遗传学 工程菌的培养保藏和感受态制作及转化学习资料

工程菌的培养和保存技术

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验四、五一、实验目的二、实验原理三、实验器材与试剂四、实验步骤一、实验目的2.掌握工程菌的培养方法和常用的工程菌的保存方法1.掌握培养基的配制方法和灭菌的过程3.学习和掌握感受态细胞的制备的方法和技术4.掌握转化感受态细胞的方法二、实验原理1.工程菌的保存的基本原理2.感受态细胞的制备及转化原理低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素感受态：处于容易吸收外源DNA的状态的细菌转化：质粒DNA或以其它为载体构建的重组子导入细菌的过程。原理：细菌在0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型（如Ampr

）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含相应的选择培养基上。三、实验器材与试剂仪器：天平，高压灭菌锅，恒温摇床，恒温培养箱，超低温冰箱，超净工作台,液氮、酒精灯13个，打火机、95%酒精，13个平板涂抹器等

材料：50mL、1.5mL离心管；吸头1000uL、吸头（黄色）１０ｕL、枪1000ｕL、100ｕL、50uL各一把。灭菌液体LB培养基，250mL(于500mL的三角瓶中)0.1mol/L的CaCl2130mL(分成13管)，过滤灭菌，预冷0.05mol/L的CaCl213mL（分成13管），过滤灭菌，预冷质粒（pET28-eIF5A）13uL(100ng/uL)ddH20卡那霉素（Kan）（100mg/mL）(分成13管，5uL/每管)灭菌液体LB培养基13mL(分成13管，1mL/每管)固体培养基26个(每组2个，不含和卡那霉素（Kan

）各1个)，实验7所制所需试剂四、实验步骤1.LB(Luria-Bertani)培养基的配制配制1升培养基，应在950mL去离子水（或蒸馏水）中加入：摇动容器直到溶质溶解，定容。高压灭菌。如果配制LB固体平板培养基，则在按上速成分配好、定容后，加入15g琼脂。高压灭菌。胰蛋白胨（bacto-tryptone）10g酵母提取物（yeastextract）5gNacl10g2.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化*细菌培养从LB平板上挑取新活化的E.coliBL21单菌落，接种于3-5mLLB液体培养基中，37℃震荡培养12h左右，直到对数生长后期。将该菌液以1：100—1：50的比例接种于250mLLB液体培养基中，37℃震荡培养2-3小时直到OD600=0.5左右。*感受态细胞的制备（CaCl2法）（1）将1mL培养液加入1mL的离心管中，冰上放置10分钟，然后4℃4000g离心10分钟。（2）弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2

1mL

轻轻悬浮细胞(用“枪头”悬浮)，冰上放置15-30分钟，4℃4000g离心10分钟。（3）弃去上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2

0.1mL轻轻悬浮细胞（用“枪头”悬浮），冰上放置几分钟。（4）将悬浮细胞分装成200uL的小分于预冷的1.5mL的离心管中(每组分2管即可)，可立即使用或液氮冷冻后，贮存与-80℃的冰箱中。注：整个过程均在冰上操作！！实验结果（1）将质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10uL）和对照无菌双蒸水分别加入制备的感受态细胞中，冰上30min.(本实验用1-2uL，共1ng;水10uL)（2）42℃热击45s—1min后,立即冰上放置2min。（3）加入LB液体培养基800µL.37℃低速（120-160rpm）振荡培养40分钟左右（4）取上述菌液(转化质粒DNA溶液)100µL涂布于含Amp的筛选平板上;取无菌双蒸水转化的菌液1µL(