNA复制参与的组分PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸（dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常为小的单链DNA至少需要2种引物）反应还需要其它条件，如控温系统、缓冲液（一般添加Mg2+）---能够调节PH，激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶。ATCGAATCGGTT

TACCTTAGCCAADNA聚合酶引物3′3′5′5′2.DNA复制过程需要引物的原因：一第一步：目的基因的筛选与获取拓展：引物1.定义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（长度通常为20-30个核苷酸）。母链DNA子链DNA引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链·细胞内通常以RNA单链为引物·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物①DNA聚合酶不能从头合成子链。②使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸DNA复制时，子链延伸的方向是从5’→3’端。脱氧腺苷三磷酸（dATP）腺嘌呤脱氧核苷酸

腺嘌呤脱氧核糖PPP~~OHH

在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。——脱氧核苷三磷酸一第一步：目拓展：dNTP一第一步：目的基因的筛选与获取微量离心管缓冲液

PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四种脱氧核苷酸(dNTP)引物分别与两条模板链结合的2种引物耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）PCR反应过程：一第一步：目的基因的筛选与获取一第一步：目的基因的筛选与获取3’5’3’5’A.变性3’5’3’5’（3）PCR反应过程：当温度超过

时，双链DNA解聚为单链。3’5’3’5’B.复性3’5’3’5’当温度下降到

时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。90℃50℃左右变性的温度与氢键的数量有关。DNA双链中氢键数量越多，所需温度越高。【思考】复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？

不一定，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低。①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。一第一步：目的基因的筛选与获取3’5’3’5’A.变性3’5’3’5’（3）PCR反应过程：当温度超过

时，双链DNA解聚为单链。3’5’3’5’B.复性3’5’3’5’当温度下降到

时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。90℃以上50℃左右3’5’3’5’C.延伸当温度上升到

时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。3’5’3’5’72℃左右变性的温度与氢键的数量有关。DNA双链中氢键数量越多，所需温度越高。72℃是耐高温的DNA聚合酶的最适温度第一轮循环的产物作为第二轮反应的

，经过

和

三步产生第二轮循环的产物第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物第二轮循环的产物第三轮循环的产物完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。模板变性、复性延伸一第一步：目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程：a、变性：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成

。

b、复性：温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部

。c、延伸：溶液中的

在

的作用下，根据碱基互补配对原则，沿引物的

端合成与模板互补的的新的DNA链。

氢键单链DNA双链4种脱氧核苷酸3′耐高温的DNA聚合酶一第一步：目的基因的筛选与获取（3）PCR反应过程：（4）PCR反应的结果:（5）产物鉴定：以_______方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）

指数

2n可采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳一第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因合作探究一：

利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始分离出目的基因？目的基因3’3’5’5’第一轮循环第二轮循环第三轮循环3’5’5’3’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’非目的基因序列目的基因序列引物5’3’目的基因目的基因PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因复制次数123nDNA分子数

含引物的DNA分子数

DNA链数目共消耗引物的个数

含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数

22204460881422n2n2n+1-22n-2n48162n+1一PCR扩增DNA规律思考讨论1、引物在PCR中能重复利用吗？不能【拓展】设计引物的注意事项①引物自身不能有互补序列②引物之间不能有互补序列③引物长度要适宜，过短会导致引物与DNA随机结合④引物能与目的基因两侧特异性结合。防止引物自身互补环化防止两引物之间配对，导致引物不能各自同模板链结合【现学现用】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。(1）第1组：

；

第2组：

。（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是