流感病毒的红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验技术操作规范

流感病毒的红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验技术操作规

范

流感病毒的血凝素(HA)能够引起多种禽类和哺乳动物

的红细胞发生凝集，因此而得名。用于检测流感病毒滴度的

红细胞凝集试验也是根据病毒的这一特性而建立的。当血清

中特异性抗体与病毒血凝素结合后，则可以抑制红细胞凝集

的出现，即为红细胞凝集抑制试验(HI)的理论根据。

微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流

感病毒型/亚型的方法。该方法简单、易行、结果可信。用于

HI的标准参照血清必须及时更新，要包括当年的疫苗株和/

或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必须经特殊处理以

去除非特异性抑制素及非特异性凝集素°

(一)生物安全要求

生物安全要求及个人防护要求与流感病毒的分离相同，

并应遵守相应的生物安全规定。

(二)实验所用试剂

1.抗原：季节性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、

B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液

2.抗血清：经RDE或者过碘酸钾处理后的季节性

A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲

型H1N1流感病毒抗血清。

（三）其他试剂/材料/仪器（试剂盒中不包含）

1.红细胞悬液

2.PBS缓冲液，PH7.4

3.水浴箱（37℃,56℃）

4.台式离心机

5.多道可调加样器

6.离心管

7.96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用

底板，使用鸡/火鸡红细胞进行实验最好用“V”底板，"U”

底板也可使用）、可调多通道加样器、单道加样器等。

8.200ul、lOOOulTIP头、水槽

流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较

人“0”

红细胞鸡火鸡豚鼠

型血

终浓度0.50.50.750.75

孔底部

V型V型U型U型

形状

孵育时

30min30min45min60min

问

红细胞细胞沉积成点细胞沉积成点细胞沉细胞沉

沉积形状，倾斜时细胞状，倾斜时细胞积成环积成环

状向下流成泪滴状向下流成泪滴状状状

(四)流感病毒鉴定步骤

1.红细胞配置

如用火鸡、鸡的红细胞，工作液浓度为1%,如用人“0”

型、豚鼠红细胞，工作浓度为1.5%。下面介绍WHO流感参

比与合作中心提供的红细胞标定的方法：

(1)S液中的红细胞，120(h7min离心5min,弃上清。

(2)加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，1200i7min

离心5min,弃上清。

(3)PBS液体洗涤三次。最后一次洗涤后，1200r/min

离心lOmirio

(4)将红细胞稀释至合适的浓度。

注:A.S液全称为Alsever氏液。配制方法为葡萄糖2.05g、

柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加

至100mL,微热溶解，将pH值调到6.1,8磅20min高压灭

菌，4℃贮存备用。

2.流感毒株HA滴度的测定

(1)在微量血凝板的第2〜12列加入50ulPBS(PH7.4)o

(2)在第一列(Al〜G1)中加入100ul病毒悬液。

(3)H1力口入lOOulPBS,作为红细胞阴性对照。

（4）从第一列各孔吸50ul病毒液，由第1列至第12列

做2倍系列稀释，最后一列每孔弃去503。

（5）在每孔中加入503红细胞悬液，轻拍血凝板，充分

混匀。

（6）室温孵育，孵育时间见表：流感病毒红细胞凝集试

验各项条件比较。

3.HA试验结果判断

引起全部红细胞凝集为完全凝集，以记录；只有部分

红细胞凝集记录为“+/，；无凝集记录“，。血凝滴度的判定以

出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病

毒的血凝滴度。

HA滴度判定举例

病毒稀释度HA

1:1:1:1:1:11:31:61:11:21:51:101:20滴

12486242856122448度

123456789101112

A++-------2

B++++--------8

C+++++-------16

D++++++------32

E+++++++-----64

F++++++++----128

>20

G++++++++++++

48

H--------<1

4.制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原

（1）一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集

的病毒量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位

的病毒量。

（2）制备4个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集

抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每种血清做8孔稀释，

每孔用抗原25ul,则测定一份血清需0.2mL抗原。根据标准

血清的份数（本试剂盒包含5种标准血清）计算出实验所需

病毒抗原总量。

（3）其次，计算出病毒稀释度。用病毒的HA滴度除以

8,得到的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。如，某

病毒的HA滴度为64,除以8等于8,则1:8（1mL病毒液

加7mLPBS）稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原。

注：红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每

25ul病毒液中含有4个血凝单位（等于50ul病毒液中含有8

个血凝单位）。

所需抗原总量为1600ul时，4个血凝单位配置对照表

HA滴度病毒液（ul）PBS(ul)

16800800

324001200

642001400

1281001500

256501550

512251575

102412.51587.5

20486.251593.75

5.4个血凝单位抗原的复核滴定

为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准

确无误，新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。操作方法

同HA实验步骤。

如果只有前4孔出现凝集，表明每50ul病毒含有8个血

凝单位，该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。

如第5孔也出现凝集，说明每50ul病毒含有16个血凝单位,

该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50ul病毒

仅含4个血凝单位，病毒量需加倍。止匕外，4个血凝单位抗

原必须每次用前新配置。

6.红细胞凝集抑制试验(HI)鉴定未知病毒

(1)在血凝板的每孔加入25U1PBS。然后在Al—A5、

A7—All各列分别加入：抗季节性A(H1N1)流感病毒标准参

考血清、抗季节性A（H3N2）流感病毒标准参考血清、抗

B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感

病毒标准参考血清、抗新甲型H1N1流感病毒标准参考血清

25ul,A6、A12加入253PBS,作为阴性对照。用多道移液

器从A行每个孔分别取25ul,由A至H行做2倍稀释血清,

最后一行弃去25ulo

（2）Al至A5各列每孔加入25ul待检抗原（4个血凝单

位）阳性对照：A7至All各列分别加入4个血凝单位的季

节性A（H1N1）流感病毒标准参考抗原、季节性A（H3N2）流感

病毒标准参考抗原、B-Yamagata系流感病毒标准参考抗原、

B-Victoria系流感病毒标准参考抗原、新甲型H1N1流感病

毒标准参考抗原各25ul/孔。对照孔A6、A12各列加入25ul

PBS/孔。轻拍，混匀，室温孵育30min。

（3）每孔加入50ul配置好的红细胞悬液，轻拍混匀，室

温孵育30-60min,观察血凝抑制实验结果。（具体孵育时间

根据使用的不同种血球来定，详见表1。）

（4）血凝抑制效价是完全抑制血凝出现时血清的最高稀

释度的倒数。

7.鉴定结果判定

（1）标准参照血清对待检抗原的抑制效价220才可以

算为阳性。

（2）一种待检抗原不能同时被两种或两种以上的标

准血清抑制。

（3）待检抗原标准参照血清有交叉抑制，但与一种亚

型（B型流感称为系）的标准参照血清抑制效价大于其他亚

型参照血清4倍以上时，便可以判定为此种亚型的流感病毒。

（五）注意事项

1.血红细胞凝集抑制试验必须用4个血凝单位/25ul的

抗原，抗原必须新鲜配制。

2.红细胞悬液的配制必须标准化。

3.正确存放试剂，避免反复冻融及污染。

4.冻干的试剂应按照说明溶解，保存。

5.任何待检病毒与一种以上的推荐抗血清反应，滴度明

显大于20,可能的原因为：

（1）使用了不足4