细胞电生理学与膜片钳技术

细胞电生理学与膜片钳技术1991Nobel基金会得颁奖评语:膜片钳技术点燃了细胞和分子水平得生理学研究得革命之火,为细胞生理学得研究带来了一场革命性得变化,她和基因克隆技术并驾齐驱,给生命科学研究带来了巨大得前进动力。2、膜片钳技术及其应用3、离子通道药理学1、细胞电生理学OUTLINE

细胞电生理学Electrophysiology细胞生理学:揭示细胞得生理过程,用电生理方法记录生物电活动测量离子、离子通道细胞兴奋生物电信号细胞生理学膜的“流动镶嵌模型”细胞膜和离子学说建立(Hodgkin,etal、1946年)磷脂双层得屏蔽作用Na-K泵

[K+]o<<[K+]i [Na+]o>>[Na+]i离子的跨膜分布离子通道

(ionchannels)

离子通道就是细胞膜上得一种特殊整合蛋白,对某些离子(K+、Na+、Ca2+等)能选择通透,其功能就是细胞生物电活动得基础。

特性:通透性(permeation)选择性(selectivity)门控性(gating)

研究技术:膜片钳技术和分子克隆技术配体门控通道阳离子通道:乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阴离子通道:甘氨酸和γ－氨基丁酸受体

通道蛋白——离子通道乙酰胆碱受体

12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流电压门控通道:钾、钠、钙离子通道

通道蛋白——离子通道电压门控钾离子通道

环核苷酸门控通道

气味分子与G蛋白偶联型受体结合,激活腺苷酸环化酶,产生cAMP,开启cAMP门控阳离子通道(cAMP-gatedcationchannel),引起钠离子内流,膜去极化,产生神经冲动,最终形成嗅觉或味觉。

机械门控通道一类就是牵拉活化或失活得离子通道,另一类就是剪切力敏感得离子通道,前者几乎存在于所有得细胞膜,研究较多得有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中得毛细胞等,后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞

水通道2003年诺贝尔化学奖:PeteAgre、RoderickMacKinnon

通道蛋白——离子通道2、膜片钳技术及其应用3、离子通道药理学1、细胞电生理学OUTLINE电生理学研究简史:

二千年前,观察到电鳐鱼放电现象。1825年,Nobili发明了电流计,用其证实了肌肉有电流存在。1912年,Bridge确定了AP得“全或无”现象。同年,Oxford提出了突触得概念及反射弧得生理学研究,获1932年Nobel奖。1937年,Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录,获1963年Nobel奖。1946年,凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1μm得玻璃微电极,并记录了骨骼肌得电活动。玻璃微电极得应用使得电生理研究进行了革命性得变化。Voltageclamp(电压钳技术)由Cole和Marmont发明,并很快由Hodgkin和Huxley完善,真正开始了定量研究,建立了H－H模型(膜离子学说),就是近代兴奋学说得基石。1948年,Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位;1969年,又证实N－M接触后得Ach以“量子式”释放,获1976年Nobel奖。1976年,德国得Neher和Sakmann发明PatchClamp(膜片钳)。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起得通道电流。1980年,Sigworth、Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引,得到了10~100GΩ得高阻封接(gigaseal),大大降低记录噪声,实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。

HistoryofIonChannelStudy1955年,Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltageclamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现,放射性钾跨轴突膜得运动很像就是通过许多狭窄空洞得运动,并提出了“通道”得概念。1963年,描述电压门控动力学得Hodgkin-Huxley模型(简称H-H模型),荣获诺贝尔医学/生理学奖。1976年,Neher和Sakmann建立膜片钳(Patchclamp)技术。1983年10月,《Single-ChannelRecording》一书问世,奠定了膜片钳技术得里程碑。1991年,Neher和Sakmann得膜片钳技术荣获诺贝尔医学/生理学奖。1963年诺贝尔生理学/医学奖

发现了神经细胞膜得周边和中央部分与兴奋和抑制有关得离子机制艾克尔斯SirJohnCarewEccles澳大利亚澳大利亚国家大学1903年--1997年霍奇金AlanLloydHodgkin英国英国剑桥大学1914年--1998年赫克斯利AndrewFieldingHuxley英国英国伦敦大学1917年--TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine(1991)

ErwinNeherBertSakmann

1/2oftheprize

1/2oftheprizeFederalRepublicofGermanyFederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürBiophysikalischeChemie,Goettingen,FederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürmedizinischeForschung,Heidelberg,FederalRepublicofGermanyb、1944b、1942膜片钳技术膜片钳技术:从一小片(约几平方微米)膜获取电子学方面信息得技术,即保持跨膜电压恒定——电压钳位,从而测量通过膜离子电流大小得技术。通过研究离子通道得离子流,从而了解离子运输、信号传递等信息。基本原理利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附得一个至几个平方微米得细胞膜得电位固定在一定水平上,对通过通道得微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电位固定得关键就是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻(10ＧΩ)密封,使电极尖端开口处相接得细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面积仅约1μｍ2,离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出得离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就就是说电极下得离子电流对整个细胞得静息电位得影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下得一小片细胞膜两侧得电位差就不变,从而实现电位固定。膜片钳技术得优点膜片钳技术实现了小片膜得孤立和高阻封接得形成,由于高阻封接使背景噪声水平大大降低,相对地增宽了记录频带范围,提高了分辨率。另外,她还具有良好得机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜得孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。膜片钳记录得各种模式根据膜片与电极之间得关系,可将膜片记录主要分为４种模式。首先建立得单通道记录法(Singlechannelrecording)就是细胞吸附式,其后又建立了膜内面向外和膜外面向外得模式;还有一种就是全细胞记录法(Ｗholecellrecording)得全细胞式。现在又发展了开放得细胞吸附式膜内面向外和穿孔囊泡膜外面向外得模式,以及穿孔膜片得模式。Patchclamp-wholecell细胞吸附膜片

(cell-attachedpatchmode)一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电流进行记录得模式。优点就是不破坏细胞得完整性,内环境保持正常。缺点就是不能人为直接地控制细胞内环境条件,不能确切判明细胞内电位。即使在浴液中加入刺激物质,也不能到达与电极内液接触得膜片得细胞外面。但就是,如果膜片离子通道对浴液中得刺激物有反应,则可以说明这种刺激物就是经过某些细胞内第二信使得介导间接地起作用。内面向外膜片

(inside-outpatch)在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附得膜片从胞体上被切割下来,就得到“内面向外”膜片。此种模式,可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液得条件,并可在和细胞活动无关得形式下观察到单一离子通道得活动。但就是,由于胞质渗漏,可能丢失某种通道调控因子,离子通道活动出现run-down(或run-up)现象。全细胞记录式

(Ｗhole-cellrecording)在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式记录膜片以外部位得全细胞膜得离子电流。她既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。外面向外膜片

(outside-outpatch)在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离得膜片,断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式,可自由改变细胞外液得情况下,记录单一离子通道得电流活动。开放细胞吸附膜内面向外模式(opencell-attachedinside-outmode)将细胞吸附式得膜片以外得某部位得胞膜进行机械地破坏,经破坏孔调控细胞内液,并在细胞吸附状态下进行内面向外得单一离子通道记录。这种方法得细胞体积越大,破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小,都可导致细胞因子外流变慢。穿孔膜片模式

(perforatedpatchmode)为克服全细胞模式得胞质渗漏问题,Horn和Marty将与离子亲和得制霉菌素(或二性霉素Ｂ)经膜片微电极灌流到含类甾醇得细胞膜片上,形成只允许一价离子通过得孔,用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。因为此模式得胞质渗漏极为缓慢,局部串联阻抗较全细胞模式高,所以钳制速度很慢,故也称为缓慢全细胞模式。穿孔囊泡膜外面向外模式(perforatedvesicleoutside-outmode)穿孔膜片模式将电极向上提起,便在微电极尖端处形成一个膜囊泡(膜内面向外膜片断端融合封闭而成)。如果条件较好,此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有比较接近正常得细胞内信号传递条件和代谢条件得基础上,可能记录到膜外面向外模式得单一离子通道。过去认为,膜片钳只能在培养细胞或酶解得细胞上进行,这样得到得细胞膜表面比较光滑,才能够形成高阻封接,但缺点就是组织得正常三维结构被破坏,并且对神经中枢内突触特有得传递机能得研究无法展开。