生物制药 第1篇 第3-4章 人体、动物来源生物药物生产学习资料

上周内容回顾生物药物的分类方法生物药物的特点生物药物的制备各大类生物药物的分离纯化方法第三章人体来源生物药物的生产一.人体来源药物的特点与研究意义⒈特点：

⑴安全性好⑵效价高、疗效可靠如蛋白浓度为10％的免疫球蛋白或特异性免疫球蛋白，其抗体效价比血浆中含量高10倍以上。⑶稳定性好冻干制剂，保存期长，有利于运输，使用。

⒉研究意义

⑴资源有限性

受法律和伦理的制约，仅血液、尿液、胎盘可用作原料。

⑵研究的重要意义

对医学和药学有重大意义。如知道了人胰岛素的结构就可用基因工程技术生产人胰岛素。二、人体来源药物的种类与用途⒈人血液成分制品

发现血型，输血疗法的应用包括：全血制品、血液成分制品、血浆成分制品、体液细胞内成分制品等。

血液成分制品：红细胞、白细胞、血小板、血浆。

⑴、红细胞制剂

压积红细胞少含白细胞的压积红细胞冰冻贮藏红细胞⑵白细胞浓缩液白细胞是生产干扰素(IFN)的重要原料。干扰素(IFN)系指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质，可用于提高人体的免疫功能，人白细胞干扰素已可以完全纯化。用于制备干扰素的白细胞在使用时现制备。

白细胞疗法输注白细胞疗法，一般在肿瘤病人经细胞药物治疗后．处于骨髓细胞抑制期间遭受感染且各种抗菌素治疗无效情况下采用，疗效显著。白细胞(粒细胞)成分需用单采粒细胞技术(即将所有其他血液成分全部回输给供体)自供血者血循环中采集。用连续离心法收集粒细胞。⑶血小板制剂血小板的分离和使用在国外已经比较普遍。血小板制剂的适应症为白血病、淋巴瘤及其他肿瘤因治疗而导致的骨髓抑制症状。许多再生障碍性贫血病人往往需要长时间输注。⑷新鲜冰冻血浆（FFP）新鲜冰冻血浆能有效地保存血浆中各种生物活性成分的功能。FFP产品规定自采血到血浆冰冻的时间不超过8h，在-30℃以下保存。FFP可在许多临床疾病中应用，包括先天性或获得性凝血因子缺乏症、免疫球蛋白缺乏症等。

⒉血浆的综合利用

项目含量血浆占人体体重的量

8％

血浆占全血的量50％血浆中水分占血浆的量92％（92%-94%）

血浆中蛋白质占血浆的量6％～7％白蛋白＋IgG占血浆总蛋白的量65％

IgA+IgM+Fg+C3+Tr+·····25%

其他百余种微量蛋白多肽成分含量占血浆总蛋白的量10%不同生理功能的几类主要成分：⑴转输蛋白类

在血液循环中对机体的营养物质、代谢产物、激素、药物等进行转输的血浆蛋白。包括：白蛋白、脂蛋白、转铁蛋白等。⑵免疫球蛋白

构成体液免疫系统。包括：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE⑶凝血系统蛋白(因子)

包括：与凝血有关的蛋白质、酶和因子等。血浆中的凝血系统蛋白，在维持机体的正常凝血机制、保护血管渗漏方面起着重要作用。⑷补体系统蛋白

是机体防御体系之一，在吞噬、调理、趋化和细胞溶解等起重要作用。包括：C1～C9和其它。

⑸蛋白酶抑制物类在蛋白酶抑制物中，α1抗胰蛋白酶(α-1AT)含量最高，它能保护机体正常细胞不受蛋白酶的破坏和损伤，能协助控制感染和炎症，维持机体内环境的稳定。许多蛋白酶抑制物在体内的分工协作，维持了机体内环境的稳定。

⒊人体液细胞中的活性物质人体液细胞包括：红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板、成纤维细胞等。细胞内的活性物质：血红蛋白、SOD、IFN(干扰素)、IL-2（白细胞介素-2）等。⒋其它原料的利用

⑴人胎盘：制品主要有胎盘丙种球蛋白，人胎盘白蛋白、人胎盘RNA酶抑制剂等。

⑵人尿液:

尿激酶、激肽释放酶、尿抑胃素、蛋白酶抑制剂、睡眠因子、集落刺激因子(CSF)和表皮生长因子(EGF)等。⒌细胞因子

⑴特点和生理作用:细胞因子系在体内或体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。在临床上，细胞因子可促进受损组织的恢复，但对正常组织无作用。如肝细胞生长刺激因子(HEGF)，用作肝部分切除后的肝组织再生剂，用量极微。

⑵种类

100种以上⒍人体激素激素是调节机体正常发育与活动的重要物质，是一类动物体内腺体细胞和非腺体组织细胞所分泌的化学信息分子。激素主要有蛋白质激素、多肽激素、氨基酸衍生物激素和脂类激素。三、人体来源药物的制备实例

1.人血浆白蛋白制剂的制备主要功能：人血清白蛋白(Humanserumalbumin,HSA)，是人血浆中的重要组成部分，约占血浆总蛋白的65％。具有多种生理功能，可以增加血容量和维持血浆胶体渗透压，调节组织与血管之间水分的动态平衡。白蛋白的二级结构含有48％的α-螺旋和15％β-折叠结构，具有很多的网状空隙，可以输送体内不同活性物质，如将有毒物质输送到解毒器官，是许多内源因子和外源药物的载体。同种白蛋白制品无抗原性。结构和性质：白蛋白为单链分子，由584个氨基酸残基组成，N端为天门冬氨酸，C端为亮氨酸，Mr为66x103，在离子强度为0.15时，pI为4.7，易溶于水，在60％硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。种类：从人体中分离的白蛋白有两种一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。白蛋白制备的工艺路线工艺特点：络合(利凡诺沉淀)：血浆在搅拌下用NaHCO3调节pH至8.6，加入等体积的2％利凡诺溶液，充分搅拌后静置2-4h，分离上清与络合物沉淀。解离：在沉淀中加灭菌蒸馏水。用0.5mol/LHCl调节pH至弱酸性，加NaCl至0.15％-0.2％搅拌下进行解离。加热去杂蛋白：充分解离后，65℃恒温1h，离心分离出上清液。热处理(60℃，10h)：灭活病毒。检验：冻干品为白色硫松物体。白蛋白含量占95％以上，水分＜1％，水溶后pH为6.6—7.2，硫酸铵＜0.01％，细菌学和热原质检测合格。外源白蛋白的不足之处：白蛋白在人体内降解速度较快，稳定性差，易变性失活，易从血液循环中清除，单独作为药物载体时缓释时间较短。PEG修饰人血清白蛋白PEG(聚乙二醇)与蛋白质有良好的相容性，PEG修饰后可以增加蛋白质的稳定性，延长血浆半衰期，降低免疫原性和抗原性，降低毒副作用和提高膜的渗透性（Francescoetal,2005）。PEG的末端羟基活性很差，在温和的环境中很难与蛋白质进行偶联，需要使用活化剂，可以使用的活化剂有：氰尿酰胺、羧基二咪唑、环已基碳二亚胺、N-羟基琥珀亚胺、2,4,5-三氯苯基氯甲酸酯（Robertsetal,2002）N-羟基琥珀亚胺(NHS)修饰单甲氧基聚已二醇（mPEG）制备SC-mPEG，然后修饰人血清白蛋白（HSA）获得了mPEG-HSA。可用作蛋白质产品的稳定剂或药物的载体，用于药物的长效缓释剂（徐超等，2006）。尿激酶（Urokinase）的制备⑴结构与性质

分子量为54.7KD的天然尿激酶是由33.1KD和18.6KD两条链通过二硫键连接。属丝氨酸蛋白酶。

底物：血纤维蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白质底物,作用其Arg-Val键，使纤溶酶原转为纤溶酶。尿激酶的pI为8-9，溶液状态不稳定。广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。

⑵尿激酶的工艺路线工艺要点材料:

男性尿，8h内处理。调尿液pH6.5以下，电导20-30M/Ω，细菌数1000个／mL以下。硅藻土吸附：处理好的尿液加入1％的硅藻土，5℃下搅并吸附1h。洗脱：硅藻土吸附物，用5℃冷水洗涤后装柱，用0.02％氨水内合0.1mol/LNaCl溶液洗脱，当洗脱液由清变挥时开始收集。除热原、色素：上述收集液用饱和NaH2PO4，调pH8.0，加NaCl调电导至22M/Ω，通过DEAE—SephadexA50层析柱，收集流出活性部分。CM—C浓缩：上述收集浓用1mol/LHAc至pH4.2，用蒸馏水调电导至16-17M/Ω

，通过CM-C层析柱。然后用10倍体积的pH4.2的HAC-NaAC缓冲液洗涤柱床。洗后用0.1％氨水．1mol/LNaCl溶液洗脱尿激酶。收集活性组分．杂质被吸附。

产品质量：无色澄清液或白色冻干粉末。酶活力＞15000IU/mg蛋白质。绒膜促性激素(HCG)的制备白细胞介素—2(IL—2)的制备

⒈可进一步开发新产品

⑴血液的利用用低温乙醇工艺，除冷沉淀外，可将血浆蛋白分离为Ⅰ～Ⅴ个组分。目前仅利用Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（免疫球蛋白）、Ⅴ（白蛋白）3个组分。⑵其它原料的利用胎盘、尿液等。

四、人体来源药物的研究前景⒉用现代生物技术生产人类活性物质

基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程、发酵工程在生物制药中发挥重要作用。用基因工程生产的干扰素、白细胞介素、红细胞生长因子（EPO）研制成功。例如：人体防御素（Humandefensins）研究防御素分子存在于脊椎和非脊椎动物体内，包括昆虫防御素、ａ防御素和β防御素三类，其中ａ防御素仅存在哺乳动物体内，而β防御素除哺乳动物外，也存在鸟类体内。人体含有6种ａ防御素，3种β防御素和一种θ防御素。防御素具有抗细菌（革兰氏阴性和阳性菌），抗真菌和抗包膜病毒的活性。另有人认为，防御素可以进一步内在化，并且破坏DNA和干扰蛋白的合成，最后杀死细菌。防御素的分子很小，有可能穿过革兰氏阳性菌的细胞壁。除直接杀菌作用外，防御素还是信号分子。尽管防御素在人体天然免疫中发挥重要作用，但到目前为止，尚未有防御素应用于临床的报道。防御素活性受到血清和盐离子强烈抑制，使之无法应用于全身治疗，限制了防御素的开发和应用。但应用于局部治疗或外用，以及作为免疫佐剂，仍具有很好开发前景。第三章人体来源生物药物思考题1、人血浆中的免疫球蛋白有哪几种？含量最高和最低的分别是什么？2、利用人体作原料有那些局限性？如何解决？3、人白蛋白的功能是什么？外源白蛋白治疗疾病时有什么不足？如何改进？4、如何利用人的新鲜血浆生产白蛋白如果一个人充满信心地朝他的理想迈进，并且

努力去过他想过的生活，他常常会有意想不到的成功。第四章动物来源的药物生产

一、动物来源的药物的特点⒈

原料来源丰富动物原料主要有牛、猪、羊等的器官、组织、腺体、血液、毛角等。其次是各种小动物。这类资源的来源丰富且健康、新鲜。

⒉要重视安全性动物与人体的种族差异较大，因此活性物质的结构也有一定的差异。特别是蛋白质类药物在化学结构和空间结构上都会有不同程度的差别。蛋白质是抗原，不同来源的蛋白质注射于人体内要产生抗原反应，严重者会有生命危险。因此，对此类药物的安全性研究要特别引起重视。同时也要重视药效问题。

二、动物来源的药物的种类与用途⒈动物多肽与蛋白质类药物

⑴动物多肽药物

①

多肽激素有垂体多肽激素、下丘脑激素、甲状腺激素、胰岛激素、胃肠道激素、胸腺激素等。

②多肽类细胞因子含有多肽成分的其他生物药物：此类药物品种繁多且不断更新。如脑氨肽、蛇毒、胎盘提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素、转移因子、抗癌肽等。此类药物大部分是多种物质的混合物。

⑵动物蛋白质类药物包括蛋白质激素、血浆蛋白质、蛋白质类细胞因子、粘蛋白、胶原蛋白、其他蛋白等。⒉动物酶与辅酶类药物

⑴促消化酶类这类酶的作用是水解和消化食物，使其变成易于吸收的营养物质。如将蛋白质水解成氨基酸，将多糖类水解成单糖，将脂肪水解成脂肪酸和甘油等。

美国出售的消化酶制剂⑵消炎酶类①酶有提高从毛细血管到结缔组织的通透性的特点。②蛋白酶消退浮肿。注射蛋白酶后可以抑制实验性蛋白浮肿、芥辣粉油引起的炎症和浮肿、葡萄糖引起的浮肿等。现在用得最多的消炎酶是溶菌酶。在片剂与胶囊的酶制剂中，常用的消炎酶有：溶菌酶、菠萝蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、明胶肽酶、RNA酶等。⑶治疗心脑血管类疾病的相关酶生命在于矛盾，在于运动，一旦矛盾消除，运动停止，生命也就结束了。在健康人体血管中，凝血和抗凝血保持着动态平衡，既无血栓形成，也无出血现象发生。血纤维蛋白在凝血与解凝过程中起着重要作用。心脑血管疾病中，多发病之一是血栓，也是危害中老年人生命的重要疾病之一。防止血栓的形成和清除已形成的血栓的最有效的酶是纤溶酶，它可溶解纤维蛋白原和纤维蛋白，发挥其溶解血栓作用。纤溶酶激酶能够激活纤溶酶原使其变成有活性的纤溶酶而发挥溶血栓作用。已用于临床的酶类主要有纤溶酶、尿激酶、蚓激酶、链激酶、凝血酶等。

⑷抗肿瘤的酶用于治疗肿瘤的酶，有L-门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶等。L-门冬酰胺酶是一种引人注目的抗白血病药物，它是利用门冬酰胺酶选择性地剥夺某些类型肿瘤组织的营养成分，干扰或破坏肿瘤组织代谢，而正常细胞能自身合成门冬酰胺而不受影响。

⑸与电子传递有关的治疗酶⑹其它药用酶⑺动物辅酶类药物主要动物来源的酶类药物⒊动物核酸类药物

⑴组成与作用核酸是由核苷酸组成的，核苷酸又由碱基、戊糖和磷酸三部分组成。戊糖与碱基组成的单元叫核苷。

DNA、RNA均有复杂的二级和三级结构，它们在生物的遗传、变异、生长发育以及蛋白质合成等方面起着重要的作用。⑵主要种类与用途（主要核酸类药物）⒋动物糖类药物动物多糖类药物以粘多糖类为主。粘多糖是一类脑外生物大分子物质，是动物体内蛋白多糖分子中的糖链部分。粘多糖的生物合成起始于核心蛋白，经过多种糖基转移酶和有关修饰酶的作用，形成有特定顺序的重复单位的线性分子。此类成分具有多种药理活性，包括抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤及抗放射性等作用。（1）、粘多糖的种类与分布广义的粘多糖包括粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等。多糖类药物以粘多糖为主，包括中性粘多糖和酸性粘多糖。粘多糖主要分布在动物骨、软骨、皮、角、血管、肠、滑膜液、脑、角膜、肺、肝、心、尿等原料中。其他动物如腔肠动物、海绵动物中含量也较高。重要药用粘多糖：甲壳素、硫酸软骨素、肝素、透明质酸等的存在部位与功能列于下表。

(2)粘多糖制备的一般方法

粘多糖分离的主要步骤有：原料处理，提取（包括降解法和非降解法)，去除非粘多糖，脱色，脱蛋白等，纯化，用乙醇分级沉淀，季铵盐络合沉淀，离子交换柱层析分离，分子筛分离，亲和层析等。

⒌动物脂类药物

脂类药物种类与分布：主要包括有脂肪酸及其衍生物、磷脂类、胆酸类(含固醇类)、卟琳及其衍生物等。动物脂类药物中脂肪酸及磷脂类主要分布在脑、脊髓等神经组织中，脂肪组织、肝等含量亦较丰富；胆酸类药物分布以胆汁为主，卟啉类以血液为主。

主要动物脂类药物（1）主要动物脂类药物（2）脂类药物的另一特点是，从生物组织制得的脂类药物再经过分子改造，可以得到更高疗效的产品。分子改造可采用酶促合成或化学半合成，再经提纯制得。例如以胆酸为原料经氧化或还原可分别制得去氢胆酸或去氧胆酸。脂类药物的制备：可以通过提取法、水解法、生物转化法、化学合成或半合成法活动获得。SeeYou!⒍动物细胞因子细胞因子在体内或体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。包括细胞生长因子和细胞生长抑制因子。在临床上，细胞因子可促进受损组织的恢复，但对正常组织无作用。(1)主要动物来源的细胞生长调节因子(1)主要动物来源的细胞生长调节因子（续表）阳离子抗菌小肽（cationicantibioticsmallpeptides）是一组长12~60个氨基酸的富含赖氨酸或精氨酸的带正电荷短肽，在各种动植物体内均广泛存在，是高等天然免疫的重要组成成分。有的细菌也产生此类小肽，作为与其他细菌竞争的武器，如乳酸菌产生的乳链菌肽（nisin）就是一例。这些分子都具有两个特点：富含正电荷和具有双性特征，即分子表面一部分疏水而另一部分亲水。正电荷特性利于抗菌肽与靶细胞表面带负电的位点结合，而双性特征对膜结构的破坏效应是必需的。常见动物（哺乳动物、两栖动物和昆虫）来源的阳离子抗菌小肽见表。动物来源药物制备实例胰岛素的制备1)胰岛素的性质

胰岛素的pI＝5.3-5.4，由A链、B链通过两个二硫键连接；A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸；Mr近6000；能与锌离子结合成锌胰岛素。锌胰岛素在pH＝2的水溶液中呈二聚体。制备猪胰岛素的工艺路线制备胰岛素工艺要点：提取：绞碎胰脏，再加2.3~2.6倍的86％~88％乙醇和5％的草酸，提取3h。浓缩：上清液过滤后，在30℃减压浓缩至比重为1.04~1.06。除酸性蛋白：盐折物中加入7倍量的蒸馏水溶解，再加3倍量冷丙酮，用氨水调pH至4.2~4.3，补加丙酮，使水﹕丙酮为7﹕3，搅拌后过夜，离心去除酸性蛋白沉淀。锌沉淀：滤液用氨水调pH为6.2~6.4，加人3.6％醋酸锌溶液(20％浓度)，再用氨水调