DB21-T3257-2020-猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法-辽宁省

ICS11.220DB21B41辽宁省地方标准DB21/T3257—2020猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法MethodofELISAforPRRSVantibodyNEQ辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3257—2020目次前1言............................................................................II范围..............................................................................1规范性引用文件....................................................................1缩略语............................................................................1原理..............................................................................1仪器和器材........................................................................1试剂..............................................................................2操作步骤..........................................................................2试验成立条件与结果判定............................................................3检测过程中防止交叉污染的措施......................................................3废弃物处理.......................................................................32345678910附录A（资料性附录）试剂配制........................................................4IDB21/T3257—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由动物卫生标准化技术委员会（辽宁）提出，辽宁省农业农村厅归口管理。本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心。本标准协助单位：洛阳现代生物技术研究院有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人：周晨阳、魏澍、高志峰、魏园园、王冰、董娜、刘金玲、刘耀川、杨作丰、高原、王连山、马亮亮、潘婷婷、杨嵘长、姜斌、杨太东、于春玲。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电话IIDB21/T3257—2020猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法的技术要求。本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行猪繁殖与呼吸综合征病毒病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血清或血浆样品中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求3缩略语ELISA：酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay）PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）4本方法原理是包被板上包被的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗原，可与待测样品中的特异性抗体反应，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的二抗，则形成免疫复合物，洗涤后，如待测样品中含有PRRSV抗体，显色深，为阳性，反之为阴性。51DB21/T3257—20206试剂注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。6.1猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原包被板。6.2阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性猪血清。6.3阴性对照：无猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体猪血清。6.4酶标复合物：过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体。6.5PBS：磷酸盐缓冲液（0.01mol/LpH7.4）配制见第A.1章。6.6洗涤液：配制见第A.2章。6.7样品稀释液：配制见第A.3章。6.8底物溶液：配制见第A.5章。6.9终止液：配制见第A.6章。7操作步骤注：试验操作过程中涉及生物安全的注意事项依据GB19489《实验室生物安全通用要求》的规定执行。7.1样品的采集、前处理与存放7.1.1采样注意事项采集血液，用离心机分离上清血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染。试验前将被检血清统一编号，并用样品稀释液作40倍稀释。7.2.2取出包被板，加入100μL没有稀释的阴性对照和阳性对照，每次检测各加两孔；在相应的孔中加入100μL已经稀释好的样品。7.2.3在37℃条件下温育30min（±1min）。7.2.4将各孔的液体弃入废液桶，用300μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。7.2.5每孔加入100μL酶结合物。7.2.6在37℃条件下温育20min（±1min）。7.2.7重复步骤7.2.4。7.2.8每孔加入50μL显色液A和50μL显色液B（也可显色液A、B等比例混匀后加100μL）。2DB21/T3257—20207.2.9在37℃条件下温育10min（±1min）。7.2.10每孔加入50μL终止液，终止反应。测量并且记录样品和对照的OD值（450nm），15min内读值有效。8试验成立条件与结果判定试验成立条件8.1阴性对照平均值（NCX）阳性对照平均值（PCX）NCX=(NC1+NC2)/2PCX=(PC1+PC2)/2X试验成立判断标准：PCX-NC≥0.5；NCX≤0.3。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，应按照操作说明书重做一次试验。8.2结果判定样品的计算S/P=(样品－NCX)/(PCX－NCX)如果样品S/P值＜0.2，样品应判定为抗体阴性。如果样品S/P值≥0.2，样品应判定为抗体阳性。9检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2-2004的规定执行。废弃物处理10按照《农业部关于印发〈病死及病害动物无害化处理技术规范〉的通知》（农医发〔2017〕25号)3DB21/T3257—2020附录A（资料性附录）试剂配制A.1磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/LpH7.4）氯化钠8g氯化钾0.2g磷酸二氢钾十二水磷酸氢二钠蒸馏水0.2g2.83g加至