榴莲蜜多糖的提取分离和结构表征

榴莲蜜多糖提取分离和结构表征目录TOC\o"1-3"\h\u1引言 11.1多糖的提取及纯化方法 11.2多糖的结构表征 32实验原理 53实验部分 53.1仪器、材料与试剂 53.1.1仪器 53.1.2试剂 63.2实验方法 73.2.1样品的预处理 73.2.2榴莲蜜多糖和蛋白质标准曲线的建立 73.2.3多糖的提取与含量测定 83.3单因素实验 83.4榴莲蜜多糖的分离纯化 93.5榴莲蜜多糖红外表征 103.6响应面法优化多糖提取工艺 103.6.1模型拟合和统计分析 103.6.2响应曲面图分析 113.6.3最佳条件的确定与模拟验证 134结果与讨论 134.1单因素实验结果 134.1.1超声时间对榴莲蜜多糖提取率的影响 134.1.2超声功率对榴莲蜜多糖提取率的影响 144.1.3料液比对榴莲蜜多糖提取率的影响 144.2多糖提取 154.2.1蛋白质去除率 154.2.2多糖提取率 154.2.3DE-52纤维柱洗脱结果 164.2.3葡聚糖凝胶G-200洗脱结果 164.2.4榴莲蜜多糖的电子显微镜结果 174.2.5榴莲蜜多糖红外表征 175结论 18参考文献 19致谢 21摘要：本实验选用海南本地榴莲蜜，使用超声微波法提取榴莲蜜多糖，通过响应曲面法优化超声提取法的最佳条件。采用Sevage法除蛋白,先后采用DEAE-52纤维柱和Sephadex葡聚糖凝胶柱分离纯化得到最高组分LG-M。采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法测得榴莲蜜多糖提取率和除蛋白率。使用SEM观察组分LG-M表面。通过红外光谱确定提取物为榴莲蜜多糖。关键词:榴莲蜜多糖，超声提取法，Sevage除蛋白法，响应曲面法1引言榴莲蜜（图1），又称尖蜜拉、小木菠萝、尖百达，为桑科木菠萝属稀有热带水果REF_Ref10523\r\h[1-2],榴莲蜜主要产于东南亚地区，如马来西亚、印度尼西亚和泰国等。其果肉可口、风味独特、香味浓郁,外形和菠萝蜜相似,其单果大小适中，风味较菠萝蜜更好REF_Ref10954\r\h[4]。通过各种研究表明,榴莲蜜果肉中含有各种丰富的营养物质如维生素、膳食纤维、碳水化合物和蛋白质等REF_Ref10850\r\h[3]。图SEQ图\*ARABIC1榴莲蜜榴莲蜜种子富含碳水化合物、蛋白质、纤维和矿物质，可以用来煮、烤或者油炸食用。榴莲蜜不仅人可以食用动物也可以，所以有些地方用榴莲蜜的叶子和果肉来喂养动物。榴莲蜜果树大且粗壮，人们利用榴莲蜜果树的枝干来建造房屋和木制家具等。有研究表明榴莲蜜的叶子中可以提取一种具有抗疟疾特性的碳氢化合物，即二苯乙烯REF_Ref11363\r\h[1]，为人类健康和生活质量的提高做出贡献。1.1多糖的提取及纯化方法多糖是一类复杂的天然高分子化合物，广泛存在于动植物和微生物中，榴莲蜜多糖是一种从榴莲蜜中提取出来的天然多糖化合物。菠萝蜜多糖也是一种从菠萝蜜中提取出来的天然糖化合物。研究发现菠萝蜜多糖具有显著的抗氧化活性REF_Ref20775\r\h[19]，而且菠萝蜜多糖还有体外免疫调节和抗炎效果REF_Ref20602\r\h[5]。榴莲蜜作为菠萝蜜同一科属的植物，为了探究它的活性我们需要找到最佳的提取方案。目前多糖主要的提取方法有超声辅助提取法、热水提取法、酶解法等。多糖超声波提取是一种新型的生物技术，用于提取和纯化多糖类物质。其原理是通过超声波的物理作用，打破细胞壁，释放出细胞内的多糖成分，并通过一系列的分离纯化技术，得到高纯度的多糖。杨等REF_Ref11601\r\h[6]人所在的研究小组在提取废弃姜叶多糖时，通过对比其他方法发现超声波对产量的贡献高于微波。林等REF_Ref29704\r\h[7]人在对\t"/paper/1674555123499253760/_blank"沙田柚皮多糖提取及性质研究中以沙田柚皮为原料，分别采用热水提取法和超声波辅助酶法提取多糖。在比较不同方法下发现与传统热水法提取相比，超声辅助酶提取的多糖的产率更高。因此与传统的方法相比，多糖超声波技术具有许多优点，如操作简便、提取效率高、对目标成分的活性影响小等。多糖超声波技术还可以与其他分离纯化技术结合使用，进一步提高多糖的纯度和产率。多糖超声波技术是一种新型的生物技术，具有广泛的应用前景。通过该技术，我们可以快速、高效地提取和纯化各种多糖物质，为科学研究、药物开发、食品加工等领域提供重要的技术支持。多糖热水提取法多被人们用于植物的多糖提取。多糖热水提取法的原理是利用热水对植物细胞的溶解作用。在热水的作用下，植物细胞壁被溶解受到破坏，细胞内的多糖成分析出。同时，热水浸提过程中还可以通过搅拌、超声波等手段增强多糖的溶解效果。溶解后的多糖可以通过离心、过滤、沉淀等方法进一步分离纯化。多糖热水浸提法被广泛应用于提取各种植物中的多糖成分。王等REF_Ref29838\r\h[8]人在螺旋藻提取试验中用了热水提取（方法1）、碱提取（方法2）、超声波辅助提取（方法3）和冻融提取（方法4）4种提取方法来比较提取率、多糖含量和蛋白质含量（如图1）。由图可知热水浸提法水提取率取最低但多糖含量第二，且热水法不需要特殊设备，与传统的有机溶剂提取法相比，多糖热水浸提法具有操作简便但效率比其他设备低，成本低廉、对环境友好等优点。图2四种方法的提取率、多糖含量和蛋白质含量酶解法是利用酶的催化作用，使细胞壁中的纤维素和果胶等成分分解为可溶性物质，从而有利于多糖的提取。王等REF_Ref11921\r\h[9]人提取大麦叶多糖时对比了六种方法获得的提取率（如图2，HW-热水;HPS-高压蒸汽;EA-碱性萃取;XE-木聚糖酶取;CE-纤维素酶萃取;XCE-混合木聚糖酶和纤维素酶萃取）。一般来说,与化学和物理提取方法相比,酶提取方法的总提取率明显更高。所以酶解法可以提高提取效率，减少时间和成本。图3六种方法的提取率多糖的纯化可以用纤维素柱层析法，凝胶柱层析法等。凝胶过滤层析法是利用凝胶作为固定相，将多糖进行分离纯化。这种方法可以有效地去除杂质，提高产品的纯度。李等REF_Ref12728\r\h[18]人通过乙醇沉淀，阴离子交换和凝胶过滤层析法，从新型盐藻的高盐发酵液中成功制备了一种新型的胞外多糖。离子交换层析法是利用离子交换树脂作为固定相，根据离子的大小进行分离纯化。王所在的课题组就是采用膨胀床吸附柱结合离子交换层析法从疣状江蓠中分离纯化R-藻红蛋白可有效解决藻胆蛋白分离纯化过程中多糖堵塞色谱柱的问题REF_Ref30129\r\h[10]。亲和层析法是利用蛋白质或其他生物分子与目标多糖之间的相互作用关系进行分离纯化。J等REF_Ref12065\r\h[11]人在研究幽门螺杆菌脂多糖抑制胃生长抑制素受体时，采用亲和层析法从溶解的上皮细胞膜中纯化了生长抑素受体，测定结果表明脂多糖对受体-生长抑素结合呈剂量依赖性抑制，最大抑制率达到94.1%。这种方法能够获得高纯度和高收率的单一多糖组分。1.2多糖的结构表征多糖，作为一种生物大分子，由众多单糖分子经糖苷键相互连接而成，其结构层次丰富，涵盖一级至四级结构。糖苷键的种类繁多，包括α-1,4-苷键、β-1,4-苷键和α-1,6-苷键等，它们能够形成直链或支链结构。具体来说，直链结构主要由α-1,4-苷键（如淀粉）和β-1,4-苷键（如纤维素）连接而成；而支链结构则主要依赖于α-1,6-苷键REF_Ref12871\r\h[12]的连接作用。这样的结构特点使得多糖在生物内具有多种功能和应用价值。图4α-1,6-苷键多糖的一级结构是由单糖的种类、排列顺序和多糖链长度（多糖链的长度是指单糖的数量）来决定的。赵等REF_Ref13328\r\h[13]人在多糖单糖组分抗氧化性能实验中，研究发现单糖的组成和糖基键的类型对多糖的抗氧化性产生调控作用，多糖的抗氧化性质受到组合物中不同单糖比例的影响。因此，多糖中单糖的数量决定了多糖的聚合度，即多糖链的长度，从而影响了多糖的整体性质。此外，单糖的排列顺序也决定了多糖的立体构型和性质。例如直链淀粉和支链淀粉（如图4）就是因为单糖排列顺序不同导致它们的理化性质和生物学功能也存在显著差异REF_Ref12959\r\h[14]。图5直链淀粉和支链淀粉两种结构多糖的二级结构，作为在一级结构基础上形成的特定空间构象，展现出多样化的形态。其主要包括螺旋结构、折叠结构以及扭曲结构等多种形态。这些结构特点共同决定了多糖的生物活性和功能表现，为其在生物学领域中的深入研究与应用提供了重要基础。FormanekREF_Ref13178\r\h[15]等人在对细胞壁肽聚糖的三维研究中发现其是螺旋结构的。在螺旋结构中，多糖链呈螺旋状排列，形成稳定的三维空间构象。RREF_Ref13404\r\h[16]所在的课题组发现鼠李半乳糖醛酸具有折叠结构。在折叠结构中，多糖链呈折叠状排列，形成较为稳定的空间构象。KREF_Ref13446\r\h[17]等发现蓝藻多糖可以从纳米级到微米级以扭曲纤维的形式自组装能够在蒸发的空气-水界面处灵活地转换为二维蛇形和三维扭曲结构（如图5）。图6蓝藻多糖的二维蛇形和三维扭曲结构在扭曲结构中，多糖链呈不规则扭曲状排列，形成较为松散的空间构象。扭曲结构的形成与多糖分子中的熵效应相互作用有关。多糖结构的多样性赋予多糖生物功能，在细胞相互作用、免疫调节、药物研发和生物工程等领域中具有关键作用，推动着深入理解生命过程和创新科学应用的发展。2实验原理本实验选用海南本地特色榴莲蜜作为实验材料，通过采用超声提取法与醇沉法相结合的手段，有效提取了榴莲蜜中的多糖成分。接着，运用响应曲面法，对提取工艺进行了细致的优化，以确保多糖提取的高效性。为了进一步提高多糖的纯度，本实验采用了Sevage法去除多糖中的蛋白质杂质。随后，通过纤维柱对多糖进行了初步分离，并利用Sephadex葡聚糖凝胶G-200进行深度纯化，从而获得了更为纯净的多糖组分。为了准确评估多糖提取与蛋白质去除的效果，本实验利用硫酸-苯酚法和考马斯亮蓝法分别检测了多糖提取率和蛋白质去除率。最后，借助紫外、红外等先进仪器，对多糖的结构进行了全面的鉴定，为后续研究提供了有力的数据支持。3实验部分3.1仪器、材料与试剂3.1.1仪器表1主要仪器仪器设备型号生产厂家紫外-可见分光光度计UV-2700日本岛津公司冷冻干燥机LGJ-10北京四环科学仪器厂有限公司数显恒温水浴锅HH-1江苏智博瑞仪器制造有限公司超声波清洗仪XO-5200DS南京先欧仪器制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A上海申贤恒温设备厂电子天平TP-214丹佛仪器（北京）有限公司旋转蒸发器RE-52AA上海亚荣生化仪器厂循环水式多用真空泵SHZ-D(Ⅲ)河南省予华仪器有限公司恒流泵HL-2D上海青浦沪西仪器公司3.1.2试剂表2主要试剂试剂型号生产厂家石油醚AR国药集团化学试剂有限公司95%乙醇AR国药集团化学试剂有限公司浓硫酸AR广州化学试剂厂葡萄糖AR国药集团化学试剂有限公司苯酚AR国药集团化学试剂有限公司三氯乙烷AR国药集团化学试剂有限公司牛血清蛋白AR国药集团化学试剂有限公司溴化钾AR国药集团化学试剂有限公司葡聚糖凝胶G-200索莱宝生物科技有限公司纤维素填料DEAE-52索莱宝生物科技有限公司考马斯亮蓝G-250国药集团化学试剂有限公司透析袋MW3500国药集团化学试剂有限公司氯化钠AR国药集团化学试剂有限公司氯化氢AR国药集团化学试剂有限公司正丁醇AR国药集团化学试剂有限公司3.2实验方法3.2.1样品的预处理将榴莲蜜果肉去皮去核后用超纯水冲洗干净之后切小块称量，装入不锈钢盒中于冷冻干燥机中冻干12小时。将充分干燥的榴莲蜜果肉加入乙醇打碎浸泡8h以上去除色素，然后将去除色素的榴莲蜜果肉装入索式提取器中用石油醚对其进行脱油，再将其冻干得到粉末状粗样。3.2.2榴莲蜜多糖和蛋白质标准曲线的建立本实验首先采用苯酚-硫酸法对榴莲蜜多糖的总含量进行了测量。具体步骤为：首先，使用移液枪精确量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的0.1mg/ml葡萄糖标准溶液，分别置于七个经过洗净烘干的比色管中。接着，向每个比色管中加入适量的蒸馏水，确保每管中溶液总体积均为1ml。随后，再次使用移液枪向每个比色管中加入1ml新制的5%苯酚溶液和2.5ml浓硫酸。以未加入葡萄糖标准溶液的比色管作为参照，测定其余比色管中溶液在490nm处的吸光度。最后，根据测量数据绘制葡萄糖标准溶液与吸光度的标准曲线，以此确定榴莲蜜多糖的总含量。榴莲蜜多糖的蛋白质含量测定，本实验采用了考马斯亮蓝法。首先，配置了0.1mg/ml的牛血清蛋白溶液。然后，使用移液枪准确量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml新制的牛血清蛋白溶液，分别加入七个洗净干燥的比色管中。随后，向每个比色管中加入蒸馏水，使每管中溶液总量达到1ml。接着，向每个比色管中加入5ml考马斯亮蓝溶液，并立即摇匀，静置10分钟。以未加入0.1mg/ml牛血清蛋白溶液的比色管作为参比，测定其他六个比色管中溶液在595nm处的吸光度。最后，根据测量数据绘制牛血清蛋白溶液与吸光度的标准曲线，以此确定榴莲蜜多糖的蛋白质含量。3.2.3多糖的提取与含量测定采用超声法提取榴莲蜜多糖。将脱油处理后的榴莲蜜粉末精确称量100g，置于锥形瓶中。按照1:20的料液比例，加入适量的蒸馏水。随后，在超声作用下，设定温度为50℃，功率为600w，持续时间为2小时进行提取。完成超声提取后，将混合液以6000转/秒的速度离心10分钟。离心后，收集上清液，转移至茄形瓶中，并通过旋蒸技术将其浓缩至原体积的五分之一。接着，向浓缩液中加入其体积四倍的95%乙醇，并在4℃条件下静置12小时。随后，通过抽滤操作去除杂质，最后采用冷冻干燥法，得到榴莲蜜粗多糖。本实验采用Sevage法除去榴莲蜜多糖中的蛋白质。取醇沉干燥后的榴莲蜜粗多糖溶于1000ml锥形瓶中，按5:1（v/v）的比例加入Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4:1，多糖：正丁醇=5:1），用保鲜膜封口并放入震荡箱中以转速120r/min震荡30min，取上层清液，继续按比例加入Sevage试剂，重复操作5次后取上层清液装入1500M的透析袋中透析12h，透析期间换水5次，得到榴莲蜜除蛋白粗多糖。为了测定榴莲蜜粗多糖的蛋白质去除率，首先我们使用移液枪精确量取1ml的榴莲蜜粗多糖，然后将其置于比色管中。接着，向比色管中加入5ml的考马斯亮蓝试剂，并迅速摇动以混合均匀。之后，将混合液静置10min，以便让试剂充分反应。随后，我们测量混合液的吸光度，并参照先前绘制的牛血清蛋白与吸光度的标准曲线，通过比对计算得出榴莲蜜粗多糖的蛋白质去除率。这一过程确保了测量结果的准确性和可靠性。3.3单因素实验首先，我们使用电子天平精确称量5g经过脱油处理的榴莲蜜粉末，按照料液比1:20mg/ml的比例添加蒸馏水。随后，在设定的提取温度50℃下，以提取功率600w进行提取，分别控制提取时间为1小时、2小时、3小时和4小时，以探究提取时间对榴莲蜜多糖提取效果的影响。接着，我们再次称取5g脱油榴莲蜜粉末，同样按照料液比1:20的比例添加蒸馏水。这次，我们在保持提取温度50℃和提取时间2小时不变的情况下，分别调整提取功率为200W、300W、400W、500W和600W，以探究提取功率对多糖提取效果的影响。最后，我们继续采用电子天平准确称取5g去油榴莲蜜粉末，并设定提取功率为600W，提取温度为50℃。此次实验中，我们改变料液比，分别以1:20、1:30、1:40、1:50和1:60的比例添加蒸馏水，保持提取时间为2小时，以分析不同料液比对榴莲蜜多糖提取效率的影响。3.4榴莲蜜多糖的分离纯化纤维素预处理：将干燥的纤维素置于蒸馏水中浸泡24小时，以充分溶胀。随后，用0.5mol/L的HCl溶液浸泡30分钟，紧接着用蒸馏水浸泡10分钟，并多次更换蒸馏水，共浸泡五次，直至溶液的pH值接近7。接下来，用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡30分钟，并再次用蒸馏水浸泡五次，每次更换新的蒸馏水，直至溶液的pH值再次达到约7。这样的处理过程确保了纤维素的酸碱度达到所需范围，为后续实验提供了合适的条件。将经过处理的纤维素放入大锥形瓶中用蒸馏水溶解浸泡，然后用玻璃棒搅拌均匀后缓慢的倒入层析柱（26×56mm）。纤维素柱层析：准确吸取5ml榴莲蜜除蛋白多糖样品加入层析柱，等样品进入层析稳定后依次加入100ml蒸馏水和100ml的NaCl溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L)控制速度在1ml/min,每管5ml。利用硫酸-苯酚法对第1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110管中多糖的含量进行测定，用测得的数据绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线的峰值分别收集洗脱液进行浓缩、透析、冷冻、干燥获得初步分离的榴莲蜜多糖组分。葡萄糖凝胶预处理：将干燥的SephadexG-75/200葡聚糖凝胶粉末用蒸馏水浸泡24h使其充分溶胀仅可以用玻璃棒缓慢搅拌防止凝胶颗粒破损，采用湿法装柱法将处理好的葡聚糖凝胶用蒸馏水溶解缓慢倒入层析柱(2.6*80)，期间要避免出现气泡和流干水分，层析柱装好后用蒸馏水平衡过夜。葡萄糖凝胶柱层析：将纤维素柱收集经过浓缩透析的榴莲蜜多糖利用胶头滴管沿柱壁缓慢加入，等到其在葡萄糖凝胶柱中稳定后依次加入100ml蒸馏水和100ml的NaCl溶液（0.1、0.2、0.3mol/L），控制速度为1ml/min，每管5ml。用硫酸-苯酚法对第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78管中多糖含量进行检测，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线峰值分别收集洗脱液后浓缩、冷冻、干燥获得榴莲蜜纯多糖。3.5榴莲蜜多糖红外表征将1mg所得的榴莲蜜多糖与KBr一起混合研磨然后压片，对其进行红外吸收进行测定。3.6响应面法优化多糖提取工艺3.6.1模型拟合和统计分析根据单因素试验结果，超声时间、超声频率和料液比对榴莲蜜果肉多糖提取率的影响更显著，所以选择这三个因素作为响应面法优化超声波辅助提取榴莲蜜果肉多糖的自变量。Box-Behken试验设计和实验数据列于表3中，通过对表3的数据进行线性拟合得到榴莲蜜果肉多糖的二次多项回归模型方程：表3Box-Behken试验设计和结果功率/W时间/h料液比提取率40025016.43502401830014016.235024018.130034017.335033015.135024018.240014016.235013015.630023017.140034016.135024018.140023016.335035015.830025016.2535015015.335024018榴莲蜜果肉多糖模型的方差分析结果详见于表4，其中模型的显著性通过F值和P值共同评估。具体来说，F值的大小与模型的显著性呈正相关，而P值则与之呈负相关。观察表4中的数据，我们可以发现榴莲蜜果肉多糖模型的F值高达51.08，同时P值小于0.0001，这充分证明了该模型的显著性极高。通过失拟项、决定系数（R2）和调整后决定系数（R2adj）对模型的拟合程度进行评价。榴莲蜜果肉多糖模型的失拟项大于0.05，R2为0.9850，R2adj为0.9657表明模拟和程度较好，实验值与预测值之间的关联程度比较高。果肉的C.V.%为1.15，说明实验具有精确性和可靠性。表4榴莲蜜果肉多糖回归模型方差分析平方和自由度均方F值P值模型17.1591.9151.08<0.0001A-功率0.427810.427811.470.0117B-时间0.245010.24506.570.0374C-料液比0.070310.07031.880.2121AB0.360010.36009.650.0172AC0.225610.22566.050.0435BC0.090010.09002.410.1643A20.526910.526914.120.0071B27.2917.229195.55<0.0001C26.6216.62177.42<0.0001残差0.261170.0373失拟项0.153130.05101.890.2724纯误差0.108040.0270总误差17.4116C.V（%）=1.15R2=0.9850adjR2=0.96573.6.2响应曲面图分析响应曲面图采用三维图形技术，将二次回归模型方程直观地呈现出来，使我们能够清晰地观察到各因素交互作用对响应值的影响。若等高线形态更倾向于椭圆形，则表明两种因素间的交互作用显著。根据图7所示，在C（料液比）保持恒定的情况下，随着B（时间）的增加，榴莲蜜多糖提取率先是上升而后下降；同时，随着A（功率）的增加，提取率虽然也有所上升，但变化幅度相对较小。这一现象表明，时间在榴莲蜜多糖的提取过程中扮演着至关重要的角色。再观察图8，当A（功率）保持固定时，随着C（料液比）和B（时间）的增加，榴莲蜜多糖提取率均呈现出先上升后下降的趋势。然而，与C（料液比）相比，B（时间）的变化对提取率的影响更为显著，进一步印证了时间在提取过程中的重要性。图9则展示了在B（时间）保持恒定的情况下，随着C（料液比）的增加，榴莲蜜多糖提取率持续上升后逐渐放缓；同时，随着A（功率）的增加，提取率也呈现缓慢上升后缓慢下降的趋势。这显示出料液比在提取过程中同样具有不可忽视的影响。综合以上分析，我们可以得出以下结论：各因素对榴莲蜜多糖提取率的影响程度依次为时间、料液比和功率，这一结果与果肉回归模型的方差分析结果相吻合。此外，根据等高线的形态，我们还可以推断出时间与功率之间以及料液比与功率之间的交互作用对榴莲蜜多糖提取率具有显著的影响。图7A（功率）和B（时间）对榴莲蜜多糖提取率影响的响应面与等高线图8B（时间）和C（料液比）对榴莲蜜多糖提取率影响的响应面与等高线图9A（功率）和C（料液比）对榴莲蜜多糖提取率影响的曲面图与等高线3.6.3最佳条件的确定与模拟验证我们通过响应面分析法得到榴莲蜜多糖的最佳条件为超声功率365.78W，液料比47.90mL/g，超声时间1.60h，预测值为18.89%；根据实际情况对参数进行修正，修正后榴莲蜜多糖的最佳条件为超声功率360W，液料比48mL/g，超声时间1.5h。按最佳工艺参数进行三次平行实验，得到榴莲蜜多糖实际得率为19.02%，与预测值接近，说明模型可靠。4结果与讨论4.1单因素实验结果4.1.1超声时间对榴莲蜜多糖提取率的影响称取5份5g去油榴莲蜜粉末，其他条件相同，分别在提取时间为1h、2h、3h、4h的条件下提取榴莲蜜多糖。通过观察图9我们可以发现在其他条件相同时榴莲蜜多糖提取率随超声时间先上升后下降，最佳的超声时间为2h。超过2h榴莲蜜多糖提取率下降原因是超声时间过长导致部分榴莲蜜多糖水解使得多糖提取率下降。图9超声时间对榴莲蜜多糖提取率的影响4.1.2超声功率对榴莲蜜多糖提取率的影响称取5份5g去油榴莲蜜粉末，其他条件相同，分别以功率200W、300W、400W、500W、600W对榴莲蜜多糖进行提取。如图10所示，榴莲蜜多糖提取率随超声功率的上升先上升后下降，最佳超声功率为400W。分析其原因是因为随着超声功率的不断增加，使榴莲蜜细胞破坏程度增加，榴莲蜜细胞内物质渗出加快，榴莲蜜多糖提取率增加。但功率过大时，榴莲蜜细胞会被彻底破坏有许多除多糖外杂质溶出导致提取率下降。图10超声功率对榴莲蜜多糖提取率的影响4.1.3料液比对榴莲蜜多糖提取率的影响称取5份5g去油榴莲蜜粉末，其他条件相同，分别以料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60添加蒸馏水提取榴莲蜜多糖。通过图11可知随着料液比的增加榴莲蜜多糖提取率先上升后下降，最佳料液比为1:40。这是因为在果肉细胞与溶剂充分接触时，多糖会更容易溶出，但在溶剂浓度过高时，多糖的扩散速率会下降。图11料液比对榴莲蜜多糖提取率的影响4.2多糖提取4.2.1蛋白质去除率蛋白质溶液的标准曲线如图12所示，它的线性回归方程为Y=0.42863x-0.04104，R2=0.99076蛋白质去除率的计算公式：蛋白质去除率（%）=P1为蛋白质去除前蛋白质的含量，P2为蛋白质除去后蛋白质的质量。通过计算得除蛋白质的去除率为94.4%。图12蛋白质标准溶液标准曲线4.2.2多糖提取率0.1mg/mL的无水葡萄糖溶液标准曲线如图13所示，它的线性回归方程为Y=0.67101x-0.12131，R2=0.99074。多糖提取率的计算公式：多糖提取率（%）=C∗V∗N在式中，C为榴莲蜜多糖浓度（mg/mL）V为榴莲蜜多糖溶液体积（mL），N为稀释倍数，m为预处理榴莲蜜样品质量（mg）。计算得出榴莲蜜多糖多糖提取率为18.8%。图13多糖标准曲线4.2.3DE-52纤维柱洗脱结果图14为纤维素柱层析洗脱曲线，峰越高糖含量越多，所以收集图中最高峰的洗脱液LD-M,进行旋蒸浓缩，然后将旋蒸浓缩后的溶液放入超纯水中透析。图14DE-52纤维素柱洗脱曲线4.2.3葡聚糖凝胶G-200洗脱结果图15为凝胶柱层析洗脱曲线，收集图中最高峰的洗脱液LG-MN，将收集到的洗脱液进行旋蒸浓缩，然后将浓缩液放入透析袋中于超纯水中进行透析，将透析液冷冻干燥获得榴莲蜜纯多糖（LG-MN）。图15葡聚糖凝胶G-200洗脱曲线4.2.4榴莲蜜多糖的电子显微镜结果图16图A（放大500倍）图B（放大3000倍）LG-MN的表面形态如图16所示。从扫描电子显微镜可以看出，LG-MN在放大500倍时呈现棒状和块状的簇状结构(图16A)。在3000倍放大下，LG-MN表面为光滑的棒状结构具有很好的空间间隙(图16B)。4.2.5榴莲蜜多糖红外表征LG-MN的红外光谱如图17所示，3421.56cm-1处的强宽吸收峰为O-H的伸缩振动，2922.94cm-1处的吸收峰是因为C-H键的伸缩振动。1653.33cm-1和1636.05cm-1处的峰是C=O拉伸振动引起的。1419.53cm-1、1350.65cm-1和1270.27cm-1处三个吸收峰是C-H的变角振动引起的吸收峰。1154.04cm-1、1107.15cm-1和1017.08cm-1处的峰可能是C-O的不对称拉伸引起的。761.93cm-1处的吸收峰为D-吡喃环的伸缩振动[20]，说明LG-MN是一种含有D-吡喃环的多糖。图17LG-MN的红外光谱图5结论本文优选海南本地榴莲蜜，通过响应曲面法对超声提取法的条件进行优化得到最佳提取功率：360W、时间：1.5h、液料比：44.8mL/g，发现其中最主要的影响因子是超声作用的功率。并利用硫酸-苯酚法及考马斯亮蓝法测得榴莲蜜多糖提取率与蛋白质去除率分别为18.8%和94.4%。通过DEAE-52和葡聚糖凝胶-G200对其分离纯化最后收集含量最高的组分LG-MN。通过组分的SEM图像发现榴莲蜜多糖在3000倍放大下表面是光滑的棒状结构且具有很好的空间间隙。在红外谱图中发现LG-MN多糖具有D-吡喃环结构。参考文献Integer《MonacoNatureEncyclopedia》农业部发展南亚热带作物办公室编．中国热带南亚热带果树董宝宝译《榴莲蜜变温间歇干燥干燥技术与设备》张翠玲，文慧婷《尖蜜拉的快繁技术》朱科学，谭乐和，张彦军，贺书珍，徐飞《菠萝蜜果肉中多糖免疫调节作用及其机制研究》JingchunYang,ShuaiyiDong,XuZhou,WenZhang,YunzhuGu，LixueZheng,GuihongYang,JingWang,YangZhang《PolysaccharidesfromwasteZingibermiogaleaves:Ultrasonic-microwave-assistedextraction,characterization,antioxidantandanticoagulantpotentials》panelBoboLin,ShashaWang,AnqiZhou,QiuruiHu,GangliangHuang《Ultrasound-assistedenzymeextractionandpropertiesofShatianpomelopeelpolysaccharide》王冰月，刘钱，黄杨红《\t"/paper/1212921083173085192/_blank"螺旋藻多糖的提取及其活性评价》王明明，张庄庄，徐玉庭，孟庭马，天明市，井中泉《六种提取方法对青大麦叶多糖分子组成和抗氧化活性的影响》LongzhanGan,XiaoguangLi,HemingZhang,RuoshiZhang,HongbinWang,ZheXu,BiyuPeng,YongqiangTian《Preparation,characterizationandfunctionalpropertiesofanovelexopolysaccharideproducedbythehalophilicstrainHalomonassaliphilaLCB169T》王广哲《藻藻素的分离纯化属通过膨胀床吸附和