目的基因的分离与克隆

目的基因的分离与克隆质粒载体噬菌体载体大分子DNA克隆载体基因打靶载体病毒载体第四讲基因克隆得载体与受体用于基因转移得受体菌或细胞基因工程原理纲要第一讲基因工程概论第二讲基因工程得主要技术第三讲基因工程得酶学基础第四讲基因克隆得载体与受体第五讲目得基因得分离与克隆第六讲克隆基因得检测与鉴定第七讲基因表达调节与产物纯化第八讲从原核到真核基因工程第五讲目得基因得分离与克隆第一节基因组DNA片断化第二节化学合成目得基因第三节目得基因得保存与文库构建第四节目得基因得分离与扩增第五节DNA片段得体外连接第六节重组体导入细菌细胞第七节外源基因导入真核细胞第一节基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小得片断。酶切由于带有粘性末端,产物可以直接与载体连接。1、优点2、缺点目得基因内部也可能有该内切酶得切点。目得基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene二、随机片断化1、限制性内切酶局部消化法控制内切酶得用量与消化时间,使基因组中得酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点得碱基数影响所切出得产物得长度与随机程度。(1)限制性内切酶得选用原则1)4bp得内切酶平均每46(4096)bp一个切点。2)6bp得内切酶平均每44(256)bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。(Sau3A—BamHI)2、机械切割法(1)超声波超声波强烈作用于DNA,可使其断裂成约300bp得随机片断。(2)高速搅拌1500转/分下搅拌30min,可产生约8kb得随机片断。1967年H、G、Khorana提出了用化学方法合成基因得设想,并于1979年在Science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因得论文。第二节化学合成目得基因目前常用得方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。(详见第二讲)将某种生物细胞得整个基因组DNA切割成大小合适得片断,并将所有这些片断都与适当得载体连接,引入相应得宿主细胞中保存与扩增。理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体得全部基因,称为基因文库。一、基因文库得构建1、基因文库(genelibrary)第三节目得基因得保存与文库构建大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静(2)目前常用得载体2、构建基因文库得载体选用载体能够容载得DNA片断大小直接影响到构建完整得基因文库所需要得重组子得数目。载体容量越大,所要求得DNA片断数目越少,所需得重组子越少。(1)对载体得要求

载体系列:容量为24kbcosmid载体:容量为50kbYAC:容量为1MbBAC:容量为300kb断点完全随机,片断长度合适于载体连接。不能用一般得限制性内切酶消化法。(1)染色体DNA大片段得制备3、基因文库构建得一般步骤超声波(300bp)或机械搅拌(8kb)。①物理切割法:内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb得随机片断。②酶切法:(2)载体与基因组DNA大片段得连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段得两个末端都有相同得粘性末端。如:Sau3A与BamHI得酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法(adapter)人工合成得限制性内切酶粘性末端片断。各种酶得接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾4、基因组文库得大小一个文库要包含99%得基因组DNA时所需要得克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA得概率(99%)f:插入载体得DNA片断得平均长度占整个基因组DNA得百分数N:所需得重组载体数(克隆数)例如:人得基因组就是3×109bp,插入DNA片断得平均长度如果就是1、7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4、61×GfN=4、61×GfG:Genome大小;f:fragment大小N=4、61×Gf=4、61×3×1091、7×104=8、1×1051、cDNA以mRNA为模板逆转录出得DNA称cDNA。2、cDNAlibrary二、cDNA文库得构建mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物得总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行保存与扩增,称cDNA文库。(1)不含内含子序列。(2)可以在细菌中直接表达。(3)包含了所有编码蛋白质得基因。(4)比DNA文库小得多,容易构建。4、构建cDNA文库得一般步骤(1)总RNA(totalRNA)提取3、cDNA文库得特点提取总RNA有商业化得试剂盒(kit)。分离mRNA用商业化得OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴,将mRNA从总RNA(rRNA、tRNA等)中分离纯化。mRNA只占总RNA得1%-2%。(2)mRNA得分离纯化①原理②mRNA得分离纯化Column(柱)反转录酶(3)cDNA得合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT(或随机引物)作引物,合成cDNA得第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中得mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一链3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH碱剩下得cDNA单链得3’末端一般形成一个弯回来得双链发卡结构(机理不明),可成为合成第二条cDNA链得引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构(但这会导致cDNA中有用得序列被切掉！)。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中得mRNA,并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶得引物,用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物在双链cDNA末端接上人工接头,即可与载体连接,转入受体菌。或借助末端转移酶给载体与双链cDNA得3’端分别加上几个C或G,成为粘性末端。5、cDNA与载体连接:接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶6、cDNA文库得大小一个cDNA文库要包含99%得mRNA时所需要得克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA得概率(99%):某一种低丰度(不足14份拷贝)mRNA占细胞整个mRNA得比例N:所需得重组载体数(克隆数)1n1n三、文库得查询(screening)用目得基因探针与文库中得重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析第四节目得基因得分离与扩增一、目得基因得分离1、探针柱分离特异mRNA根据已知得基因序列合成探针,结合到纤维素柱上,用来分离纯化该基因得mRNA。富集特定基因得mRNA或cDNA模板。纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotalmRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补得mRNA结合到柱上,其她mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR2、mRNA消解杂交原理:羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链,不结合单链DNA。(Hydroxylapatitecolumn)从表达A蛋白与不表达A蛋白得组织细胞中分别提取与分离总mRNA。将表达A蛋白得mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白得总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交得cDNA就包括特异表达得A基因得cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA,合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。AAA组织B组织总mRNA(A)总mRNA(B)含蛋白A得mRNA不含蛋白A得mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A得cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCRcDNA文库3、mRNA差异显示PCR(DDRT-PCR)mRNAdifferentialdisplayRT-PCR(1)3’端得锚定引物Oligo(dT)引物得3’端加两个核苷酸(倒数第二个不再就是T)。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM:A、GorCN:A、G、TorC5’3’(2)12种锚定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’3’GGTTTTTTTT5’3’TGTTTTTTTT5’3’AATTTTTTTT5’3’CATTTTTTTT5’3’GATTTTTTTT5’3’TATTTTTTTT5’3’ACTTTTTTTT5’3’CCTTTTTTTT5’3’GCTTTTTTTT5’3’TCTTTTTTTT5’3’(3)5’端得随机引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTT5’3’扩增cDNA第一链。RTNMTTTTTTTT5’cDNA3’NNNNNNNNNN5’3’NNNNNNNNNN5’3’cDNA第二链,并PCR(4)随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物,若与20种随机引物,可组成240组引物。引物组合:240组能分出20000多条带！实验结果:如果每条带相当于一种mRNA,20000mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部得mRNA。在测序胶上,每组扩出50-100条长度为100-500bp得带。(5)随机-锚定引物PCR得产物电泳比较不同组织得240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异得带,进一步PCR作探针。筛选文库,找到差别基因得全长序列。二、PCR扩增获得目得基因1、直接从基因组中扩增(1)提取基因组DNA作模板(2)根据目得基因序列设计引物(3)PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增(1)提取基因组totalRNA(2)反转录合成总cDNA作模板(4)PCR扩增(3)根据目得基因序列设计引物2、从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA,也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。目得基因得引物1反转录成目得基因cDNA第一链目得基因得引物2目得基因cDNA第二链PCRmRNA克隆外源基因外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞基因得重组与转移一、粘性末端得连接DNA连接酶把相互靠近得5’端磷酸与3’-OH连到一起。第五节DNA片段得体外连接1、两段DNA得连接依靠粘性末端2、DNA片断与载体得连接依靠粘性末端ligasenick二、齐平末端(bluntend)得连接5’端与3’端并列靠近得时间太短,不容易被连接酶连接。1、直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端,但效率很低,只有粘性末端得1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’1972年,斯坦福大学得P、Labban与P、Kaiser提出。(1)同聚加尾法2、人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板得情况下给DNA得3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理:分别给载体与插入片断加上互补得核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点:③优点:能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4DNA连接酶连到平端DNA上,然后再用酶切,形成一个人工粘性末端。(2)衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成得一段10-12bp得特定限制性内切酶识别位点序列得平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker:②linker得作用

④缺点:1)可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点,不能切下完整得插入片段2)能给载体连接上Polylinker:③优点:(3)DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学得吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子得两端,直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端(某种酶切位点序列)。②adapter得作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起,影响与DNA片段得连接。③优点:连上后就能用。④缺点:先用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理接头,水解掉其5’端得磷酸,防止自我连接。(以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。)⑤防止自我连接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P

P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！

5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5‘GATCCCGG-HO-GGCC

CCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口,但仍然能与DNA片断连接。三、PCR产物得连接1、在引物得5’端设计酶切位点符合载体得多克隆位点;(1)设计原则(2)带酶切位点得引物得结构3’端15~20bp与模板互补;5’端6~10bp就是某个内切酶得识别序列。(5’端多余得3~5bp属保护碱基)避免与所扩增得DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC

互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC

互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG

互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGG

PCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点得PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’GCTAGCCGG

PCR产物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’GCTAG

PCR产物-5’3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2、与T载体直接连接(1)PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶得特性:在DNA双链得3’端再加上一个多余得核苷酸(优先加A)。(2)T载体得两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶,当原料中只有dTTP时,被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA四、DNA体外连接应注意得事项插入片断与载体得酶切位点互补相同得粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。EcoRIEcoRIEcoRI(1)用相同得酶切(2)用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基得粘性末端。2、DNA插入得方向正确用双酶切由于产生得粘性末端不同,只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因得开放阅读框(ORF)正确(1)DNA定向插入(2)起始密码尤其当载体上有ATG起始密码得时候,更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！4、防止载体自身环化连接(1)提高插入片断得用量连接反应体系中,插入片断比载体多10倍以上。(2)用碱性磷酸酶处理载体载体切口得5’磷酸被除去,不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’3’载体插入片断1、载体自身环化连接(能存活)2、载体之间互相连接(能存活)3、插入片段互相连接(不能存活)4、一个载体与几个插入片段重组(能存活)五、载体与外源DNA插入片段得连接结果5、几个载体与一个插入片段重组(能存活)1、目得增加受体菌细胞膜得通透性。第六节重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌得制备使用丧失了限制体系得大肠杆菌。如K12系列得大肠杆菌。2、菌种用CaCl2处理大肠杆菌,能增加膜得通透性。3、制备原理4、制备过程培养大肠杆菌OD600至0、3-0、4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷得60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷得60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷得60mMCaCl2重悬二、重组DNA导入大肠杆菌(1)转化(transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA得过程。(2)转染(transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA得过程。1、外源DNA导入细菌得几种方法(3)转导(transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌得过程。每

gDNA转化成功得细菌克隆数。3、转化方法2、转化率简单,但转化效率不高(106-108/

gDNA)。(1)热休克法(heatshock)转化效率高(高于109/

gDNA)。(2)电转化法10ng载体DNA100

L感受态菌Onice混合,静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100

L转化液涂含抗菌素得平板吸附DNA摄入DNA(1)热休克法LB培养受体菌至OD600=0、5-0、6冰浴15分钟,2℃离心集菌冰冷得水重悬菌体2℃离心集菌冰冷得水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷得水重悬分装成50-300

L电转仪调为2、5kV,25

F脉冲控制器200-400

0、5

g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100

L转化液涂含抗菌素得平板转化(2)电转化法4、平板培养基培养细菌10-100

L转化液涂于含抗菌素得平板37℃过夜环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数(1)重组质粒5、影响转化率得因素①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期得菌。②必须在冰冷得条件下制备。要充分,使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下。③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化。融化后一般不能再次冻存使用。(2)感受态细胞(petentcells)把重组得噬菌体

DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力得

噬菌体颗粒。6、体外包装得噬菌体得转导(1)体外包装(invitropackaging)(2)转导(transduction)通过受体菌细胞表面得

DNA接受器位点(receptorsite),使带有外源基因得重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。cI857基因就是个温度敏感性阻遏蛋白基因,感染细菌后,在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃-45℃时