DB22-T2560-2016-水貂病毒性肠炎检疫技术规范-吉林省

ICS11.220DB22B41吉林省地方标准DB22/T2560—2016水貂病毒性肠炎检疫技术规范Quarantineprotocolforminkviralenteritis吉林省质量技术监督局发布DB22/T2560—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口于吉林省畜牧业管理局。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：王伟利、王建科、孟庆峰、程悦宁、易立、姚贵哲、王准、宋翱、程世鹏。IDB22/T2560—2016水貂病毒性肠炎检疫技术规范1范围本标准规定了水貂病毒性肠炎的病原分离鉴定、HA-HI试验、PCR、Real-timePCR及动物回归试验等诊断技术要求。本标准适用于水貂病毒性肠炎的检疫、疫情监测和流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件MEV：水貂肠炎病毒F81：猫肾传代细胞CPE：细胞病变——离心管（1.5mL、0.2mL）——试验动物：3月龄健康水貂（水貂肠炎病毒HI抗体效价≤1∶4）4.2试剂——DEPC双蒸水（双蒸馏水1000mL、DEPC1mL，室温放置28h以上，0.105MPa蒸汽高压30min。1DB22/T2560—20164℃或室温保存）——培养液（DMEM粉10g、碳酸氢钠3.7g，溶于1000mL双蒸水中，抽滤分装，4℃保存）——营养液（DMEM培养液900mL、犊牛血清100mL，加青霉素、链霉素，使其浓度分别达到200IU/mL、200µg/mL抽滤除菌）——维持液（DMEM培养液980mL、犊牛血清20mL，加青霉素、链霉素使其终浓度分别达200IU/mL、200µg/mL，抽滤除菌）——胰蛋白酶溶液（胰酶2.50g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20g、无钙镁PBS1000mL，抽滤除菌，4℃保存备用）——新生犊牛血清——青霉素——链霉素——阿氏液（葡萄糖2.05g、拘椽酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.82g、双蒸馏水二级水中溶解后，用盐酸将pH值调至6.1，高压蒸汽灭菌20min，最后用二级水定容至100mL，4℃保存备用。）——蛋白酶K（三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.8）1.20mg（0.01mmol/L）、乙二胺四乙酸（EDTA）1.86mg（0.005mmol/L）、SDS5.00g、三蒸水1000mL、加入蛋自酶K，使成为20mg/mL，即为贮存液；使用浓度为50µg/mL）——RNaseA（20µg/mL，10mmol/LTris-HCl（pH8.0）1.21g、15mmol/LNaCl0.89g、RNaseA0.02g，加去离子水使其终浓度为20µg/mL。分装，－20℃保存备用）——Tris饱和酚——酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）——TE（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl（pH8.0）1.21g、lmmol/LEDTA（pH8.0）0.37g、去离子水800mL，调节pH至8.0，用去离子水定容至1000mL）——TaqDNA聚合酶（5U/μL）——dNTPs（每种浓度均为10mmol/L）——50×Tris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液（Tris282.0g、冰乙酸57.10g、0.5mol/LEDTA（pH8.0）100mL，三蒸水定容至1000mL，0.105MPa蒸汽高压30min，备用）——溴化乙锭溶液（10mg/mL）（三蒸水100mL、溴化乙锭1g，置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器保存于室温）——1%琼脂糖凝胶（琼脂糖1g、TAE电泳缓冲液（50倍）2mL、灭菌三蒸水98mL、微波炉中完全融化，加溴化乙锭溶液）——猪的红细胞：1%猪红细胞悬液（用20mL注射器先吸取5mL阿氏液，从健康猪耳静脉采血10mL左右立即混匀，用pH值6.4的PBS洗涤，3000r/min离心5min，弃掉上清，反复洗涤3次，直至离心后的PBS无血色，弃上清，取出红细胞泥1mL，加含1%BSA的pH值6.4的PBS稀释液9mL，混匀后取1mL，稀释液9mL，即为1%的猪红细胞悬液）2DB22/T2560—2016——阳性抗原：由指定单位提供或将水貂肠炎病毒疫苗毒MEVB株通过F81传代细胞培养，其培养物经过灭活制备而成——阴性抗原：由指定单位提供或将生长良好的F81传代细胞，冻融2～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用——阳性血清：由指定单位提供或用水貂肠炎病毒疫苗株的细胞培养物免疫水貂后分离血清制成，或采已知水貂肠炎病毒抗体阳性貂血分离而成——引物：根据MEV国际标准株Abashiri基因序列，在其保守基因序列内设计合成一对特异性引物：引物P1：5’–ACAAGCGGCAAGCAATCCTC–3’，引物P2：5'–CTGCCTCTATTTCGGACCAT–3'，配制成20pmol/µL。–20℃保存5设备——生物安全柜——CO2培养箱——倒置显微镜——高速冷冻离心机——组织匀浆器——4℃冰箱——超低温冰箱——PCR扩增仪——电泳仪——移液器（20μL、200μL、1000μL）——8通道移液器（100μL）无菌取病貂的肠道组织或粪便2g，按1:10的比例用培养液制成匀浆，反复冻融三次，3000r/min离心20min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，加入抗生素至终浓度为青霉素2000IU/mL，链霉素2000µg/mL，37℃感作1h，冷藏备用。将处理过的样品同步接种F81细胞，接种量为营养液量的10%，加入营养液，然后37℃恒温培养箱中吸附24h后，倾去营养液加入维持液，置37℃的5%CO2恒温培养箱中培养4d～6d，同时设置正常细胞对照。3DB22/T2560—2016接种24h后置显微镜下逐日观察至4d～6d。正常细胞对照成立，接种病料的细胞出现细胞变圆、拉网、脱落等CPE，收获细胞培养物，放入–80℃冰箱中保存备用。对照细胞与接种样品细胞均无变化，应盲传3代。盲传过程中出现CPE，按上述原则，收获细胞培养物，放入–80℃冰箱中保存备用；若盲传3代未出现CPE，则按未分离到水貂肠炎病毒出具结果。6.4病毒鉴定取上述细胞培养物进行HA-HI试验、PCR、荧光定量PCR和动物回归试验等鉴定。7HA-HI试验7.1样品采集与处理7.1.1组织与粪便无菌取病貂的肠道组织或粪便2g，按1:20的比例用培养液制成匀浆，反复冻融三次，3000r/min离心20min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，加入抗生素至终浓度为青霉素2000IU/mL，链霉素2000µg/mL，冷藏备用。7.1.2血清制备趾尖采血，室温静置1h后4℃冰箱过夜，吸出血清入离心管中，3000r/min离心5min，取上清液备用。7.2HA试验在微量板上，从第1孔至10孔以及12孔，用移液器每孔加入pH6.410mM的PBS25μL，用移液器吸取7.1.1待检样品25μL，从第1孔起，依次作倍比稀释，至第10孔，弃去移液器内25μL液体（稀释倍数依次为2、4、8、16、32…1024），11孔为病毒对照，12孔为红细胞对照。第1孔至12孔每孔补加pH6.4的PBS25μL，再加入1%猪红细胞悬液50μL，立即在微量板振荡器上摇匀后放置4℃静置60min判定结果。加样示意图参见附录A.1。使50％红细胞凝集的最高稀释度，作为病毒的HA效价；HA效价≥1:8则判定为HA阳性，反之则为阴性。7.3HI试验病毒HA效价（如为1∶256），4个血凝工作单位=256/4=64（即1∶64），取pH6.4的PBS9mL，加血凝素lmL，即成1:10稀释度，将1:10稀释液lmL加入到生理盐水5.4mL中，使最终浓度为1:64。将待检血清用pH6.4的PBS进行2倍系列稀释，加入含4单位血凝素的抗原液，并设红细胞对照和病毒对照，充分振摇后，置37℃作用30min后，加入1%红细胞悬液，4℃静置60min，判定结果。加样示意图参见附录A.2。4DB22/T2560—20167.3.3判定标准以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点，该最高稀释度即为被检血清的HI效价。8PCR8.1DNA提取取6.1中处理样品200µL，或取病毒细胞培养液200µL，–20℃/室温反复冻融2～3次，12000r/min离心l0min；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的消化缓冲液及5µL蛋白酶K（20mg/mL）50℃消化2h，12000r/min离心10min；将上清液转移到一新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，12000r/min离心l0min；取上层水相转移入一新的离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混匀后，12000r/min离心l0min（重复此步骤一次）；取上层水相转移入一新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，在–20℃放置1h～2h或室温放置30min以沉淀病毒DNA；12000r/min离心l0min，弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，自然风干；用10µL含RNaseA（20µg/mL）的TE（pH8.0）溶解沉淀，–20℃保存备用。或按照市售的DNA抽提试剂盒操作说明提取病毒DNA。8.2PCR扩增8.2.1反应体系10×PCRbuffer20mmol/LdNTPs20pmol/μL引物P11.0将PCR反应管置于PCR扩增仪。反应参数为：94℃预变性5min；再进行94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，31个循环；然后72℃延伸5min，最后4℃保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5μg/mL）。将平板放入水平电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物5μL与1μL6×上样缓冲液混合，分5DB22/T2560—2016别加入样品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到标准分子量对照孔内。5V/cm恒压电泳30min~45min。8.4结果判定8.4.1用凝胶成像系统进行分析，在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，大小为194bp，即判定为水貂肠炎病毒核酸阳性。必要时取PCR扩增产物进行序列测定，进一步确认待测样品的结果。8.4.2如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次试验均为非特异性反应时，可判为阴性。9Real-timePCR9.1DNA提取按照6.1或按照DNA抽提试剂盒操作说明提取病毒DNA。9.2荧光PCR检测9.2.1反应体系20pmol/μL引物P120pmol/μL引物P2PCR-gradewaterTotalVolume在检测区进行，将9.2.1中加样后的PCR管放入荧光定量PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置见表36DB22/T2560—2016表3反应参数设置步骤阶段预变性变性温度（°C）时间（s）收集信号循环数129594305否否是是140复性扩增熔解5430360～95120019.3结果分析9.3.1扩增分析设置阈值：确认阈值线位于指数增长阶段；设置基线：确定PCR扩增曲线的最小Ct值，然后将基线的范围设定在最小Ct值减去3；保存设置，用样品名作为文件名，将数据输出为Excel文件。9.3.2熔点曲线分析熔点曲线：大多数实时荧光定量PCR仪，当在SYBR®Green模式下运行时，会自动进行熔点曲线分析；熔点曲线分析：每一反应孔的熔点曲线分析所得到的熔点温度“Tm”值（参照资料性附录B.2）。阴性对照无Ct值并且无扩增曲线和熔点曲线；阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线和9.3.4结果描述及判定无Ct值并且无扩增曲线和熔点曲线，表明样品中无水貂肠炎病毒核酸；Ct≤30.0，且出现特定的扩增曲线和熔点曲线，表示样品中存在水貂肠炎病毒核酸。选择水貂肠炎病毒HI抗体效价≤1∶4的3月龄的健康水貂10只，分两组每组5只，人工感染组5只经胃管灌服分离鉴定获得的病毒液8mL/只，腹腔注射2mL/只。对照组5只，每只灌服注射相同体积的细胞培养物，分别隔离观察饲养10d，每天观察试验及对照水貂的临床症状，测定体温；并于接种第3d开始收集水貂粪便，按照7中步骤进行MEV的HA检测。10.2.1感染动物临床观察评分标准评分标准见表4。7DB22/T2560—2016表4评分标准临床观察项目发病死亡赋分值54111腹泻，粪便稀软、呈黄色、灰白色或粉红色甚至煤焦油状体温升高至40℃以上，并持续2d以上精神沉郁，食欲减退或废绝粪便HA效价≥1:810.2.2判定标准对照组动物无10.2.1描述的任何症状，试验组动物