pcr·电泳·实验+高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

P84PCR仪器PCR→PCR产物→电泳2、DNA移动的方向：向与自身带电情况相反的电极方向移动一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便由负极向正极泳动。1、DNA移动的原理3、DNA移动进度的观测：依靠：电泳指示剂【拓展】电泳指示剂还可以：使上样孔中的样品可见，确保样品准确加入孔内。电泳原理：指示剂移动速率比DNA更快，当指示剂迁移至凝胶边缘时，提示应及时停止电泳，避免目标分子跑出凝胶。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶琼脂糖的微结构资料卡片：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。拓展：琼脂糖冷却后形成具有刚性滤孔的胶体胨，凝胶孔径的大小由琼脂糖的浓度决定。笔记：琼脂糖凝胶电泳中影响DNA分子移动速率的因素：①凝胶的浓度②DNA分子大小和构像③电压大小（影响凝胶滤孔孔径大小）规律：DNA分子越大，迁移越慢。微量离心管：实际上是进行PCR反应的场所微量移液器：用于向微量离心管转移PCR配方中的液体扩增缓冲液：含镁离子、pH：8.0电泳缓冲液：是Tris-乙酸盐缓冲液或Tris-硼酸盐缓冲液含EDTA、pH：8.0作用：抑制核酸酶活性，保护DNA微量离心管：实际上是进行PCR反应的场所微量移液器：用于向微量离心管转移PCR配方中的液体扩增缓冲液：含镁离子、pH：8.0电泳缓冲液：是Tris-乙酸盐缓冲液或Tris-硼酸盐缓冲液含EDTA、pH：8.0凝胶载样缓冲液：含：溴酚蓝是：电泳指示剂作用：抑制核酸酶活性，保护DNA微量离心管：实际上是进行PCR反应的场所微量移液器：用于向微量离心管转移PCR配方中的液体扩增缓冲液：含镁离子、pH：8.0电泳缓冲液：是Tris-乙酸盐缓冲液或Tris-硼酸盐缓冲液含EDTA、pH：8.0凝胶载样缓冲液：含：溴酚蓝是：电泳指示剂作用：抑制核酸酶活性，保护DNA核酸染料：的作用：染剂与DNA结合后能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。与样品一起添加在加样孔中配置凝胶糖溶液时添加在已融化并稍微冷却后的凝胶中实验1：PCR等浓度、等量参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部移液离心扩增实验1：PCR使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合思考1：预变性的目的是什么？思考2：为什么最后1次变性时间延长？使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合思考1：预变性的目的是什么？原理：①TaqDNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降，导致在后期的PCR循环中，会发生“部分片段可能没有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脱落了”的情况，形成“半成品DNA”。②与正常DNA产物相比，这种“半成品DNA”在变性时需要的能量更多。目的：为了让未延伸完全的DNA双链部分完全解开，重新延伸。思考3：为什么最后1次延伸时间延长？确保DNA链完整合成梳子配制琼脂糖溶液制备凝胶实验2：琼脂糖凝胶电泳加样配制琼脂糖溶液制备凝胶实验2：琼脂糖凝胶电泳加样【笔记】标准参照物（Marker）1、是：已知的DNA分子大小的片段，2、作用：在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小。配制琼脂糖溶液制备凝胶加样实验2：琼脂糖凝胶电泳电泳、观察分子量大（长片段）分子量小（短片段）含量少（不亮、细带）含量多（很亮、粗带）注意：1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20°C储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。结果分析1.你是否成功扩增出DNA片段?判断的依据是什么?可以通过紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细来评价扩增结果。电泳方向小片段大片段规律：DNA分子量越大，迁移的越慢（条带位置远离点样孔）DNA分子量越小，迁移的越快（条带位置靠近点样孔）且DNA数量越多，条带越宽、越亮。2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果扩增不成功，可能的原因有：①漏加了PCR的反应成分，②各反应成分的用量不当，③PCR程序设置不当如果扩增扩增结果不止一条条带，可能的原因有：①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合成二聚体②退后温度过低③DNA聚合酶的质量不好若外源基因是单点（单个）插入植物核基因组（且未破坏内源基因），自交后通常表现为孟德尔分离比（如3:1或1:2:1）。但是：大多数情况下，插入的目的基因数量、插入的位置都是随机的