食品课件 第八章蛋白质和氨基酸态氮的测定学习资料

第八章食品中蛋白质和氨基酸态氮的测定一蛋白质的生理功能及在食品中的作用食品中蛋白质的含量蛋白质测定的意义四蛋白质系数五蛋白质的组成六蛋白质水解七蛋白质测定方法第一节概述蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及运转都与蛋白质有关。供给能量．人体内每天所需的能量约14％左右来自蛋白质，每克蛋白质提供4千卡热量．

一蛋白质的生理功用

二

食品中的蛋白质含量

在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。食品中蛋白质来源

Thesourceofproteininfood大豆（蛋白质含量30－40％）蛋类（12%）鱼类（10－12％）牛乳（3.3%）瘦肉（16％）粮谷类一般含量为7—10%，蔬菜类0.5－3％．

我国人民由谷类供给的蛋白质占膳食中蛋白质供给的50-60％．随着人民生活的提高．这方面供给的蛋白质数量减少，而肉、蛋和牛乳类蛋白质增加。三蛋白质测定的意义

测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。四蛋白质系数

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达5000－1000000，分子的长轴则长数nm~100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。五蛋白质的组成Theelementsofprotein

C:50-55%H:6-8%O:20-23%S:0-4%N:15-18%微量元素：P、Fe、Zn、Cu、I等

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数，

不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。六蛋白质水解

在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。

蛋白质胨肽氨基酸酸、碱、酶七蛋白质测定原理与方法

测定蛋白质的基本原理是：

利用蛋白质的氮、肽键、芳香族氨基酸、游离基和紫外吸收的性质。1、利用蛋白质共性的方法2、利用特定氨基酸残基法八蛋白质的测定方法凯氏定氮法物理法双缩脲法染料结合法福林—酚比色法蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法

蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品的蛋白质系数有所不同。

凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。第二节蛋白质的测定一凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进

后的改良凯氏定氮法

微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。

1、原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。２、整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定（一）常量凯氏定氮法

消化反应方程式如下：

使有机物脱水后被炭化为碳、氢氮。

，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

（1）样品消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O浓硫酸具有脱水性，浓硫酸又具有氧化性H2SO4＋2NH3＝(NH4)2SO4消化催化剂：硫酸铜－硫酸钾（2）蒸馏

在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O（3）吸收与滴定

加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

样品消化

蒸馏、吸收

滴定

此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定

①硫酸铜

；

②硫酸钾；③

硫酸；④

40g∕L硼酸溶液：⑤

混合指示剂：1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合。或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5的比例混合；

⑥400g∕L氢氧化钠；⑦0．1mol∕L盐酸标准溶液

2、适用范围3、仪器4、试剂①500ml凯氏烧瓶②定氮蒸馏装置

5、结果计算：

X=X—为样品中蛋白质的含量V1为样品消耗盐酸标准液的体积V2为试剂空白消耗盐酸标准液的体积C为盐酸标准液的浓度MN为氮的摩尔质量W为样品的质量K为氮换算为蛋白质的系数

微量ｑ凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器。1、原理（二）微量凯氏定氮法（1）100ml凯氏烧瓶。（2）微量凯氏定氮器。

2、仪器

（1）20g/L硼酸溶液。

（2）400g/L氢氧化钠。

（3）1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。

（5）0.01000mol/L盐酸标准溶液

（6）其他试剂同常量法。

3、试剂4、测定方法

：准确称取均匀的固体样品0.5～3g,或半固体样品2～5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。（1）

样品消化电子天平全自动凯氏定氮仪（2）蒸馏

按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

在接受瓶内加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。

吸取10.00ml样品消化稀释液由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入10ml400g/L氢氧化钠溶液的使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，盖塞，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL4%（或2%)硼酸吸收液下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。废液与蒸汽冷凝水

：取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。（3）滴定

(4)结果计算催化剂：硫酸钾作用：加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

注意：

但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。①催化剂2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。②可以指示消化终点的到达③下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

1、作用硫酸铜

CuSO4（三）微量凯氏定氮法的三个步骤总结1、消化：

将有机物和浓硫酸、催化剂一起煮沸，使有机物分解的过程.

有机物+浓硫酸------黑色物质-----碳被氧化成为二氧化碳,氨被浓硫酸吸收成为硫酸铵.(白烟中有三氯化硫、二氧化硫等)．

注:

消化有机物时，加入少量硫酸铜和硫酸钾作为催化剂．其中硫酸铜起催化剂作用，硫酸钾起提高硫酸沸点的作用消化终点：颜色转变为最后的浅蓝色。浅蓝色是硫酸词的颜色，

2、蒸馏：将消化好的样品（其中含有硫酸铵）和浓氢氧化钠作用，分解出氨，氨被水蒸汽蒸馏出来。被吸收于一定体积的标准溶液中．

3、滴定：用来吸收NH3的酸是过量的，可用标准的碱滴定剩余的酸（没有和氨作用的酸）．可计算出氨的量。注：在冷却时务必在三角烧瓶上加表面皿。滴定终点的控制

1、所用试剂应用无蒸馏水配制。

2、消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸

液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。

3、若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡沫少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。

4、若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L2~3ml过氧化氢后再加热。（四）注意事项5、硫酸铜起到催化作用，加速氧化分解。硫酸铜也是蒸馏时样品液碱化的指示剂，若所加碱量不足，分解液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量。6、若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。7、消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。8、蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。9、硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。10、混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈红色，在酸性溶液中呈灰色。１、原理：脲（尿素）NH2—CO—NH2

加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。二双缩脲法２方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）１、原理：

蛋白质与福林（Folin）—酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时也是由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸—磷钨酸试剂反应产生颜色，呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。三福林-酚比色法２、两步反应(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质—铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)说明：福林—酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小两个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。测定方法：第三节氨基酸的定量测定一双指示剂甲醛滴定法1、原理

氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。反应式（有三种不同的推论）如下：2、方法特点及应用

此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。普氨酸与甲作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。3、试剂（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液（3）0.1%中性红50%乙醇溶液（4）0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液4、操作方法

移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml蒸馏水，其中1份加入3滴中性红置试剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。

c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol

5、结果计算氨基酸态氮（%）1、原理

根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。二电位滴定法台式酸度计酸度计2、仪器酸度计（附磁力搅拦器）酸式滴定管：25mL胖肚吸管：10mL酸式滴定管磁力搅拌器胖肚吸管3、试剂（1）酚酞乙醇指示液：1%

硼砂（标准物质）缓冲液：PH9.22称取3.8克（2）Na2B4O7

溶解后，定容至1000mL（3）甲醛：36%-----38%（4）氢氧化钠标准溶液：0.0500mol/l。酸度计4、试验步骤（1）吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。（2）加入0.1mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。（3）同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。

ρ--------------氨基酸态氮质量浓度，g/100mL;c--------------氢氧化钠浓度，mol/L；

V1------------加入甲醛后耗NaOH的量，ml；

V2------------空白试验加甲醛后耗