高三生物一轮复习课件基因工程

第3讲

基因工程课标要求：1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验第十单元

生物技术与工程本节聚焦：DNA的结构特点：5’3’3’5’②

和

交替连接，排列在外侧，构成

；

排列在内侧。③两条链上的碱基通过

连接成碱基对，且遵循

。①DNA是由两条单链组成的，这两条链按

方式盘旋成双螺旋结构。反向平行脱氧核糖磷酸碱基基本骨架氢键碱基互补配对原则知识回顾——DNA

脱水缩合基因工程是指按照人们的愿望，通过

等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

又叫作

。

基因重组④优点：①原理：定向的改造生物体的遗传性状，克服远缘杂交不亲和的障碍。即基因未变、合成蛋白质未变,只是合成场所的转移。甲(供体提供目的基因)

乙(受体表达目的基因)导入⑤本质：⑥理论基础：不同生物的DNA的组成和空间结构相同，及碱基互补配对方式相同。基因是控制性状的基本单位，遗传信息的传递都遵循中心法则，所有生物共用一套遗传密码拼接：表达：重组DNA技术转基因②操作环境：生物体外③操作水平：DNA分子水平基因工程的理论基础：剪切→拼接→导入→表达1.DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸2.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构3.都遵循碱基互补配对原则拼接基础：表达基础：1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码⑦基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定核心步骤实验：DNA的粗提取与鉴定PCR技术及电泳鉴定基本操作工具基因表达载体的组成农杆菌转化法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定1.“分子手术刀”——

1）来源：

2）作用：

3）作用结果：2.“分子缝合线”——

1）作用：

2）分类：3.“分子运输车”——

1）作用：

2）种类：

3）应具备条件：

限制性内切核酸酶（限制酶）

产生黏性末端、平末端

DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来将外源基因送入受体细胞质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.ColiDNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来，目前分离出数千种。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害——便于重组DNA分子的筛选——供外源DNA片段（目的基因）插入其中基因工程的基本工具1呈现碱基互补对称，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。了解：识别序列特点即在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条反向读的碱基序列完全一致。EcoRⅠ中轴线粘性末端平末端SamⅠ黏性末端vs平末端类型来源作用相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端既能连接黏性末端又能连接平末端(效率较低)最常用的载体——质粒质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的

。质粒

✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。环状双链DNA分子DNA复制特定的起始位点名称作用部位作用限制酶磷酸二酯键DNA连接酶磷酸二酯键DNA聚合酶磷酸二酯键DNA(水解)酶磷酸二酯键解旋酶碱基对之间的氢键几种相关酶的比较：都是蛋白质 化学本质： 将游离的单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端连接DNA片段将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将DNA切成两个片段将双链DNA分子局部解旋为单链DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两个DNA片段DNA连接酶作用示意图：CAATTGAGTATCDNA聚合酶以DNA母链为模板，连接单个脱氧核苷酸形成单链回顾：DNA聚合酶的作用1.限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？（P71旁栏思考）2.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA?（P74拓展应用1）限制酶具有特异性，细菌本身的DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。切割外源DNA，使之失效，防止外源病原微生物的危害。【课本思考题】重点剖析——限制酶相关考点2.据图所示,下列有关工具酶功能的叙述,错误的是(

)A.限制酶可以切断a处B.DNA聚合酶可以连接a处C.解旋酶可以使b处解开D.DNA连接酶可以连接c处D1.以下是几种不同限制性核酸内切酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列的叙述中,正确的是（）A.以上DNA片段是由3种限制酶切割后产生

B.目的基因即使不和运载体连接，也能够在宿主细胞内自我复制

C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下形成的重组DNA分子

D.限制酶作用的部位是核酸和脱氧核糖之间的酯键以及碱基对之间的氢键A【析典例】下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是注：Y为C或T，R为A或G。限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGA.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列D析典例34甲

不同限制酶切割的相同粘性末端在DNA连接酶作用下形成的重组DNA分子，不一定能再被这两种酶识别、切割。思考1：哪两种酶切割形成的粘性末端可以用DNA连接酶连接?为什么？因为SpeⅠ和XbaⅠ产生了相同的黏性末端。教材P75黏性末端相同，就能在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子。思考2：形成的该重组DNA分子，还能被这两种酶切割吗？5.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1600；1100；300800；300A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，D序列会明显增多析典例5①获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。为了产生相同的黏性末端，便于连接分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接限制酶的选择DNA连接酶单酶切，连接的结果可能是：空载体（质粒自身环化）目的基因（自身环化物）重组质粒（正反向）（目的基因与质粒连接）√双酶切，连接的结果可能是：DNA连接酶防止目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接!重组质粒（正向连接）（目的基因与质粒连接）③一个基因从DNA分子上切下来，需要切

处，产生

个黏性末端，断

个磷酸二酯键，需要消耗

个水。24441.目的基因的筛选和获取目的基因筛选方法：从相关的

和

的基因中进行筛选已知结构功能清晰随着

的发展，以及序列数据库、序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知。测序技术目的基因的获取①从基因文库中获取②人工合成③利用PCR扩增前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。基因组文库:含有一种生物的全部基因；部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。构建cDNA文库的方法：首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组时直接使用。DNA基因1基因2基因3放大转录外显子

mRNA单链提取逆转录酶DNA单链DNA双链酶这种双链DNA是不含内含子的DNA

真核生物基因加工（剪切、拼接）内含子

内含子

（1）全称：（2）原理：（3）优点：（4）条件：（5）过程：（6）结果：聚合酶链式反应DNA半保留复制在体外短时间内可以大量扩增目的基因注：不需要解旋酶①模板：DNA母链（需含有目的基因）。②2种引物：③原料：四种脱氧核苷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）④酶：耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）⑤稳定的缓冲溶液（添加Mg2+）⑥能严格控制温度的温控设备变性、复性、延伸三步曲

利用PCR获取和扩增目的基因(常用）PCR扩增仪结合在模板链的3

′端，引导子链从5

′端到3

′端方向复制。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。每次循环DNA的量增加一倍，PCR重复多次后，呈指数形式扩增。DNA复制PCR技术场所解旋方式酶特点结果相同点PCR技术vsDNA复制①都遵循“碱基互补配对原则”②都需要“模板、4种脱氧核苷酸、酶、能量、引物DNA在高温下热变性解旋解旋酶催化半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制细胞内（主要在细胞核内）大量的DNA片段整个DNA分子耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等提醒：在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成

的原料，又可为DNA的合成提供

。DNA子链能量PCR技术基本过程3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性（退火）当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’变性复性延伸

1．PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？不相同。PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段单链RNA

2．PCR过程中需要加入两种引物，原因是？3．两种引物的要求？（了解）PCR扩增是全解旋再复制，DNA聚合酶只能从5′端向3′端延伸子链，不能从头合成，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。①引物自身不能环化②两种引物之间不能互补配对③引物长度不宜过短，防止引物随机结合

引物是一小段能与

的一段碱基序列__________的____________。DNA母链互补配对短单链核酸（通常20-30个核苷酸）作用：为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。4.PCR引物的选择在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是

。引物与模板链的

端结合。从子链的5′端向3′端延伸3′复性温度过高不利于引物和模版结合，导致扩增效率变低；复性温度过低，会造成非特异性条带增多。（1）第____代出现完整的目的基因（2）n代后，DNA

个，共消耗

个引物;含有引物A（或B）的DNA分子有

个；同时含有引物A和引物B的DNA分子有

个。（3）含有等长目的基因片段的DNA分子有

个。32n+1-22n2n-2n（6）结果：2n-12n-2如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是()A.利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶B.引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3′→5′方向延伸C.从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/16D.在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/2析典例2D（7）PCR产物的鉴定：琼脂糖凝胶电泳

①原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。③凝胶中DNA分子通过染色，可以在波长300nm的紫外灯下被检测出来在基因工程操作中,科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因表达载体,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果如图所示。以下相关叙述错误的是(

)A.电泳时,核酸的移动方向是从负极到正极B.该载体最可能为环形DNA分子C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200bpD.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同析典例3D①

;②

。2.基因表达载体的构建——核心步骤

(教材P80)启动子：位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。终止子：位于基因下游的一段有特殊序列的DNA片段终止转录1.目的使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代使目的基因能够表达和发挥作用2.组成标记基因：目的基因：复制原点：鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞目的基因必须插入到

与

之间。启动子终止子DNA复制的起始位点。DNA片段基因1

基因2

基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子知识拓展：基因结构：一段特殊结构的DNA片段，RNA聚合酶识别和结合位点，驱动转录一段特殊的DNA片段，终止转录原核生物基因重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶基因表达载体基因表达载体的构建过程：启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上实质DNA片段三个相邻碱基位置启动(终止)子起始(终止)密码子种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程花粉管通道法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法（常用）

感染植物细胞，通过转化作用，并把目的基因插入到植物细胞染色体DNA上。农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的

可整合到被侵染的细胞的

。2.转化原理：1.农杆菌的作用：T-DNATi质粒大型环状DNA农杆菌T-DNA染色体DNA上Ti质粒分析农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入

过程：第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入导入植物细胞植物组织培养指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）

将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌指含目的基因的T-DNA导入受体细胞

（非人工操作）

4.目的基因的检测与鉴定检测水平检测目的检测方法分子水平目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上目的基因是否转录出了mRNA目的基因是否翻译出蛋白质个体生物学水平转基因生物是否表现出相应的特性PCR技术/

分子杂交技术抗原—抗体杂交

抗虫、抗病的接种实验

PCR扩增技术转基因生物提取DNADNA作为模板用与目的基因相关的引物进行PCR扩增是否扩增出目的基因电泳操作①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因转基因生物提取mRNAmRNA作为模板用与目的基因相关的引物进行PCR扩增是否扩增出目的基因电泳操作双链DNA作为模板逆转录②检测目的基因是否转录出了mRNA抗原与抗体的特异性结合原理：过程：抗原—抗体杂交技术

③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带苏云金杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取

抗原抗体杂交若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。蛋白质转基因棉花实验：DNA的粗提取与鉴定戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是A.过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是

A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中

DNA分子的生理状态D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定D逆转录逆转录酶，原料是脱氧核苷酸大肠杆菌Ca2+构建重组质粒时，可选择

酶进行切割。含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？HindⅢ、SalⅠ否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏如何筛选含有目的基因的农杆菌？影印接种（不改变菌落位置）添加四环素添加氨苄青霉素添加氨苄青霉素析典例8荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。相关叙述错误的是A.引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则B.Taq酶催化子链从3'端向5'端延伸，需dNTP作为原料C.若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入63个荧光探针D.反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关B析典例PCR扩增计算求含引物1的DNA分子D重点剖析：基因工程中基因转录方向的分析BC复性温度过高不利于引物和模版结合，导致扩增效率变低；复性温度过低，会造成非特异性条带增多。基因工程应用22思考：1.培育乳腺生物反应器时为什么要将药用蛋白基因和乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件与重组在一起？2.利用乳腺生物反应器生产蛋白质，有什么局限性？如何改进？实例1：让转基因哺乳动物批量生产药物药用蛋白基因乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件基因表达载体受精卵泌乳期分泌乳汁转基因动物药物蛋白显微注射发育注意：启动子具有物种和组织的特异性——乳腺(乳房）生物反应器目的是让药用蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达，便于从乳汁中收集、分离。乳腺生物反应器的优点：

；

缺点：

。产量高、成本低；产品质量好，易提取受性别和是否处于泌乳期限制将目的基因与膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子重组，制备膀胱生物反应器，从尿液中提取。实例2：用基因工程菌生产药物1.目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，没有生物活性;酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工和修饰，有生物活性。2.与哺乳动物蛋白表达系统相比，大肠杆菌和酵母菌蛋白表达系统优势体现在哪里？

操作简单、成本低廉、繁殖周期短，可大规模进行发酵乳腺生物反应器与基因工程菌生产药物的区别项目乳腺生物反应器基因工程菌