《植物组织培养》课件 项目5 植物脱毒技术

植物脱毒技术项目五植物脱毒技术任务二马铃薯的组织培养任务一植物脱毒技术介绍马铃薯的组织培养任务一植物脱毒技术介绍知识目标能理解无病毒苗培养的意义；理解组织培养脱毒的原理；学会组织培养脱毒的方法和培养流程；学会病毒的科学检测方法；学会解剖镜的使用；掌握组织培养脱毒苗在生产上的意义；掌握脱毒苗木的保存和利用方法。1234567掌握植物微茎尖培养的脱毒方法掌握无毒苗木的鉴定方法熟悉草莓的微茎尖脱毒培养技术132以草莓为例介绍“脱毒”

视频5-1草莓脱毒

危害植物的病毒有几百种，且随着栽培时间的延长，在母株内逐代积累，危害越来越严重。尤其是靠无性繁殖的作物，如通过嫁接、分株、扦插、压条等途径来进行繁殖的。象果树的苹果、葡萄、草莓等。花卉的百合、唐菖蒲、水仙、郁金香、香石竹、菊花等，蔬菜的马铃薯、姜等。

病毒的危害给作物生产带来重大的损失。如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10～18%。为害马铃薯有几十种病毒，给马铃薯生产带来严重障碍[北爱尔兰上百万人饥饿而死]。花卉上病毒的危害大大影响其观赏价值，表现花少而小，产生畸形、变色等。为了提高作物的产量和质量，根除病毒和其它病原菌是非常必要的。虽然可以治愈受细菌和真菌侵染的植物，但现在还没有什么药物可治愈受病毒侵染的植物。若一个无性系的整个群体都已受到侵染，获得无病毒植株的唯一方法就是消除营养体的病原菌，并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。用组织培养法消除病毒是唯一行之有效的方法。由于病毒对植物造成如此严重的危害。所以世界各国都非常重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗进行工厂化育苗，并在全国普遍开展。一、无毒苗培育的意义二、热处理脱毒三、茎尖培养脱毒四、其它途径脱毒任务讲解五、病毒植物的鉴定六、无病毒植物的保存和利用一、无病毒苗培育的意义

采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。自从50年代发现通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量后（如草莓可增产20～50%。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大）。因此到60至70年代组织培养的技术在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。一、无毒苗培育的意义二、热处理脱毒1、热处理法的发现及应用1889年，印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗（现证明为病毒病），放在50～52℃的热水中保持30分钟，甘蔗就可去病生长良好。以后这个方法得到了广泛的应用，每年在栽种前把大量甘蔗茎段放到大水锅里进行处理。自1954年Kassanis用热处理防治马铃薯卷叶病以后，这一技术即被用以防治许多植物的病毒病。二、热处理脱毒

热处理又称温治疗法(Theomtherapy)。原理是植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。

Kassanis(1954)解释是：感染植物体内病毒的含量，反映了病毒颗粒生成和破坏的程度。在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。二、热处理脱毒2、热处理方法温汤浸渍处理适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50℃左右的温水中浸渍10分钟至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。二、热处理脱毒

热空气处理热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35～40℃。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于38℃下处理2个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培养结合36℃处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒。亦可采用变温方法，如马铃薯每天40℃处理4小时可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持了芽眼的活力。二、热处理脱毒

热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说。对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。而且对寄主植物作较长时间的高温处理有钝化植物组织中的阻抗因子，致使寄主植物抗病毒因子不活化，从而增加无效植株的发生率。因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的效果。二、热处理脱毒三、茎尖培养脱毒1、茎尖培养脱毒感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染程度越低，生长点（约0.1～1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大则不能保证完全除去病毒。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗的最广泛最重要的一个途径。三、茎尖培养脱毒2、培养基一般以White、Morel和MS培养基作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖的生长。植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用。必须添加适当浓度的生长素(0.1～0.5mg/L)与细胞分裂素，用NAA或IBA，细胞分裂素可用KT或BA。GA3对某些植物茎尖培养是有用的。茎尖培养中，由于操作方便，一般都使用琼脂培养基。不过，在琼脂培养基能诱导外植体愈伤组织化的情况下，最好还是用滤纸桥。三、茎尖培养脱毒3、茎尖培养方法进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单的解剖镜(8～40X)。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。三、茎尖培养脱毒

进行茎尖培养时，首要一步是获得表面不带病原菌的外植体。一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就应当能得到无菌的外植体。选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用多菌灵(0.1%)和抗生素（如0.1%链霉素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条插入Knop溶液中令其长大，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小得多。三、茎尖培养脱毒

为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花等只须在75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、蒜和马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10分钟。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1～2枚幼叶，然后将其接到培养基上。三、茎尖培养脱毒

将接处好的茎尖置于22℃左右的温度。每天16小时，2000～3000Lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠，所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同，这里不再叙述。三、茎尖培养脱毒4、影响微茎尖培养的因素外植体大小：在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，而外植体越小脱毒效果越好。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力。三、茎尖培养脱毒培养条件：在茎尖培养中，照光培养的效果通常比暗培养好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1厘米高时光照强度增加到4000Lx。外植体的生理状态：茎尖最好要由活跃生长的芽上切取，在香石竹和菊花中，培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。但在草莓中，二者没什么差别。取芽的时间也很重要，一般选作萌动期较好。否则采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。三、茎尖培养脱毒四、其它途径脱毒1、愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织诱导产生愈伤组织。然后从愈伤组织再分化产生芽，可以得到无病毒苗。但是，愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株。四、其它途径脱毒2、茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木人工培养，在砧木上进行试管微体嫁接。这在桃、柑橘、苹果等果树上已获得成功。3、化学疗法脱毒许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效果。四、其它途径脱毒五、病毒植物的鉴定

从上述途径培育得到的植株，必须经过严格的鉴定，证明确实无病毒存在，才是其正的无病毒苗，才可以提供给生产应用。鉴定的方法有多种。五、病毒植物的鉴定1、指示植物法是利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。指示植物法最早是美国的病毒学家发现的。这种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外指示植物一年四季都容易栽培。

五、病毒植物的鉴定

接种时从被鉴定植物取1～3克幼叶，在研钵中加10毫升水及少量磷酸缓冲液（PH7.0），研碎后用两层纱布滤去渣滓，再在汁液中加入少量的500～600目金钢砂作为指示植物叶片的磨擦剂，使叶面造成小的伤口，而不破坏表面细胞。以后用棉球蘸取汁液在叶面上轻轻涂抹2～3次进行接种，后用清水冲洗叶面。接种时可用手指涂抹、用纱布或用喷枪等来接种。接种工作应在防蚜虫温室中进行，保温15～25℃。接种后2～6天可见到症状出现。木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物，通常采用嫁接接种的方法。五、病毒植物的鉴定2、抗血清鉴定法植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，因而是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。测定时，把稀释的抗血清与未知各植物病毒在小试管内仔细混合，这一反应导致形成可见的沉淀。然后根据沉淀反应来鉴定病毒。五、病毒植物的鉴定3、电子显微镜检查法人的眼睛不能观察小于0.1毫米的微粒，借助于普通光学显微镜也只能看到小至200微米的微粒，只有通过电子显微镜才能分辨0.5毫微米大小的病毒颗粒。采用电子显微镜可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并可得知病毒颗粒的大小、形状和结构，借以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法。五、病毒植物的鉴定4、酶联免疫法（Elisa）是采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。五、病毒植物的鉴定六、无病毒植物的保存和利用1、无病毒苗的保存繁殖无病毒植株有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好隔离保存。这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用5～10年。通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.4～0.5mm大小的网纱，可以防止蚜虫进入。六、无病毒植物的保存和利用

栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。六、无病毒植物的保存和利用2、无病毒苗的利用无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可感染。一旦感染，影响产量质量的，就应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。六、无病毒植物的保存和利用复习思考题1．组织培养在生产脱毒苗木上有何意义？2．热处理为什么可以去除部分植物病毒？热处理方法分为几种，常用的是哪一种？3．为什么用微茎尖组织培养形成的试管苗一般是无毒的？4．分离微茎尖与分离普通茎尖有何区别？5．怎样保存和利用无毒苗？植物脱毒技术项目五

植物脱毒技术任务二

马铃薯的组织培养任务一

植物脱毒技术介绍任务二马铃薯的组织培养马铃薯的组织培养知识目标能理解无病毒苗培养的意义；理解组织培养脱毒的原理；学会组织培养脱毒的方法和培养流程；学会病毒的科学检测方法；学会解剖镜的使用；学会马铃薯微型薯生产技术；能理解无病毒苗木及种质资源的保存和利用方法。1234567掌握马铃薯脱毒培养的大致过程，了解马铃薯脱毒苗的鉴定方法;掌握马铃薯的生物学习性：熟悉微型薯的生产过程132微型薯任务导入以草莓为例介绍“脱毒”

视频5-1草莓脱毒

马铃薯是一种全球性的重要经济作物。适应性广，营养价值高，耐贮藏适运输，既是一种重要的粮食作物也是一种调节市场供应的重要蔬菜。马铃薯原产于拉丁美洲，当被发现可以食用后，很快传到世界各地，成为栽培很广的一种作物。

但是，当发现从外地引种栽培1～2个周期后，明显发现产量降低，植株变矮，并有卷叶的现象产生，经检测证明这是由于病毒引起的退化现象。任务导入

危害马铃薯的病毒有17种之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花叶病毒、纺锤形块茎病毒等。由于马铃薯是无性繁殖作物，病毒逐代积累，日益严重，引起严重退化。马铃薯病毒可使块茎产量减少50%～80%。

法国Morel和他的同事们，1955年从患病马铃薯植株中选取到了无病植株，为治疗作物病毒开辟了新途径。

任务导入一、特性和生物学习性

二、马铃薯脱毒技术三、马铃薯无病毒苗的鉴定材料四、马铃薯无病毒株的繁殖和保存任务讲解1、马铃薯的形态特性（1）根马铃薯的根系由出生根和匍匐根两部分组成。（2）茎马铃薯分地上部分和地下部分，地上主茎在形成16片叶子后，由花芽封顶，并在花的下部发生两个侧枝，从而构成马铃薯的主要同化系统。地下茎包括主茎的地下部分、匍匐茎和块茎。一、特性和生物学习性（3）叶马铃薯先出土的叶是初生叶，全缘，心脏形。以后发生的叶奇数羽状全裂单叶，在叶柄基部与主茎相连处着生有托叶。（4）花马铃薯的花为聚伞花序，第一或第二花序开放，恰是块茎强盛膨大之时，此时是需要不断浇水的形态标志。（5）果实、种子马铃薯果实为球形或椭圆形浆果。种子小。扁平肾形。种子可用来繁殖，但后代性状分离大。一、特性和生物学习性2、生物学习性马铃薯性喜冷气候，不耐高温和霜冻，解除休眠的块茎4℃下发芽，发芽适温为12～18℃。地上茎叶生长温度为17～21℃，25℃以上时生长不良，叶变小，超过30℃和7℃以下茎叶停止生长，-1℃时受冻。块茎形成要求昼温14～24℃，夜温12～14℃，土温16～18℃。土温20℃以上时块茎形成缓慢，而且容易引起退化，高温下养分多用于芽和匍匐茎生长不易形成块茎，25～30℃时已经长成的块茎也变成细长茎，结薯期要求12h左右的短日照和疏松、湿润、肥沃以及通气良好的土壤条件。土壤板结，薯块表面粗糙和薯形不整。一、特性和生物学习性

马铃薯生产中普遍存在有种性退化问题，表现为植株长势衰弱，株形矮化，分枝变少，薯块变小，产量逐降低，造成退化的原因和学说多种，综合而言，主要是薯块生长锥细胞发生阶段性衰老而导致种性退化，而病毒和细菌病害的侵染，以及肥水、营养条件不良等都会加剧其退化程度。一、特性和生物学习性

马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50％以上。研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响马铃薯的生产。通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。二、马铃薯脱毒技术意义

因此，采用组织培养技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。二、马铃薯脱毒技术意义

全国现有马铃薯播种面积300多万公顷，且有逐步增加的趋势，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒。因此，脱毒马铃薯推广具有广阔的市场前景，对于增加农民收入和发展马铃薯产业化生产具有十分重要的意义。二、马铃薯脱毒技术意义

我国的马铃薯平均单产仅为13.60吨/公顷，是世界单产最高国家瑞士（48.80吨/公顷）的1/4。造成如此大的差别，最主要的因素就是种薯质量差，品种布局不合理。采用脱毒快繁技术，种用脱毒种薯，一般可增产30-50%，甚至成倍增产，充分发挥品种的潜能，提高马铃薯生产能力。如果我国现有马铃薯播种面积的1/3（即114万公顷）用脱毒种薯，就可年增产粮食100多亿公斤。二、马铃薯脱毒技术意义

我国在70年代用茎尖组织培养方法得到脱毒马铃薯试管苗，并成功地获得脱毒复壮的马铃薯，开始了脱毒种薯的生产和推广。"八五"期间，农业部在全国范围内设立了6个马铃薯原原种基地建设和种薯生产项目，初步形成了脱毒草种薯生产体系。共推广脱毒种薯36.5-40万公顷，获经济效益近30.8亿元。二、马铃薯脱毒技术研究进展

我国已有许多科研、推广单位开展了脱毒马铃薯的研究和生产，在生产上产生了一定的经济效益和增产效果，但由于长期以来各自为政，技术方法和脱毒标准不尽统一，未能发挥出脱毒种薯应有的增产潜力。到目前为止，我国仍未建立国家级的脱毒种薯质量监督和病毒检测制度。二、马铃薯脱毒技术研究进展1.脱毒种薯生产程序采用微茎尖组织培养的方法，诱导出苗，采用联免疫吸附试验法或指示植物方法鉴定马铃薯病毒和类病毒，经鉴定后，无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。脱毒种薯生产

试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级称为原种2代、良种1代、良种2代。脱毒种薯生产脱毒种薯生产2．茎尖培养脱毒（1）取材和培养一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38℃）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70％的酒精浸润组织15-20秒，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡4～5min，然后用无菌水冲洗3次。脱毒种薯生产

把消毒好的芽放在解剖镜下仔细剥离，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可以留1～2个叶原基，0.2～0.3毫米，随即接种于MS液体培养基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5mgBA，2%蔗糖，pH值5.8。脱毒种薯生产培养条件：21～25℃、2000～3000lx、12h/d。2～3周愈伤，4～5周绿点，3～6月长成2～3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。

（2）继代和生根

培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA（试剂盒）鉴定后（试管苗应每3月检测一次，每年4次）鉴定后，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁。取试管苗单节切段扦插在（或平放）固体培养基上，每瓶可插20个左右茎段，经20d左右发育成5~10cm高小植株，继续进行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，试管苗多节接种在液体培养基上，进行浅层静止液体培养。脱毒种薯生产2．茎尖培养脱毒培养基：

MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸钙10，3%蔗糖，20～25度，3000～4000LX，14～16小时光照，每3周继代一次，单芽茎段约1厘米，可插也可平放，原则上试管苗用2年～3年。

脱毒种薯培养基脱毒种薯培养基(3)驯化

为增强试管苗对温室内环境条件的适应能力，移植前对试管苗要进行光、温锻炼。炼苗期温室内的温度：白天23~27℃，夜间不低于14℃。炼苗的具体方法是：移植前7d左右，将长有3~5片叶、高2~3cm的试管苗，在不开瓶口的状态下，从培养室移至温室排好。为防止强光、高温灼伤试