金线莲与菌根真菌共生萌发的营养及生态调控

序号：编码：“挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛决赛作品申报书作品名称：金线莲与菌根真菌共生萌发的营养及生态调控所在学院：农学院申报者姓名（集体名称）：苏嘉欣陈志辉陈晓君林依敏类别：√自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文□科技发明制作A类□科技发明制作B类

说明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2．申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由竞赛组委会填写。5．学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。

A2申报者情况（集体项目）说明：1．必须由申报者本人按要求填写；2．申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3．本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓名苏嘉欣性别女出生年月1987.7学院农学院系别、专业、年级06级生态系生态学历本科在读学制4入学时间 2006.9作品名称金线莲与菌根真菌共生萌发的营养及生态调控毕业论文题目蚯蚓菌根黑麦草联合修复PCBs污染土壤的效应通讯地址广州天河五山路486号，华南农业大学跃进南34208邮政编码510642办公电住地通讯地址广州天河五山路486号，华南农业大学跃进南34208邮政编码510642住宅电话02038694884其他作者情况姓名性别年龄学历所在单位陈晓君女1986.12本科在读农学院林依敏女1988.01本科在读农学院陈志辉男1985.07本科在读园艺学院资格认定学院学籍管理部门意见以上作者是否为2009□是□否（部门签章）年月日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果□是□否负责人签名：年月日

B1．申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1．必须由申报者本人填写；2．本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3．作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4．硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（D）A．机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等）C．数理（包括数学、物理、地球与空间科学等）D．生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健康、卫生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路作品的科学性、先进性及独特之处利用金线莲与真菌共生克服组培苗产周期长，成本高，移栽成活率低，植株抗病虫能力低的缺点。从一个新的角度研究其栽培繁殖方法，为金线莲规模化人工栽培提供新途径，对解决野生金线莲自然资源匮乏问题有重要意义。作品的实际应用价值和现实意义金线莲（AnoectochilusroxburghiiHayata），药材名为金线莲、本山石松、药虎、药王、鸟人参等，为兰科花叶开唇兰属植物。金线莲植株叶背呈紫红色，叶24枚，呈卵形或卵圆形，全草可入药，常作为滋补强壮剂，其味甘微苦，性平微寒，具有解毒、止痛、镇咳等功效。民间多用于治疗肺结核、肺热咳嗽、风湿性关节炎、小儿惊风、跌打损伤、蛇咬伤等多种疾病，均有很好的疗效。近年来，金线莲用于治疗高血压、糖尿病及肿瘤等疑难病症所取得的成效，日益引起医药界的重视。民间称其为“神药”，在台湾称为“中药之王”，目前台湾市场上其鲜草的价格为每50克300400元新台币。其药用功效在《全国中草药汇编》（1998年版）中有记载记载。日本医药科技人员还从金线莲中分离出有药效的成分并申请了专利。除药用之外，金线莲也是一种观赏价值极高的室内观叶珍品，被称为珠宝兰。目前台湾南投县和福建、广西等地开始采用组培苗进行人工栽培以满足市场需求，然而，组培苗成本和价格高居不下，每株苗约需0.5～0.8元人民币，每亩用苗量约20万苗，栽培1亩在种苗上的投入就需10多万元，同时组培苗移栽到大田后成活率低、生长周期长和易发病等方面在技术上无法取得突破，使金线莲栽培业者面临着巨大的风险，严重制约着金线莲事业的向前发展。本项目模拟金线莲在自然界与真菌共生繁殖之方式，通过分离、鉴定与金线莲共生的菌根真菌，并同时用共生真菌侵染组培苗幼苗，以建立共生关系得到共生苗，并通过人工调控真菌与植物共培养营养配方与环境参数，提高金线莲组培苗与真菌的侵染率并培育成为菌根共生壮苗，提高种苗移栽后的存活率和抗病力，降低金线莲栽培的种苗成本和种植风险，为实现金线莲的规模化种植提供理论基础。本作品的实施，提高培育所得幼苗的移栽成活率高、生长速度和抗病、抗逆能力，克服金线莲原材料生产的技术“瓶颈”，促进金线莲得开发和利用，即可以满足市场和消费需要，有望为企业创作可观的经济效益，对于弘扬我国中医药文化具有重要的社会意义，也在很大程度上对我国濒危的野生金线莲种植资源起到较大的保护作用。学术论文文摘作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录李焕椹，刘国柱，周正仁.台湾药用植物之探讨.国立中国医药研究所.台北市.1976陈裕，林坤瑞，管其宽，林镜明。金线莲生物学特性及生境特点研究。亚热带植物通讯，1994,23(1)：1824陈裕，林坤瑞，管其宽，林镜明。金线莲的开花特性。亚热带植物通讯，1996，25(1)：3537胡珊梅，张启国，袁文杰，周涵韬，周兴旺，陈鹭真。珍稀中草药金线莲的RAPD研究。中草药，2000，31（12）：1316戴国兴。珍贵药用植物金线連之组织培养繁殖。中华农学会报，1986，137：4254肖三元.金线兰组织培养及快速繁殖研究.广西热作科技.1998（1）：1214林兰英等.金线莲组织培养中若干因素的研究.亚热带植物通讯.1993.22（2）：711肖翌柱等.台湾金线莲之组织培养.中华农业研究.1995.44（3）：279286于雪梅,郭顺星.内生真菌促进珍稀中草药金线莲生长发育的菌根结构研究.中国北京:2000.张集慧,王春兰,郭顺星,etal.兰科药用植物的5种内生真菌产生的植物激素.中国医学科学院学报.1999，21(6):460465于雪梅,郭顺星.金线莲与内生真菌共生培养体系的建立.中国中药杂志.2000，25(2)：8284.郭顺星;于雪梅;高微微;陈晓梅;王春兰;孟志霞;肖培根.菌根真菌在金线莲大面积栽培中的应用.国家发明专利，公开号：CN1961651，公开日期：2007.05.16Beyrle,H.F.,Smith,S.E.,Peterson,R.L.andFranco,C.M.M.ColonisationfoOrchismorioprotocormsbyamycorrhizalfungus:effectsofnitrogennutritionandglyphosateinmodifyingtheresponses.CanadianJournalofBotany.1995.73:11281140.Hadley,G.Nonspecificityofsymbioticinfectioninorchidmycorrhiza.NewPhytologist1970(69):10151023TakeshitaT.etal.Hypoglycemicsandlipidmetabolismimprovingagentscontaining3glucosyloxy4hydroxybutyricacidoritsderivastivesfromplant.Jpn.KokaiTokkyoKoho（即：日本公开专利公报）JP1995,7,76522申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）科研管理部门签章年月日

C.当前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写；2.填写此栏有助于评审。金线莲的生产和研究中心在台湾省，近年来，台湾当局有关部门对金线莲的开发研究给予了相当大力的支持，得到台湾官方立项多个项目的支持。在内地，福建省是开展金线莲研究最活跃的地方。福建省科委曾于1991年立项支持该省亚热带植物研究所陈裕课题组开展了金线莲家种配套新技术及生物学研究；几年前，厦门市卫生局立项资助厦门市药品检验所胡珊梅等应用分子生物学实验方法进行金线莲品种鉴别的研究。苗生产是金线莲人工栽培的重要环节，金线莲组织培养育苗技术已趋于成熟。台湾在组织培养繁殖金线莲方面开始得很早，肖三元、林兰英和台湾的萧翌柱等分别对金线莲的组织培养进行研究，在台湾南投县已经形成采用组培苗进行金线莲规模栽培的精致农业。但金线莲组培苗致命的缺陷是不抗病，栽培期间容易受到茎腐病为害。据观察，茎腐病总是发生在栽培基质所掩盖的地下茎部位，加之金线莲茎叶具有很强的持水能力，当地下茎部严重腐烂时植株上部茎叶也不会出现明显的萎蔫，因此，在茎腐病发病的初期很难觉察。同时由于金线莲是药用植物，因此在管理时不能够经常喷药防病，而当出现病症时，喷洒农药已经是为时过晚了。金线莲的大规模人工栽种仍然面临极大的挑战，如何培育抗病壮苗乃成功之关键。组培苗与真菌共生形成菌根苗，其抗病能力则大大增强，不易受到病菌的危害，成活率大大提高。菌根真菌是目前真菌学和植物生理学之交叉学科的研究热点之一，在植物种苗的培育和引种移植方面具有重要意义。共生菌根在天麻人工栽培上的应用是目前兰科植物中最为成功的事例。真菌侵入兰科植物组织过程中，产生的纤维素酶和果胶酶有助于真菌在原球茎中的定殖；同时真菌的入侵也会诱导植物的防御反应和诱导抗侵入，主要表现在细胞壁的增厚、胼胝质淀积、水解酶和植保素的产生等，从而加强了植株的抗病和抗逆能力。真菌与胚的相互作用就如进攻和防御的战场一样，最后有三种不同的结果：(a)菌根相互作用：真菌成功侵入并在在原球茎的薄壁细胞中形成菌丝球，之后被溶解利用，促进植株的生长。(b)寄生物的相互作用：真菌成功侵入后在相互作用的过程中，兰花细胞由于菌丝的过度生长而导致原球茎的死亡。(c)抗性反应：真菌会被排斥在兰花组织之外。这种相互作用可能在一群类原球茎中同时发生，值得注意的是，这种植物真菌的关系具有动力学的和相对不稳定的特性。在任何兰花种类中，发生的比例都受到营养和环境因子的影响，人工控制培养条件，特别是在培养基中调节碳源和氮源的化合物的种类和浓度，能够改变以上三种不同种类原球茎的比例；因此，共生机制的研究和共生平衡关系的建立一直是兰花菌根研究的主要课题。与组培苗相比较，共生苗具有抗病、抗逆、适应能力强和生长较快的优点。但目前尚未见有关丝核菌（Rhizoctoniasp.）侵染金线莲建立共生关系的报道。采用真菌与组培苗建立共生关系是获得共生金线莲苗的一条途径，于雪梅等对金线莲内生真菌进行了分离，并研究了其生物学活性及所产生的植物激素，还试图建立金线莲组培苗与内生真菌共生培养体系，以期通过组培苗与真菌共生获得共生苗；郭顺星等采用石斛小菇(Mycenadendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、兰小菇(Mycenaorchidicola)、开唇兰小菇(Mycenaanoectochila)分别培养菌根真菌和金线莲幼苗，再将菌根真菌与金线莲幼苗共生栽培的技术，但效果并不理想。可见，目前金线莲共生苗的培育技术还远未成熟，且目前尚未见有关金线莲组培苗共生萌发的报道。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1．由推荐者本人填写；2．推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）；3．推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4．推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓名方祥性别男年龄38职称副教授工作单位华南农业大学食品学院通讯地址广州天河五山路486号，华南农业大学食品学院邮政编码510642单位电话020885280267住宅电荐者所在单位签章（签章）年月日请对申报者申报情况的真实性作出阐述申报者已做了大量工作，申报材料真实可信。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价菌根真菌是目前真菌学和植物生理学之交叉学科的研究热点之一，在植物种苗的培育和引种移植方面具有重要意义。金线莲是一种名贵中草药，目前自然界已颦临灭绝，如何保护和合理开发是摆在广大研究者面前的一项重要课题。虽然组培技术基本成熟，但组培苗天生的缺陷使其难以越夏，如果组培苗与真菌共生形成菌根苗，其抗病能力则大大增强，不易受到病菌的危害，成活率大大提高。本研究技术成熟对于金线莲的保护和开发均具有重要的理论意义和经济价值。其它说明金线莲与菌根真菌共生萌发的营养及生态调控申报材料清单（2008.8.262009.3.3）项目进展：一、金线莲与菌根真菌共生培养体系的建立1、促进形成共生的培养基筛选1.1第一批预试验1.2第二批预试验1.3第三批预试验1.4正式实验1.5正式实验22、不同基质上金线莲与真菌的共生2.1移栽苗二、菌根真菌组织学观察三、菌根真菌重分离与鉴定3.1丝核菌的分离3.2丝核菌培养性状的观察3.3丝核菌菌丝的观察及其直径的测量3.4丝核菌细胞核的染色3.5菌丝融合测定四、菌种的分子鉴定（正开展）现在已完成的四批预实验中，除第一批未达到预期目的外，其余三批预实验都能建立共生体系，并且形成共生类原球茎，进而分化成共生苗。四批预实验初步探讨了不同因素对共生体系建立的影响，为正式实验的进行提供依据。现已开展的正式实验2从不同因素、水平上探讨对金线莲与菌根真菌共生培养体系的建立的影响因素。同时，将第三批预试验的共生苗移栽，探讨共生苗在外界环境中的生长状况，为应用于生产提供依据。我们也进行了菌根的组织学观察，探讨了菌根的形成过程。菌根真菌重分离与鉴定阶段，我们探讨了与金线莲形成共生的三种真菌的形态特性、菌落特征，初步判断这三种真菌为同一菌属。现阶段的菌种的分子鉴定，目的是为了鉴定三种真菌是否为同一种，以及寻找真菌诱导金线莲特异表达的基因。一、金线莲与菌根真菌共生培养体系的建立1、促进形成共生的培养基筛选1.1第一批预试验2008.8.26目的：观察板栗叶对金线莲与真菌共生是否有促进作用方法：将苗分成尖、茎、头、全株几部分，分别接到带菌的板栗叶子上，板栗叶预先用PDB侵泡过，菌先于苗5天接种。同时设对照，培养条件分黑暗和光照两种。选板栗叶的原因：金线莲野外生长最适宜环境是山涧常绿阔叶林树林的枯枝落叶层中，并且根据文献可知板栗叶中有某种物质能促进丝核菌的生长。说明：材料来自生科院，分嫩苗、中等苗、老苗。尖指最苗的最上端部分，茎是苗中间部分，头指最苗下端，都带12个节。表1.1.1培养条件：25摄氏度黑暗，提前5天接菌JSH1时间10天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系备注嫩苗尖180018100%否一些是腐烂大半，但几乎是死亡，活不了。嫩苗茎5005100%否嫩苗全株604233.33%否中等尖5005100%否中等茎63300%否气生根43100%否老苗尖302133.33%否总共476103165.96%时间22天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系嫩苗尖180018100%否嫩苗茎5005100%否嫩苗全株611466.67%否中等尖5005100%否中等茎611466.67%否气生根411250%否老苗尖3003100.00%否总共47334187.23%表1.1.2培养条件：25摄氏度光照，提前5天接菌JSH1时间10天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系备注嫩苗尖1001990%否嫩苗茎7007100%否嫩苗全株503240%否中等茎1113763.64%否老苗尖502360%否老苗茎12021083.33%否气生根10100%否总共511123874.51%时间22天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率共生关系嫩苗尖100010100.00%否嫩苗茎7007100.00%否嫩苗全株5005100.00%否中等茎110011100.00%否老苗尖5005100.00%否老苗茎120012100.00%否气生根1001100.00%否总共510051100.00%表1.1.3培养条件：25摄氏度光照，不接菌时间10天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率嫩苗尖40400%嫩苗茎503240%嫩苗头301266.67%中等茎650116.67%老苗尖44000%老苗茎98100%气生根44000%总共35219514.29%时间22天材料个数存活（全绿）半死（部分绿部分腐烂）死亡死亡率嫩苗尖4004100.00%嫩苗茎5005100.00%嫩苗头3003100.00%中等茎610583.33%老苗尖4004100.00%老苗茎950444.44%气生根44000.00%总共351002571.43%结果：4天后部分组织出现腐烂，10天后，接有菌的嫩苗几乎全部死亡，中老苗也出现大量死亡；对照大部分存活。22天后观察，接菌的几乎全部死亡；20℃黑暗条件下培养比25℃光照培养的稍好，但不接菌的相对生长良好，依然有几个存活，总体苗与菌没有形成共生。结论：板栗叶对金线莲——真菌共生体系基本没有多大的促进作用，对丝核菌的生长有促进作用。1.2第二批预试验目的：比较在不加葡萄糖PDA（20%马铃薯+0.8%琼脂）、1/2PDA（20%+1%葡萄糖+0.8%琼脂）、PDA（20%+2%葡萄糖+0.8%琼脂）中带板栗叶和无板栗叶水的培养基中金线莲与丝核菌的共生情况。方法：将菌JSH1与苗接到以马铃薯葡萄糖琼脂为基础的培养基上。培养基分为,全G（全葡萄糖）PDA、1/2G（1/2葡萄糖）PDA、无G（无葡萄糖）PDA，部分还添加10%板栗叶汁，接菌时间分提前5天接菌和同时接菌两种，苗分为尖、茎、全株三种，培养条件为25摄氏度，光照培养。说明：下列表“+”表示是或有，“”表示否或无表1.2.1不同培养基中接菌金线莲出现类原球茎的情况培养基瓶编号株树同时接菌类原球茎最初出现类原球茎天数类原球茎个数(33或38天后)出现类原球茎株数平均类原球茎个数（个/株）备注全G板栗叶汁15+1953无板栗叶汁35+3022无板栗叶汁205++172041/2G,板栗叶汁茎54+1633茎+尖+全65+1954尖73+2311全83+2332茎94+00茎123+不祥不祥0污染不作记录尖163+00无G板栗叶汁全+茎+尖145++19不祥不详污染全+茎173+1921全+茎185+1832表1.2.2不同培养基中对照培养基瓶编号原球茎生长状况备注全GCK板栗叶汁20良好污染CK无板栗叶汁40良好污染1/2G,板栗叶汁CK茎100良好CK尖110良好CK全150良好无G板栗叶汁CK茎+尖190良好结果：4天后，全葡萄糖的、1/2葡萄糖的、无葡萄糖的都有出现发黄腐烂情况，而且几乎都是茎出现这种情况。13天后，全葡萄糖中有一瓶出现类原球茎。16天后，全葡萄糖、无葡萄糖、1/2葡萄糖各有一瓶出现类原球茎；20天后，总共有8瓶出现类原球茎。有类原球茎的多为茎部，也有在整株的节间生长，长有类原球茎的苗明显比没有的粗壮。在菌侵染初期，茎生长情况为表面呈发黄或停止生长状态。1.3第三批预试验2008.10.8目的：比较在DE、DE+1%板栗水、DE+5%板栗水培养基中，金线莲与JSH1、JSH4、JSH5丝核菌的共生情况。方法：将苗（全株）与丝核菌同时接到以DE为基础的三种培养基上，观察其共生情况。菌种：JSH1、JSH4、JSH5；培养基：DE、DE+1%板栗叶汁、DE+5%板栗叶汁。同时接全株苗，并在25℃光照培养，并以无接菌的相应处理为对照，每处理3重复。说明：材料来源生物研究所，苗总体比较弱，就其叶色可分两种，一种偏粉红、一种偏绿色，稍壮些。接种时随机，接种前对底部稍切割下，去掉黑色部分，全部无根。“++”表示粗壮非常好；“+”表示生长良好或稍瘦弱；“”表示苗已经变黄，或上半节枯萎下面生长；“”表示完全死亡。下述株高、鲜重、叶片数均为平均值。表1.3.1不同培养基中接菌金线莲培养基菌种株高(cm）鲜重（g）叶片数接种当天(10.8)两个月后(12.7)接种当天(10.8)两个月后(12.7)接种当天(10.8)两个月后(12.7)DEJSH13.0166674.9583330.126667未统计24.375JSH42.0583335.0985350.1166671.749754.208333JSH52.1916674.7166670.131.750254.541667CK2.4443.6330.1433332.5534.833333DE+1%板栗叶汁JSH11.8555565.5150.14666723.666667JSH41.2333333.780.081.3333.333333JSH51.4111115.780.1211111.8894CK1.5444443.550.1566671.442.888889DE+5%板栗叶汁JSH11.5222223.9430.1355561.5563.166667JSH41.2555563.1330.151.7782.5JSH51.2111113.450.0933331.443.5CK1.1777783.010.1044441.443.055556表1.3培养基菌种株高差叶片差营养根差气生根只差原球茎差两个月之差DEJSH11.9431.8330.1671.6670.667JSH43.0422.4320.0911.8180.5JSH52.5282.250.1671.5830.044CK1.1861.5610.8891.5560DE+1%板栗叶汁JSH13.6641.6670.51.3330.833JSH42.5472.00301.2221.556JSH54.3692.1101.6670.778CK2.0061.4490.3330.7780DE+5%板栗叶汁JSH12.4181.583培养基颜色过深看不清11.429JSH41.8740.8450.6670.667JSH52.2392.060.80.6CK1.8321.8931.2220Duncan法培养基平均株高(cm）差异显著性0.01DE+1%板栗叶汁4.656ADE4.601BDE+5%板栗叶汁3.384C培养基平均叶片数差异显著性0.01DE4.49ADE+1%板栗叶汁3.472BDE+5%板栗叶汁3.125C菌种平均株高(cm）差异显著性0.01JSH14.805AJSH54.649BJSH44.003CCK3.398D菌种平均叶片数差异显著性0.01JSH54.0139AJSH13.7361ABCK3.6852ABJSH43.3472B结论：供试培养基和供试菌种均对金线莲影响明显。不同菌种对金线莲的影响差异明显。接菌的金线莲生长快，旺盛，均比对照株高。此外，板栗叶汁可能通过影响菌的生长来影响共生体系的建立。DE+5%板栗叶汁的培养基中，菌生长较旺盛，类原球菌出现时间均比DE、DE+1%板栗叶汁早，但存活率比其它两者低，这可能与菌侵染强度有关。经观察发现，真菌的生长和侵染速度适度，就容易与金线莲建立共生体系；过弱侵染速度缓慢，建立的共生时间长；过强侵染激烈，会增加金线莲的死亡率。因而还需要进一步的试验以探明菌的最适合生长速度。1.4正式实验方法：将苗去掉上端，茎分成上茎与下茎两部分，接到不同培养基中，每瓶一株苗，即只有一个上茎与一个下茎。观察几个单因素对原球茎产生的影响，每个水平4瓶。除了考虑各因素外，其余都是（1/2PDA,25ml,中光,同时接菌，葡萄糖）。说明:"++"表示保持绿色；“+”表示绿中带黄；“”表示黄中带绿；“”表示死亡。原球茎只算能辨别清的，那些辨不清是否原球茎的白点不计算。表1.4.1各因素对金线莲生长及共生的影响观察时间12.8因素水平编号生长状况死亡株数原球茎接种时间61/++202/03/++04+/031/702/+03/04/031/+102+/+03/+061++/+002++/+03+/+04+/+0菌种JSH11/++402/+03/04/0JSH21+/102++/++03/++04++/++0JSH41/602+/03/04+/0JSH51/702/03/+04/0接上表培养基量40ml1+/+402/03/+04/050ml1/502/03/04/0培养基DE1+/++002++/++1/03++/++0/14++/++1/0MS1/502+/+03/04+/0碳源蔗糖1/202+/03/+04+/0乳糖1/602/+03/04/0淀粉1/+602/03/04/0甘露醇1/+502/03/+04/0无糖不过滤1/702/+03/0无糖过滤1/502+/03/0接上表光照中1/602/03/04/0强1/502/03+/04/0弱1/802/03/04/0说明：现阶段主要是进行单因素实验，以便探明各因素对金线莲与真菌共生的影响。此次实验死亡率太高，可能是由于菌种变异引起的。1.5正式实验2方法：将苗去掉上端，茎分成上茎与下茎两部分，接到不同培养基中，每瓶4个茎节，（大部分是两个上茎两个下茎）观察几个单因素对原球茎产生的影响，每个水平3瓶。除了考虑各因素外，其余条件都是：DE,30ml,中光,同时接菌，葡萄糖。表1.5因素水平平均原球茎数平均出芽率平均出叶芽率平均芽高菌种JSH10.7542.6666666670.733333JSH40.753.66672.3333333330.6JSH50.83333.33332.6666666670.433333培养基量及培养基40ml0.666731.3333333330.66666750ml0.41672.51.50.560ml0.58332.33331.3333333330.5666671/2PDA0.16672.666720.533333接种时间60.52.66670.6666666670.730.58332.333310.866667+30.666743.51.4+60.37532.51.1碳源蔗糖0.75310.566667葡萄糖1.253.66672.6666666670.766667乳糖0.22222.51.50.75甘露醇0.75331.5可溶性淀粉0.5210.833333光强强光1.16673.66672.3333333330.933333弱光0.666720.6666666670.666667苗品种0201（云南）0.08332.666720.4666670401（台湾）0.752.666721.20701(杂交种）0.833343.3333333330.633333Duncan法比较不同因素对金线莲生长状态影响因素平均数差异显著性0.01菌种2.5833A苗品种1.7194B接种时间1.6161B碳源1.5611B光强1.5125B培养基量及培养基1.2979B结论：不同菌种对金线莲生长及共生体系的建立的影响具有统计学意义，对比其它5种因素差异显著。但还需要继续观察，以得出更科学合理的结论。附：金线莲组培苗与真菌的共生图片左图为金线莲形成类原球茎，右图为对照左图为类原球茎分化出芽，右图为类原球茎再增值左图为类原球茎分化为苗2、不同基质上金线莲与真菌的共生2.1移栽苗目的：比较在不同基质中金线莲与JSH1、JSH4、JSH5丝核菌的共生情况。方法：先将已生根的组培苗种植在两种基质上，10天后拔出，挑选生长良好的苗称鲜重后重新种回去，每盆两株，编号。同时把染有丝核菌的板栗叶按照3~8g每盆（板栗叶有些湿润有些干燥）放在培养基里，接触到苗的根部，丝核菌已生长5天并产生了菌核，并设两种对照。说明：对照CK1表示不接菌不放板栗叶子CK2表示不接菌但放同样重量的板栗叶子。基质1：泥炭：沙子：蛭石=4：1：2；基质2:泥炭：椰松=3:2。“++”表示粗壮非常好；“+”表示生长良好或稍瘦弱；“”表示苗已经变黄，或上半节枯萎下面生长；“”表示完全死亡表2.1还没接菌组培苗种植在两种基质上10天后的存活率接菌前10天后基质株数存活半活死亡存活率备注140322680%总的状态比基质1好240341585%表2.2下表不同基质不同菌种金线莲生长共生情况基质菌编号接种当天2个月后生长状况生长状况总原球茎数总死亡率1JSH1A+/++++/++133.33%B+/+++/C+/+/JSH4A+/+/+4B+/+++/++C+/++/+JSH5A+/+/+3B+/+++/C+/+++/++CK1A+/+/0B+/+++/+C+/++/CK2A+/++/0B++/+/C+/+/++2JSH1A+/+++/++418.75%B+/+++/+C+/+++/++JSH4A+/+++/4B+/++/C+/++++/++JSH5A+/++/+2B+/++++/C+/+++/++CK1A+/+/++0B+/+/+C+/+++/++CK2A+/+++/++0B+/+++/+C+/+++/++结果：基质1的存活率为66.67%，萌芽率为16.71%；基质2的存活率为81.25%；从苗的生长情况看，基质2生长要好许多，从萌芽率来说，基质1要高一些。附：移栽苗图片左图为长有类原球茎的共生苗移栽，右图为对照上图为组培苗移栽到含有真菌的基质中二、菌根真菌组织学观察材料：制作徒手切片，采用第二批实验的共生苗，分1节、2茎间、3原球茎下部、4原球茎上部四个部位，用美兰、番红染色。左图为番红染色下的菌丝结，右图为对照左图为美兰染色下的菌丝，右图为对照结果：近节、节和原球茎里均有菌丝或菌丝团，有部分菌丝团溶解，这与文献共生情况符合，其他部位及对照没有。结论：丝核菌可能是从节或切口外皮层细胞进入皮层细胞，进而与金线莲形成共生。菌丝团溶解为植物提供营养，进而促进苗生长成健壮的植株。三、菌根真菌重分离与鉴定3.1丝核菌的分离材料：上述移栽苗金线莲方法：冲净泥土，用灭菌刀切取一小段含类原球茎金丝莲茎节，把茎节在0.1%升汞浸泡30s~60s，95%酒精浸泡3~5s，无菌水冲洗3次后，切取茎节部分约5mm，放置在含100U/mL硫酸链霉素的PDA平板上，在28℃培养箱中培养。待菌丝生长后，菌落直径约3cm时，再从菌丝前沿切取5mm置于新的PDA平板中央培养。3.2丝核菌培养性状的观察方法：将待测菌株在上述PDA培养基培养2d后，用打孔器在培养皿菌落边缘处切取长宽各为4mm的菌丝块，移入PDA平板中央，28℃下培养，3个重复，每隔24h观察1次菌落的生长情况，记录菌落直径、颜色及产菌核时间，菌核颜色变化情况。表3.菌种时间菌落直径直径平均值菌落颜色产菌核时间JSH11天后3.9977785.298乳白色8天后2天后6.598889JSH41天后3.7266675.012乳白色8天后2天后6.297778JSH51天后3.8922225.249乳白色8天后2天后6.606667Duncan法菌种平均数差异显著性0.05JSH45.298AJSH15.249AJSH55.012A3.3丝核菌菌丝的观察及其直径的测量方法：丝核菌在PDA平板上，28℃条件下，培养两天后镜检观察分枝角度、是否有隔膜，并测量菌丝直径：用镊子或解剖针挑一小块菌丝，放在载玻片上，滴上乳酸石碳酸，在显微镜下测量菌丝直径，每菌株随机测量3处。表3.菌种时间菌丝直径直径平均值隔膜分枝角度JSH11天后2.0444442.144444有直角2天后2.244444JSH41天后2.1777782.505556有直角2天后2.833333JSH51天后2.0555562.105556有直角2天后2.155556Duncan法菌种平均数差异显著性0.05JSH42.5056AJSH12.1444AJSH52.