氨基酸工艺学第五章

氨基酸工艺学第五章第一节概述1.1氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键，取决于其控制机制是否能被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为的控制微生物的代谢。氨基酸发酵的成功，把代谢控制发酵技术引入微生物工业，使微生物工业能在DNA分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产品大量生成、积累。21.1.1氨基酸生产的历史1820年水解蛋白质开始1850年在实验室合成了氨基酸1866年（德）H.Ritthausen（立好生）博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，称之为谷氨酸。1908年日本制造味之素。1909年用水解法生产谷氨酸。1936年（美）从甜菜废液（司蒂芬废液）中提谷氨酸。1954年多田、中山俩博士报告了直接发酵谷氨酸（L-GA）1957年发酵法生产味精商业性生产。

3从20世纪初期，氨基酸实现工业化生产以来，氨基酸生产大体有蛋内质水解法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种生产方法。蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸；化学合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨酸；酶法：L-丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸；微生物发酵法：生产60%以上的氨基酸，包括直接发酵法和添加前体发酵法。前三种方法成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产目的。4发酵法生产谷氨酸是现代发酵工业的重大创举，也是氨基酸生产的重大革命，同时大大推动了其它氨基酸研究和生产的发展。逐步形成了用发酵法制造氨基酸的新型发酵工业部门。生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。5我国从1958年开始筛选谷氨酸生产菌，同时进行了大量的谷氨酸发酵的基础性研究，1964年分离选育出北京棒状杆菌As1.299和钝齿杆菌As1.542二株谷氨酸生产菌。后进行其它的基础性研究，陆续发表了赖、缬、亮、异亮、色、天冬的发酵研究报告，建立了自己的发酵工业。6国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。2000年,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。71.2氨基酸发酵生产发展的历史回顾所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为培养基中的主要原料培养微生物,积累特定的氨基酸。这些方法成立的一个重要原因是使用选育好的氨基酸生物合成高能力的菌株。8菌株的育种

是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件.在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。91.2.1用野生株的方法这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。典型的例子就是谷氨酸发酵。改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵101.2.2用营养缺陷变异株的方法这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。11谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的(图4-8)，筛选高丝氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用也很难发生。121.2.3类似物抗性变异株的方法用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。13高丝氨酸脱氢酶例如，在黄色短杆菌的赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成中（图5-16所示），选育抗苏氨酸结构类似物2-氨基-3-羟基戊酸（AHVr）突变株，得到了具有反馈抑制抗性，高丝氨酸脱氢酶活性提高1300倍，能积累14g/L苏氨酸的突变株。141.2.4体内及体外基因重组的方法基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。15代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。其主要步骤为:鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶);取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等);将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物;使调节元件的作用及培育条件最优化。通过基因工程技术，构建理想的工程菌株1.2.5基因工程菌161.2.5.1载体-受体系统及克隆表达的研究1.2.5.1.1受体的获得目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。171.2.5.1.2载体的构建有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得;载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。181.2.5.1.3基因转移手段由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受到原生质体再生条件的局限，效率不高;电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍。接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。191.3氨基酸发酵的代谢控制

是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之二

菌种的代谢调控:控制发酵的条件控制细胞渗透性控制旁路代谢降低反馈作用物的浓度消除终产物的反馈抑制与阻遏作用促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成201、控制发酵环境条件专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。212、控制细胞渗透性生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。细胞内生物素水平高，Glu不能通过细胞膜青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。表面活性剂增加细胞膜通透性氨基酸发酵必须考虑的重要因素22细胞透性的调节细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等，达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜甘油：甘油缺陷型菌株丧失α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂。限量供应，控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。表面活性剂：对生物素有拮抗作用，拮抗不饱和脂肪酸的合成，导致磷脂合成不足，影响细胞膜的完整性，提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。青霉素：抑制细菌细胞壁的后期合成，形成不完整的细胞壁，使细胞膜失去保护，使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性23生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成提高细胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂的合成使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜控制磷脂含量通过油酸的合成通过甘油合成直接控制磷脂合成243、控制旁路代谢254、降低反馈作用物的浓度利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。限制瓜氨酸的浓度可解除反馈抑制，实现鸟氨酸的生物合成。265、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法或者通过选育营养缺陷型菌株。6、促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成ATP的积累可促进氨基酸的生物合成27迄今，日已有22种氨基酸可用发酵法生产。但生产上不一定非用生物合成。根据经济、资源的合理性，利用不同方法生产氨基酸。如蛋氨酸、鸟氨酸用化学合成法，胱氨酸可用提取法水解。但化学合成为D型，右旋。生物合成为L型，左旋。水解法污染厉害。因而总的来说，氨基酸生产要用生物合成。28今后的发展是育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种。提高产酸。采用过程控制，加强种子管理、连续化、自动化、稳产高产、探索新工艺、新设备，以提高产率和收得率、研究微生物生理、生化、遗传变异和发酵机制等问题，以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。29二、氨基酸的应用（一）医药因为蛋白质是由各种氨基酸构成的，所以各种氨基酸及其衍生物可治疗各种不同的疾病。如消化系统经手术后，或烧伤、创伤病例需大量补充蛋白质营养时，可注射各种氨基酸，配比接近鸡蛋的配比为佳。八种必须氨基酸（异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。30（二）食品1．调味用的氨基酸①味精（Glu-Na）其与肌苷酸钠或鸟苷酸钠同时使用，具协同作用，可提高鲜味。②天冬氨酸钠用量仅次于味精的调味品，具强烈鲜味。③甘氨酸甜味为砂糖的0.8倍。在果汁中加0.02%～0.4%的甘氨酸，可去除糖精的苦味。31④DL-丙氨酸。甜味为砂糖的1.2倍。⑤D-色氨酸。甜味为砂糖的35倍。用于牙膏、糖尿病人及肥胖病人。⑥天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯。甜味为砂糖的150倍。但其水溶液不耐热，70～80℃就分解，加热至100℃就失去甜味。2．提高食品的营养价值。8种人体必须氨基酸，不能在体内合成，而各种食品又缺乏某一特定的必须氨基酸，添加之可提高蛋白质的利用率。如。鱼缺色氨酸。强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中)32（三）农业1．增加饲料的营养率。如，谷类缺赖氨酸，豆类缺蛋氨酸。甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料。2．氨基酸农药如，水稻孕穗期使用氨基酸脂肪酸农药N-月桂酰-L-异戊氨酸能防止稻瘟病，提高水稻蛋白质的含量，改进稻米的风味和品质。33（四）工业原料1．人造革D-谷氨酸聚合生成聚合谷氨酸（PLG）2．洗涤剂十二烷酰基谷氨酸（AGS）肥皂以及用月桂酰氨与D/L-GA制成的肥皂，其洗净力，起泡力，乳化力，分散力均好。3．润肤剂（焦谷氨酸钠）脱一分子水形成NPCA-Na。保湿性比甘油好。34请写出从葡萄糖到谷氨酸的合成途径，并说明与合成效率有关的机制35第二节谷氨酸发酵机制一、工艺过程谷氨酸发酵工艺流程

36等电点提取谷氨酸工艺流程37谷氨酸制味精的工艺流程3839国内用糖蜜发酵，要加吐温（表面活性剂）国外用糖蜜发酵，日本加青霉素，法国不用青霉素、吐温、是由其菌特点所决定Glu生长水平好坏有关因素：菌种、工艺、设备条件协同配和正常条件下，菌体产生Glu在发酵液中为1mg/ml(1％)谷氨酸代谢调节，细胞膜透性调节与环境条件协同配和。40第二节谷氨酸生物和成途径代谢控制发酵是用遗传学或其他生物化学的方法，人为地在分子水平上改变和控制微生物的代谢，打破微生物正常的代谢调节，使有用产物大量生成和积累。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，发酵技术的关键是打破微生物的正常代谢调节，人为控制微生物的代谢。葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰CoA，然后进入三羧酸循环，再通过乙醛酸循环、CO2固定作用，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。41由葡萄糖生物合成谷氨酸42二、氨的导入还原氨基化反应（GDH）转氨反应（AT）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应431、谷氨酸生物合成中的几个途径（正常途径）（1）糖酵解途径（EMP）（2）磷酸已糖途径（HMP)（3）三羧酸循环(TCA环)（4）乙醛酸循环（DCA环）（5）二氧化碳固定反应

PEP+CO2+GTP草酰乙酸+GDP

丙酮酸+CO2+NADH苹果酸+NAD草酰乙酸CO2NAD+NADH+H+（6）α-KGA的还原氨基化反应

PEP羧化酶苹果酸酶苹果酸脱氢酶C6H12O6+NH3+O2→C5H9O4N+CO2+3H2O在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：44①苹果酸酶②丙酮酸羧化酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶CO2固定反应(丙酮酸羧化支路)452、GA生物合成的理想途径（1）GA产生菌必须具备以下条件（内在因素）α-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，α-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶ATCA环正常

GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制α—KGA的脱羧氧化46

GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA发酵积累

菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化还原共扼体系该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联

47

3/2GlucoseEMP丙酮酸+丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A+乙酰辅酶A+乙酰辅酶A柠檬酸

则有：3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+4CO2

产率：147/（180*3/2）==54.4%CO2谷氨酸在前述GA合成所必需的条件的基础上，体系不存在CO2固定反应，则有：体系存在CO2的固定反应结论通过DCA环提供C4二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为54.4%在谷氨酸发酵中，DCA环可以作为TCA循环有缺陷时C4二羧酸的补充48.在前述GA合成所必需的条件的基础上（封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：GlucoseEMP丙酮酸+丙酮酸CO2则有：C6H12O6+NH4+==C5H9O4N

+CO2

（来自何方）产率：147/180==81.7%乙酰辅酶A+C4二羧酸CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）苹果酸（苹果酸激酶）柠檬酸（DCA循环封闭）谷氨酸49四碳二羧酸的来源Δ在生产菌中检出CO2固定反应酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和苹果酸酶谷氨酸对糖的转化率达到81.7%C6H12O6+NH3+1.5O2──C5H9O4N+CO2+3H2O需要Mn2+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn2+实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA发酵的糖酸转化率应在：54.4%——81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内：50

提高GA的潜力是很大的，具体表现在：（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn2+，生物素，（2）控制溶氧浓度是非常重要的低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化……高的溶氧浓度，则NADPH有被氧化的可能，……51氨的导入①还原氨基化反应为主导性反应由谷氨酸脱氢酶（GDH）所催化②转氨酶（AT）催化的转氨反应利用已存在的其他氨基酸，经过转氨酶的作用，将其它氨基酸与生成L-谷氨酸③谷氨酸合成酶（GS）催化的反应以-酮戊二酸为基质不能生成Glu，从此可看出H2来自52氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶AT谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GSα-酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶GHD+++53（2）影响谷氨酸合成的外在因素a、生物素对糖代谢的影响生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用）乳酸积累碳源利用率降低，发酵液的pH值下降。而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累A、生物素对GA发酵的影响主要影响糖降解速度，不影响EMP与HMP途径的比率。生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，引起乳酸的溢出。5455研究表明，异柠檬酸裂解酶活性

为醋酸诱导

受琥珀酸的阻遏，抑制当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。b、控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭56c、生物素对氮代谢的影响VH丰富时，出现“只长菌，不产酸”的现象GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。结论氨的导入时生物素缺乏，NH4+影响糖代谢速度：提高糖代谢速度高效合成谷氨酸生物素充足时，NH4+不影响糖代谢速度57关于氮代谢的调节：控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。

58d、VH对菌体细胞膜通透性的影响通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度（干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）来实现的来实现对菌体细胞膜通透性的调节。

葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A乙酰辅酶Ａ乙酰辅酶A羧化酶（辅酶是VH）CO2丙二酰辅酶A丙二酰辅酶AC4C6CO2培养基中生物素限量时，胞内AA92%胞外

培养基中生物素丰富时，胞内AA12%胞外

CO259Glu生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失调使Glu得以积累。生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。

谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能发生特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培养基中积累。60B、供氧浓度

过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。C、NH4+浓度（1）影响到发酵液的pH值（2）与产物的形成有关：过低，不利于α-KGA的还原氨基化；过高，产生谷氨酰胺。NH4+的供给方式：（1）液氨（2）流加尿素61D、磷酸盐过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等…… （2）产生并积累Val，Glucose丙酮酸丙酮酸+活性乙醛α-乙酰乳酸ValVal（1）可以抑制葡萄糖丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止

（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率

（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA的结晶、提出62研究证明：谷氨酸生产菌种存在EMP途径的全部酶和HMP途径的酶有关TCA循环中的柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸能定量地生成谷氨酸，其相应的酶与谷氨酸合成有关以醋酸和乙醇为原料进行谷氨酸发酵时，DCA循环是C4二羧酸的唯一补充来源；但是以葡萄糖为原料时，在谷氨酸生成期此循环应关闭谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和苹果酸酶，与谷氨酸得率正相关63一.控制细胞膜透性的方法1.化学控制方法通过控制发酵培养基中的化学成分,达到控制磷脂,细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的生物合成,使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态,以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。64①控制磷脂的合成,导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜(1)生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,必须限制发酵培养基中生物素的浓度.a.作用机制:生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响磷脂的合成.当磷脂合成减少到正常量的1/2左右时,细胞变形、谷氨酸向膜外漏出,积累于发酵液中。

65b.控制的关键为了形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成不足的细胞膜,必须亚适量控制生物素(5-10ug/l)发酵初期(0-8h)菌体正常生长,菌体形态为单个成对八字形棒形椭圆短杆形,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增期间,开始出现异常形态的细胞,菌体伸长,膨大乃至不规则形,边缘有折绉,稍模糊电镜观察似疱疹样，完成谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞的转变,形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜.谷氨酸高产。若生物素过剩,就会只长菌不产酸或长菌好产酸低。66(2)添加表面活性剂(如吐温60)或是饱和脂肪酸(C16-18)使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时通过添加表面活性剂(吐温60)或高级饱和脂肪酸(C16-18)及其亲水聚酸脂类,同样能清除渗透障碍物，积累谷氨酸a.作用机制表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用,并不在于它的表面效果,而是在不饱和脂肪酸的合成过程中,作为抗代谢物具有抑制作用,对生物素有拮抗作用,通过拮抗脂肪酸的生物合成导致磷脂合成不足,结果形成磷脂不足的细胞膜,提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性67b.影响产酸的关键,必须控制好添加表面活性剂.饱和脂肪酸的时间与浓度,必须在药剂添加后.在这些药剂存在下,再次进行细菌的分裂繁殖.形成处于异常生理状态的产酸型细胞,即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变.例如,以甜菜糖蜜为原料,采用高生物素高吐温工艺。一般于发酵对数生长期的早期(4-6h),添加0.2％吐温60，之后OD值与菌体重约净种增一倍,剩余生长太多,意味着谷氨酸生产菌细胞不能完成有效的生理学变化，剩余生长不足,意味着谷氨酸生产菌没有机会完成这种转变.68(3)油酸缺陷使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,必须限制发酵培养基中油酸的浓度，由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成,丧失了自身合成油酸的能力69(4)甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时,必须限制发酵培养基中甘油的浓度②阻碍谷氨酸生产菌细胞壁的合成作用机制:添加青霉素是抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，进而导致形成不完全的细胞膜。影响产酸关键：702、物理控制方法：利用温度敏感突变株突变位置：发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。影响产酸关键：控制温度转换的时间（30℃提高到40℃的时间），并要在温度转换之后进行适度的剩余生长。71第四节GA生产菌的特征育种及扩大培养一、谷氨酸生产菌的主要特征与菌学性质1.现有谷氨酸生产主要是四个属短杆菌科短杆菌属(Brevibacteriaceea)(Brevibacterium)1.棒状杆菌属(Corgnebacferium)棒杆菌科2.小杆菌属(Microbacterium)(Corgnebacteriaceae)3.节杆菌(Arthrobacter)722.现有谷氨酸生产菌的主要特征这些菌曾分属四个属,但它们在形态及生理方面仍有许多共同的特征（1）细胞形态为球形、棒形以至短杆形（2）G+无芽孢，无鞭毛,不能运动（3）都是需氧型微生物（4）都是生物素缺陷型（5）脲酶强阳性（6）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白及明胶等73（7）发酵中菌体发生明显的形态变化,同时发生细胞膜渗透性的变化（8）CO2固定酶系活力强（9）异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,乙醛酸循环弱（10）氧化能力缺失或微弱（11）还原性辅酶Ⅱ进入呼吸链能力弱（12）柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强（13）能利用醋酸,不能利用石蜡（14）具有向环境中泄漏谷氨酸的能力（15）不分解利用谷氨酸,并能耐高浓度的谷氨酸,产生谷氨酸5％以上74二.国内谷氨酸生产菌及其比较国内谷氨酸发酵已有40年历史.目前使用的菌株主要有:北京棒杆菌(AS.1299)7338S-941WTH-1钝齿棒杆菌(AS1.542)、HU7251、B9B9-17-36F-263天津短杆菌(T6-13)FM-8207FM-415U-9CMTC6282TG-3TG-866D85等菌株多数厂家常用:B9T6-137338等75（一）、北京棒杆菌（7338）与钝齿棒杆菌（B9）的比较在实际生产中，7338菌株与B9菌株的主要区别如下：①细胞大小与细胞形态B9的细胞明显大于7338菌∴在发酵液提取GA上容易与菌分离，提取容易，发酵稳定。而7338因菌体细胞小，相对受噬菌体污染稍轻。B9菌在发酵过程中有明显的菌体形态变化，菌体发生伸长膨大，而7338菌在发酵过程中的形态变化，相对不够明显。76②菌体本身的等电点不同7388在PH4.2-3.0。特别3.5-3.0菌大量沉降，同GA等电点∴菌分离困难，而B9不在此范围，易分离③菌落颜色7338乳白色B9为草黄色发酵过程分泌色素少77④脲酶7388B9活力低∴耐受力强活力高耐受低初尿可达1.8-2.0％初尿0.8流尿2-3次流尿4-6次⑤生物素用量要求范围狭窄4-5ug/l较粗放5-8ug/l（由初糖定）⑥生长因子都以生物素为必需生长因子，7388还需要硫胺素78⑦发酵周期7388后劲足，而前期却不明显，∴周期稍长⑧噬菌体类型不同，不交叉感染，可相调换⑨酯酶谱带蛋白酶谱带，代谢产物都不尽相同。79㈡天津短杆菌（T6-13）与纯齿棒杆菌（B9）的比较①细胞大小：小且多，泡沫稍大提取比B9困难②菌体形态斜面淡白色草黄色发酵中形态变化比B9大前期细胞比较短，圆滚滚，16h后拉长3倍以上③发酵温度前32-34℃前30-32℃`中后36-38℃中后34-35℃（有利于夏天降温条件差的工厂）80④脲酶活力更强初尿0.5-0.6％宜少量多次⑤生物素用量比B9低20％左右⑥糖酸转化率不同45%以上40-45%⑦噬菌体类型相同⑧胶体量分泌胶体较多会干扰等电点GA结晶和菌体分离⑨菌体本身等电点接近谷氨酸等电点提取收率较高为4.2-3.0之间81三、谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化在生产中发现GA生产菌发酵过程中会发现明显的菌体形态的变化。在发酵过程中发现菌体形态有明显的变化时，正是产GA的激增时间。但在发酵培养基含有过剩生物素的培养条件下，菌体形态则没有明显变化，却呈现耗糖长菌不产谷氨酸的异常发酵。82㈠种子的菌体形态将斜面和一、二级种子培养的菌体，用结晶紫染色，经显微观察，发现B9菌，在一、二级种子和斜面种子培养的不同培养条件下，细胞形态基本形似，稍有差异。斜面菌稍小，一、二级种子菌体大而粗壮，革兰氏染色深。0.7-0.9×1.0～3.4um折断分裂成V字形，为谷氨酸非积累型细胞。83㈡谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态生物素为VB的一种，也叫做或辅酶R，参与脂肪酸生物合成限速反应的关键酶，乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸合成。通过控制生物素亚适量，使发酵7-10h后，生物素处于贫乏状态。16-20h后，生物素消耗完，完成谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞转化，表现为OD值稳定，GA产量直线上升，直至发酵结束。84从GA发酵中菌形态变化来看，可分为三个时期：以发酵30-36h的正常GA发酵为例：发酵0-8h或0-10h为长菌型细胞，形态与二级种子相似短杆至棒状菌呈单个、成对或“V”字型发酵8-18h或10-20h为转移期细胞，此阶段细胞形态急剧变化。细胞开始伸长、膨大。从GA非积累型细胞向GA积累型细胞（产酸型细胞）转化，转移期有长菌型细胞，也有产酸型细胞，产酸速度逐渐加快。85发酵16-20h后为产酸型细胞，细胞为含磷脂不足的异常形态，呈现伸长、膨大、不规则，缺乏“V”字型排列，有的呈弯曲形，边缘颜色浅，稍模糊，有的边缘折绉及至残缺不齐，但菌体形态基本清楚。在发酵后期，细胞较长，多呈现有明显的横隔（1-3个或更多）的多节细胞，类似花生状，产酸高，在糖酸转化率高时尤甚。86㈢GA发酵感染噬菌体后的形态感染噬菌体形态也会发生改变。感染噬菌体时期不同改变也不同1.前期染噬菌体镜检可见细胞明显减少，细胞不规则、发圆、发胖、缺乏“V”字形排列视野中有明显的细胞碎片，严重时出现蛛丝、拉网，互相堆在一起。几乎找不到完整的菌体细胞，类似蛛网或鱼鳞状，生产上表现为排气口CO2迅速下降，相继出现OD值下跌PH上升或不上升，耗糖缓慢等异常发酵，应立即停止发酵进行救治。872、发酵中、后期感染噬菌体的菌体形态菌体细胞形态不规则，边缘不整齐有的边缘似乎有许多毛刺状的东西。有细胞碎片，不同于正常发酵的产酸细胞。一般说在生产上中、后期感染噬菌体，OD值虽下降，也常伴有泡沫多、黏度大、耗糖缓慢等异常现象，但及时补加适量营养物，一般仍可完成发酵，产酸在4％左右，但需注意，由于噬菌体侵染细胞后会使细胞内GA溢出，有时产酸会反而偏高，会使噬菌体忽视，这很危险。仍需注意采取措施加以防治。88四．谷氨酸发酵的代谢控制育种1.日常菌种工作①定期分纯②小剂量诱变刺激：可淘汰生长微弱的菌株。③高产菌制做安培瓶。2.选育耐高渗透压菌株①耐高糖选育在20-30％葡萄糖的平板上生长好的突变株。②耐高谷氨酸选育在15-20％味精的平板上生长好的突变株。③耐高糖、高谷氨酸选育在20％葡萄糖，加15％味精的平板上生长好的突变株。893.选育不分解利用谷氨酸的突变株使用不分解利用GA，切断继续向下氧化的反应，即选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变株。平板法：选育不长或生长微弱的菌。摇瓶法：选育OD值净增极少的菌。904.选育细胞膜渗透性好的突变株①抗VP类衍生物②选育溶菌酶敏感性突变株③选育二氨基庚二酸缺陷型突变株二氨基庚二酸为细胞壁的组成成分④选育温度敏感突变株915.选育强化CO2固定反应的突变株①选育以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、大的菌株②选育氟丙酮酸敏感性突变株氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，菌种对氟丙酮酸越敏感，说明菌种丙酮酸向乙酰CoA的转化反应越弱，相对地固定反应占的比例也就越大。926．选育减弱乙醛酸循环的突变株四碳二羧酸是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的，减弱乙醛酸循环，固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高①选育琥珀酸敏感型突变型琥珀酸是乙醛酸循环关键酶异柠檬酸裂解酶的阻遏物，菌体对琥珀酸越敏感，异柠檬酸裂解酶的合成能力就越弱，乙醛酸循环就越弱。②选育不利用醋酸的突变株。937.选育强化TCA中从柠檬酸到代谢的突变株①选育柠檬酸合成酶强的突变株柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，强化该酶能加强GA的生物合成。②选育抗氟乙酸、氟化钠、氮杂丝氨酸、氟柠檬酸等突变株这些物质都是乌头酸酶的抑制剂，抗这些物质的突变株，可强化乌头酸酶的活力948.选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株谷氨酸比天冬氨酸优先合成①选育酮基丙二酸抗性突变株②选育耐高谷氨酸突变株③选育抗谷氨酸结构类似物突变株④选育抗谷氨酰胺的突变株959.选育强化能量代谢的突变株GA高产菌的两个显著的特点是继续向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循环微弱，使得GA菌能量代谢受阻，TCA前一段的代谢（柠檬酸合成到生成）减慢，强化能量代谢可补救上述两个特点造成的不足，使TCA前一段的代谢加强，GA合成的速度加强。①抗呼吸链抑制剂突变株如抗丙二酸，氧化丙二酸，氰化钾等的突变株②抗ADP磷酸化抑制剂突变株，如抗2.4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等的突变株③抗抑制能量代谢抗生素的突变株，如抗缬氨霉素、寡霉素等突变株9610.选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株∵通过HMP途径也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、辅酶Q、叶酸等物质。这些物质生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低。如果削弱或切断这些物质的合成，就会使Glu的产率增加①选育莽草酸缺陷型或添加芳香族AA能促进生长的突变株②选育抗嘌呤、嘧啶类似物突变株③选育抗核苷酸类抗生素突变株，如抗德夸菌素、狭霉素C等突变株。97五．菌种的扩大培养和种子质量要求斜面菌株→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐㈠菌种的扩大培养斜面菌种的培养有利于菌种生长而不长酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得有杂菌、噬菌体，培养基以多含有机氮而不含或少糖为原则。①斜面培养基葡萄糖0.1％蛋白胨1.0％牛肉膏1.0％氯化钠0.5％琼脂2.0-2.5％PH7.0-7.2％②培养条件7338、B930-32℃T6-1333-34℃培养18-21h要求菌苔颜色、边缘正常，斜面只移接三代不宜多次移种。982.一级种子培养目的：培养大量繁殖活力强的菌体①培养基组分：少含糖分，多含有机氮以有利长菌考虑葡萄糖2.5％尿素0.5%硫酸镁0.04%磷酸氢二钾0.1%玉米浆2.5-3.5%（按质增减）FeSO42ppmMnSO42ppmPH7.099②培养条件1000ml三角瓶装200ml,灭菌后置于冲程7.6cm频率96次/min往复式摇床上振荡培养12h7338B930-32℃T6-1333-34℃③一级种子质量要求：种龄12hPH值6.4±0.1光密度净增OD值0.5以上残糖0.5%以下无菌检查㈠噬菌体检查：无镜检：菌体生长均匀、粗壮、排列整齐。100

3.二级种子培养种子罐容积大小取决于发酵罐大小和接种量比例①培养基组成在实际生产中应根据菌体生长情况酌情增减生物素等用量，随时调整培养基组成。②培养条件接种量0.8-1.0%培养温度32℃（T6-13菌为33-34℃）培养时间7-8h）101通风量：50l种子罐1：0.5搅拌转速340r/min250l种子罐1：0.3搅拌转速300r/min500l种子罐1：0.25搅拌转速230r/min（通风量：空气体积/单位体积发酵液·单位时间m3/m3.min)③二级种子质量要求种龄7-8hPH7.2左右OD值净增0.5左右（OD是opticaldensity(光密度)）（DO是dissolvedoxygen;DO（溶解氧））

无菌检查㈠噬菌体检查（无）残糖0.1%左右镜检：生长旺盛排列整齐102㈡影响种子质量的主要因素①培养基构成种子培养基要求含有丰富的N源，足够的生物素少量C源，以利于菌体生长，如糖太多，菌代谢活动旺盛，产生有机酸，使PH降低菌易衰老。②温度：幼龄菌对温度变化敏感，应避免温度过高和波动过大。③PH值：零小时时PH值不宜过高，培养结束时PH值不宜过低，PH上升后有所下降时，培养时间已接近结束。④溶解氧：长菌阶段对氧要求比发酵时低，溶氧水平过高，抑制长菌。⑤接种量：以1%为宜。⑥培养时间：7~8h。103第五节淀粉水解糖制备一、意义及要求：1、意义：碳源是构成谷氨酸的碳架（主要作用），同时产生能量。可用于谷氨酸发酵是淀粉糖、糖蜜，还有醋酸，这些原料一般要预处理;因为谷氨酸产生菌不能直接利用淀粉，因而必水解之。糖蜜的预处理:目的是降低生物素的含量，因为含有过量的生物素会影响谷氨酸的积累。处理方法有：活性炭处理、水解活性炭处理、树脂处理。104磷酸盐、玉米浆、镁盐等分过滤器发酵灌调和配料预处理（水解）发酵培养基调pH连消菌种罐等电沉淀粗谷氨酸中和摇瓶菌种原料种子培养基空气斜面尿素贮罐空气净化系统脱色结晶浓缩成品味精

谷氨酸发酵工艺流程105淀粉葡萄糖糖蜜稀释蜜配料种子罐玉米浆糖蜜磷酸二氢钾硫酸镁无菌空气Fe2+、Mn2+NH3菌种发酵罐106等电提取中和除铁脱色浓缩、结晶离心干燥味精发酵罐Na2CO31072、淀粉水解糖液必须具备要求：满足以下条件：①含糖量﹥16%②糖液清净③糖液不含糊精④糖液不变质⑤透光率：90%以上

⑥转化率：90%左右水解糖液数量（升）

含糖量（%）

100%转化率=投入淀粉量（公斤）

原料淀粉中含纯淀粉%

1.11DE值即葡萄糖值。用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖（所有测定的还原糖权当作葡萄糖来计算）占干物资的百分率。即：DE值=×100%

还原糖用斐林氏法或碘量法测定，干物质用阿贝折光仪测定。在此值得注意的是，阿贝折光仪所测出的浓度是指100g糖液中所含有的干物质的克数；而还原糖含量是指100ml糖液中所含有的还原糖的克数。因此，DE值实际还应除以糖液的相对密度。108DX值：糖化液中的葡萄糖含量占干物质的百分率称为DX值。DX值=葡萄糖含量（%）/干物质含量（%）×糖液相对密度×100%DE值与DX值的区别：葡萄糖的实际含量稍低于葡萄糖值，因为还有少量的还原性低聚糖存在。随着糖化程度的增高，两者的差别减少。109二、淀粉水解糖的制备方法1、酸解法：原理：以无机酸或有机酸为催化剂，在高温高压下将淀粉转化为葡萄糖的方法。特点：生产方便，设备简单，水解时间短，设备生产能力大。要求设备耐腐蚀、耐高温、耐高压，对原料要求严格、易发生付反应、淀粉转化率低。110

淀粉的水解反应淀粉水解总的趋势是大分子向小分子转化，随着淀粉水解程度的增加，糖化液的还原性不断增加。淀粉(amylum)糊精(dextrin)低聚糖(oligosaccharides)葡萄糖(glucose)淀粉水解的化学反应可简单表示如下：（C6H10O5)n+nH2On(C6H12O6)由于有水参与，反应结果有化学增重。理论上，淀粉转化为葡萄糖的转化率为180.16/162.14100%=111.1%实际转化率只有90%。当葡萄糖值超过60时，由于葡萄糖复合分解反应产生其他有味物质（龙胆二糖有苦味）及有色物质。

111淀粉水解的副反应

葡萄糖的复合反应水解热、酸-1，6键聚合成异麦芽糖淀粉葡萄糖糖苷键聚合

-1，6键聚合成龙胆二糖复合反应有害，降低葡萄糖收率。多数复合糖不能被微生物利用。残糖多，产物提取精制困难。112

葡萄糖的分解反应水解热、酸淀粉葡萄糖分解5-羟甲基糠醛甲酸、乙酰丙酸、有色物质。

在淀粉的酸水解过程中，葡萄糖因分解损失的量在1%，但5-羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加精制的困难。5-羟甲基糠醛的含量高，则色素的形成量增多。反应中形成的氨基糖，也对发酵有影响。

1132、酶解法（酶酸法）：原理：先将淀粉乳用α-淀粉酶液化，然后用酸将其水解成葡萄糖。适用性：适于大米或粗淀粉原料，可省去其精制过程，避免淀粉在加工过程中的流失。特点：条件温和，副产物少，原料要求粗放，对微生物生产菌生长有利，糖液质量高。但时间长，过滤困难，设备多。1143、双酶法：原理：先用淀粉酶将原料水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶将后者水解成葡萄糖。特点：水解条件温和，不要求设备耐腐蚀、耐高温、耐高压，对原料要求粗放，但生产周期长。1154、酸酶法

原理：先将淀粉水解成糊精或低聚糖，再用糖化酶将其水解成葡萄糖。适用性：淀粉颗粒较坚硬，用酶水解需较长时间的原料。如玉米、小麦等谷物淀粉。特点：酸液化速度快，产品颜色浅、糖液质量高，但水解时间较长。116

三、酸解法制糖工艺

1.酸解法制糖原理以酸为催化剂，在高温条件下，淀粉发生水解反应，-1，4糖苷键和-1，6糖苷键被切断，淀粉链逐渐变短，淀粉先变为糊精、低聚糖、麦芽糖，最后生成葡萄糖。在整个水解过程中，由于受酸和热的作用，一部分葡萄糖发生复合反应和分解反应，如下所示：复合反应分解反应复合低聚糖葡萄糖有机酸、有色物↑淀粉1172.淀粉酸水解工艺

⑴工艺流程原料（淀粉、水、酸）→调浆→糖化→冷却→中和、脱色→滤除杂→糖液⑵水解条件在淀粉酸解过程中，必须先将淀粉原料调成粉浆，保持一定的浓度和酸度，然后将料液泵入糖化锅，在一定条件下进行水解糖化。118①淀粉乳浓度的选择淀粉水解时，淀粉乳的浓度越低，水解液的葡萄糖值越高，糖液色泽越浅。淀粉乳的浓度高，易发生复合分解反应，故一般控制在10~11

Be’。②酸的种类和影响常用的酸：盐酸、硫酸和草酸。催化效率：盐酸最强，其次是硫酸、草酸。119催化能力强，但中和后产生氯化物，增加糖液灰分，影响结晶、分离和收率。颜色浅。催化能力较强，但用硫酸钙中和时,生成的硫酸钙在蒸发时易生成结垢，影响传热。催化能力较低，用碳酸钙中和时，生成的草酸可基本除去，糖液纯度高，颜色浅。盐酸硫酸草酸120酸的添加方法添加方法不同，对水解有很大影响。一般是先将1/3左右的酸用水稀释后放入锅内，其余酸放入粉浆中，再泵入糖化锅进行糖化。

酸的添加量和添加法加酸量——以淀粉乳的pH值为指标，当采用10~11

Be’的淀粉乳时，加盐酸0.5-0.8％，控制pH值在1.5左右。121③压力和时间的选择糖化压力与水解反应速度成正比，压力升高，水解反应速度加快，反应时间短；反之，压力降低，反应时间加长。高温短时间是最佳的水解方法，蒸汽压力一般为245~392KPa。④糖化设备的选择糖化锅的结构对糖液质量有直接的影响。若糖化锅的体积太大，进出料的时间长，使淀粉水解时间差别大，部分先水解的生成的葡萄糖易发生复合分解反应。因此，一般味精厂采用的糖化锅径高比为1：1.5~2.5。122⑶水解糖液的中和、脱色和除杂在淀粉水解的同时，淀粉原料中的其它物质，如蛋白质、脂肪、纤维素、无机盐等也发生变化，所生成的物质影响糖液的纯度。如氨基酸能与葡萄糖的分解产物反应，形成色素，使糖液色泽加深。故水解糖液必须加以中和、脱色和除杂。①中和淀粉水解糖化后，糖化液温度很高（140~150℃），经冷却后才能中和。中和的目的是降低糖化液酸度，调节pH值。生产中常用的中和剂有纯碱、氢氧化钠溶液，中和温度控制在80℃，终点pH控制在4.0~5.0。123②脱色和除杂水解糖液中的杂质不仅对谷氨酸发酵不利，而且影响谷氨酸的提纯。糖液脱色方法活性炭吸附法离子交换树脂脱色法。活性炭的用量为0.2%~0.8%，脱色温度为70~80℃。在脱色过程中要保证一定时间的搅拌，使活性炭充分起作用。124三、双酶法制糖工艺双酶法制糖工艺主要包括淀粉的液化和糖化两个步骤。1.淀粉的液化在-淀粉酶的作用将淀粉水解生成糊精和低聚糖。⑴升温液化法将淀粉乳（30%~40%）调整pH为6.0~6.5，加入CaCl2，使Ca2+达到0.01mol/l，加入定量的液化酶，在保持剧烈的搅拌下，加热到80~90℃，保持30min左右，达到所需的液化程度，然后升温至100℃，灭酶10min。淀粉液化的方法升温液化法、高温液化法、喷射液化法和分段液化法。1252.糖化⑵高温液化法将淀粉调整好pH和Ca2+浓度，加入所需的液化酶，用泵将其打入液化桶（桶内有90℃的热水），淀粉受热糊化、液化。由桶底流入保温桶，90℃保温40min,达到所需的液化程度。糖化温度和pH取决于所用糖化剂的性质，若用曲霉糖化剂，温度控制60℃，pH为4.0~4.5；若用根霉糖化剂，温度控制在55℃，pH为5.0以下。在实际生产中，根据酶的特性，尽量选用较高的糖化温度，这样可以加快糖化速度，减少杂菌污染的机会。126第六节谷氨酸发酵控制谷氨酸产生菌能在体外大量累积GA。首先是菌的代谢调节异常化，即具有一定生理特性的菌种是产生谷氨酸的内因和根据。这种异常化代谢的菌种对环境条件是敏感的。生产菌合成GA比生物合成Pr、核酸等菌体成分需要更多的能量。127在最适宜的培养条件下GA产生菌可把60%以上的葡萄糖转化为GA，而只有极少量的副产物。与之相反，如果培养条件不适宜，几乎不产生GA，而得到大量菌体或由谷氨酸发酵转换为累积乳酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、缬氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰谷酰胺等。这些现象称为：发酵转换。菌种性能越高，使其表达接近它应有的生产潜力所必须的条件越难满足，对环境波动更为敏感，可见环境条件的控制对GA发酵成败的重要性。128谷氨酸产生菌因环境条件的发酵转换控制因子发酵转换氧乳酸或琥珀酸谷氨酸α-酮戊二酸（供氧不足）（供氧充足）（氧过量）生物素乳酸或琥珀酸谷氨酸（充足）（限量）NH4+α-酮戊二酸谷氨酸谷酰胺（不足）（适量）（过量）PHN-乙酰谷酰胺谷氨酸（酸性）（中性或微碱性）磷缬氨酸谷氨酸（高浓度）（适量）129130一．发酵培养基不同于种子培养基，其需大量C、N源，以供合成GA，但生物素却需控制用量。发酵工业原料主要指发酵培养基中较大宗成分，其选择要考虑到菌体生长繁殖需要，更要注意到有利于大量积累GA。还要注意原料来源丰富、价格便宜、发酵周期短、对产物提取无妨碍。131㈠碳源1、作用：菌体和GA的碳架和能量的来源2、种类：糖类、脂肪、某些有机酸、某些酸类和烃类。生产上以淀粉水解糖为碳源的发酵。1323、要求：①糖浓度一定范围下GA产量随糖浓度增加而增加，但糖浓度过高，工艺条件不配合，谷氨酸对糖的转化率低，同时氧溶解的阻力大影响供氧效率。国内125-150g/l(12.5-15%)糖，产酸55-70g/l(5.5-7.0%).一次高糖发酵工艺糖170-190g/l(17-19%)，产酸可达80g/l但周期长，采用低糖流加。②淀粉水解糖质量对谷氨酸发酵影响很大。（1）淀粉水解不足（糊精存在）——则浪费，再会使使泡沫过多，影响发酵。（2）淀粉水解过分葡萄糖复合生成龙胆二糖、异麦芽糖等非发酵生糖或葡萄糖发生分解反应。133㈡氮源1．作用：合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成GA的氨基的来源，同时在发酵过程中一部分用于调节PH。所以需要的N源比一般工业高。一般发酵工业C/N为100：0.2-2.0。谷氨酸C/N为100：15-30。当C/N比在100：11以上才开始积累GA。C/N比对发酵影响很大。134在GA发酵中合成菌体的N占总耗用氮3-8%，而30-80%用于合成谷氨酸。

长菌：NH4+过量会抑制菌生长。产酸：NH4+不足不能形成GA而积累α-酮戊二酸。135①无机氮：尿素、液氨、碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等菌利用无机氮比有机氮快，铵盐、尿素、氨水等比硝基氮快常用无机氮有以下几种：㈠尿素但灭菌温度过高，时间过长，产生缩脲反应生成双缩脲和氨。高浓度尿素溶液具抑制菌作用，尿素灭菌温度不宜高。工厂尿素配成40%，100℃灭菌。136尿素在GA发酵中作用：⑴组成菌体含氮物质⑵组成GA的氨基⑶调节PH值形成谷氨酰胺。可分批流加。氨水用pH自动控制连续流加。137例：发酵初糖140g/l总尿为38.5g/l谷氨酸产量为68g/l用于形成谷氨酸铵的尿素占总尿的百分比为式中60、147分别为尿素和谷氨酸的分子量138当发酵液中干菌体含量为10g/l干菌体合氮量为16%。用于合成菌体所消耗的尿素为∴上述情况下形成谷氨酸氨仅占总尿36%，调节PH也占36%，合成菌体的仅5.56%。139⑵液氨含氨量99-99.8%也可用氨水含氨量20-25%⑶NH4HCO3含氮17.6%②有机氮主要为蛋白质、胨、氨基酸等，谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆、麸皮水解液、米糠水解液、豆饼水解液和糖蜜。有机氮利于长菌，GA发酵对有机氮需要量不多。140㈢无机盐1．磷是某些Pr和核酸的组成成分。常用和也可用磷酸。磷过高菌体代谢转向合成缬氨酸磷过低，菌生长、糖代谢不好2．Mg是糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，要求最低为25ppm。硫是构成一些酶的活性基。存在于细胞蛋白质中，培养基中S已在MgSO4中供给，不必另加。1413．钾盐K是许多酶的激活剂，可促进糖代谢，菌生长需钾约为0.1g/l（以K2SO4计，下同）GA生成需0.2-1.0g/l。钾少长菌体，钾多产GA（培养基配1g/lK2HPO4钾浓度约为0.38g/l，钠在培养基中起调节渗透作用，一般在调节pH时已加入足够量，不必另外加）1424．微量元素微生物需要量十分微小，但又不可完全没有的物质。Fe2+是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成成分，Fe2+2ppmMn2+是某些酶的激活剂，羧化反应需锰。草酰琥珀酸脱羧生成α-酮戊二酸是在Mn2+存在下完成的MnSO4·4H2O2ppm5．有害元素Hg、Cu2+SO4对氨基酸发酵有明显毒害作用。143㈣生长因子广义来讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物。如：AA、嘌呤、维生素等都可称为生长因子。生长因子不是所有微生物都必需的，只是某些自己不能合成的才是必需的。目前以糖质原料为C源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子，有些菌株还以硫胺素为生长因子，有些变异株油酸缺陷型还以油酸为生长因子。1441．生物素作用：影响GA产生菌细胞膜透性及代谢途径。菌体从培养液中吸取生物素的速度是很快的，远远超过菌体繁殖所消耗的生物素量生物素为VB的一种叫VH或辅酶R1452．维生素B1（硫胺素）对某些GA菌种发酵有促进（如7338）3．提供生长因子的农副产品原料①玉米浆：亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，一般用量0.4-0.8%，含丰富生物素等。②麸皮水解液：可代替玉米浆，但Pr、AA等营养成分比玉米浆少，用量1%左右。③糖蜜：可代替玉米浆但AA、有机氮低、甘蔗糖蜜用量0.1-0.4%④酵母：酵母膏酵母浸出粉146二．pH值对GA发酵的影响pH值常以以下几方面影响微生物的生长和代谢产物形成⑴影响酶活性⑵影响微生物细胞膜所带电荷⑶影响培养基某些营养物中间代谢产物的离解，影响微生物对这些物质的利用⑷PH值的变化往往引起代谢途径的改变147国内味精厂采用尿素流加法来控制PH值优点：由于尿素的分解、利用及PH值变化有一定规律性容易控制流加量和次数根据：1。PH值的变化2。菌生长耗糖，发酵的不同阶段来决定菌生长缓慢、耗糖慢，应少量多次，pH值稍低以利长菌，尿酶活力较弱，耐尿力强，可初尿多，流加量多，次数少。前期PH7.5（控制杂菌）中期7.2后期7.0放罐