人教版高中生物选修一专题五《DNA和蛋白质技术》知识点归纳

专题五DNA和蛋白质技术

课题一DNA的粗提取与鉴定

一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

1.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA

不溶于酒精。

①DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特0.14

NaCl法度(mol/L)

点？要使DNA溶解，须要运用什么浓度？要使DNA

析出，又须要运用什么浓度？

在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可

使DNA析出。

②在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液;将DNA

分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸储水，以稀释

NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特殊是

95%冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

2.从理论上分析，预冷的乙醉溶液具有以下优点。

一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；

二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；

三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，削减断裂。

3.采纳DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？

将DNA和蛋白质进一步分别。

,4.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温柔洗涤剂的耐受性原理。利

用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值?

蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生

影响。温度值为60〜8(TC,因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不

会变性。

补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80C以上,

如在PCR技术中DNA变性温度在95℃o

5.洗涤剂在提取DNA中有何作用？

洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从,而瓦解细胞膜。

6.当鉴定提取出的物质是否是DNA时，须要运用什么指示剂进行鉴

定？在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。

原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶

解或析出DNA,可以从细胞中提取和提纯DNA;再利用酒精进一步将

DNA与蛋白质分别开来，达到提纯的目的；最终利用二苯胺试剂鉴定提

取的物质是否是DNAO

二、试验材料的选取

不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量

高、材料易得、便于提取的原则。

本试验用鸡血细胞做试验材料有两个缘由。

一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；

二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作试验材料经常须要

匀浆和离心，对设备耍求较高，操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞裂开以后释放出的DNA,简单被玻璃容器吸附，所以在提取过

程中为了削减DNA的损失，最好运用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

三、裂开细胞，获得含DNA的滤液

1、若选用鸡血和洋葱作试验材料，则怎样获得含DNA的滤液？

在鸡血细胞液中加入肯定量蒸播水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；

切碎洋葱，加入肯定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

2.为什么加入蒸储水能使鸡血细胞裂开？

答：蒸储水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血

细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的裂

开（细胞膜和核膜的裂开），从而释放出DNA。

3.在以上试验中，加入蒸储水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过

滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸福水中大量吸水而张裂；洗

涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。

4.在处理植物组织时须要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生

什么结果？

裂开细胞壁,使核物质简单溶解在NaCl溶液中;研磨不充分会使DNA

的提取量削减，影响试验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不

显示蓝色等。

详细做法。10mL鸡血+20mL蒸锵水一同方向搅拌-3层尼龙布过

滤一滤液

三、去除滤液中的杂质

1.为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低

盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复

溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质,须要进一步提纯DNAo

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的

原理是蛋白的分解蛋白质，不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA

的变性温度不同。

方案二与方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质

分开；方案三利用的是DNA和蛋白质,对高温耐受性的不同，从而使蛋白

质变性，与DNA分别。

四、析出与鉴定

1.在滤液中仍旧含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈

何颜色？

滤液与等体积的冷却酒精混合匀称，静置2〜3分钟，析出

的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。

2.怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？

详细做法。试管2支，编号甲乙一各加等量5mLNaCl

溶液一甲中放入少量白色丝状物，使之溶解-各加4mL二

苯胺，混合匀称一沸水浴视察颜色改变

五、试验操作

制备鸡血细胞液.......加柠檬酸钠，静置或离心

裂开细胞，释放DNA…加蒸储水，同一方向快速通方向搅拌

【一过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA加入NaCl至2mol/L,同一方向缓慢搅拌

DNA析出.............加蒸储水至O.14mol/L,过滤，在溶解到2moi/L

溶液中

If除去细胞质中的大部分物质。

DNA初步纯化........与等体积95%冷却酒精混合，析出白色丝状物

AB

1一除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定.............二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

留意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞

悬液浓度；运用塑料烧杯；运用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒

搅拌要缓慢（细胞裂开快速搅拌）；玻棒不要遇到烧杯壁；二苯胺试剂要

现用现配等。

课题二多聚酶链式反应扩增DNA片段

基础学问

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似:

1.细.胞内DNA复制条件分析：

条件组分作用

模板DNA的两条单链供应复制的模板

原料四种脱氧核甘酸合成DNA子链的原料

解旋酶打开DNA双螺旋

酶

DNA聚合酶催化合成DNA子链

能量ATP为解螺旋和合成子链供能

为DNA聚合酶供应合成的3,

引物RNA

端起点

2.细胞内DNA复制过程的解析：

解旋：解旋酶、ATP,DNA两条链打开，形成两条DNA单链.

引物结合：在DNA单链3'端与DNA反向配对结合。

DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标记着单链合成起先。

子链合成：DNA聚合酶从引物3'端起先，将配对的脱氧核甘酸连接

起来。

后续加工：D.NA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单锌，

再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来(半不连续合成。先导链,

滞后链)

3.DNA分子复制的人工限制

试验操作步骤

照PCR反应体系配方配制反应液；

②将PCR反应体系50pL用微量移液器转移到微量离心管

(0.5mL)中；

③将微量离心管放到PCR仪中；

④设置PCR仪的工作参数。

⑤DNA在PCR仪中大量扩增。。

4.试验留意事项

(1)避开外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸锵水等运用前高压

灭菌。

(2)缓冲液和酶分装成小份，一2。七低温保存。

(3)每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

(4)混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

总结、点评

多

聚DNA的复制须要酶、原料、能量、引物

—►PCR原理—>

酶DNA的变性和复性受温度影响

链

式

反—►PCR过程—»变性—>复性延长

应

扩

增移入离心管

D

N

A

片

段

课题三血红蛋白的提取和分别

一、试验原理

蛋白质的物化理性质：形态、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、

亲和力等千差万别，由此提取和分别各种蛋白质。

1.凝胶色谱法(安排色谱法)：

(1)原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流淌快;

分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流淌慢。

(2)凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

(3)分别过程：

混合物上柱一洗脱一大分子流淌快、小分子流淌慢一收集大分子一收集小

分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流淌。

(4)作用：分别蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

2.缓冲溶液

(1)原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3-NaHCO3,

NaH2PO4/Na2HPO4^),调整酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲

液。

(2)缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定°

3.凝胶电泳法：

(1)原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形态和大小不同,在电场中

受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方

向和运动速度不同。

(2)分别方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

(3)分别过程：在肯定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带

负电荷多的SDS,形成“蛋白质一SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅

取决于分子大小。

二、试验步骤

1.样品处理

红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白,采集的血样要与时采纳低速短时间

离心分别红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透亮的黄色血浆,将下层暗红

色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌lOmin,

低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没/黄色,表明红细

胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放

在蒸储水和甲苯作用下,红细胞裂开释放出血红蛋白。

注：加入蒸储水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目

的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分别。

2.粗分别

①分别血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色

透亮的甲苯层,第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层,第3层

是红色透亮液体，这是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质的暗红色沉

淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静

置片刻后，分出下层的红色透亮液体。

②透析

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300mL的

物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12ho透析可以去

除样品中分子量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。

3.纯化

调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液

缓慢下降到与凝

；胶面平齐，关闭出口。

加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱

的顶端。加样后，

I打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝

胶层后，

3关闭出口。

调整缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度

洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。

收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。

4.纯度鉴定—SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）

三.、留意事项

电泳技术

电泳技术就是在电场的作用下，利用待分别样品中各种分子带电性质

以与分子本身大小、形态等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度,

从而达到对样品进行分别、鉴定或提纯的目的。

2.红细胞的洗涤

假如分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的缘由。此

外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不

到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

3.如何检测凝胶色谱柱的装填是否