免疫荧光原位杂交技术FISH

FISHhays什么是FISH?荧光原位杂交（Fluorescence

in

situ

Hybridization，FISH）基本原理：应用荧光染料标记探针

DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交，在荧光显微镜下观察并记录结果。概述FISH

探针种类CSP着丝粒探针GLP特异性位点探针FISH操作简单快速出结果标本来源丰富灵敏度特异性高准确率高FISH诊断的优势FISH在石腊切片标本中的应用FISH在产前诊断的应用FISH结果分析及注意事项二甲苯脱蜡梯度乙醇复水沸水煮30min37ºC蛋白酶k5-30min变性杂交2XSSC漂洗2次石蜡切片标本处理基本步骤：2XSSC漂洗2次梯度脱水洗片阅片DAPI染色脱蜡石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水各2分钟浸入去离子水3分钟(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)预处理100

ºC沸水处理组织切片30分钟100ug/mL的蛋白酶K溶液,37

ºC孵育5-30分钟2*SSC漂洗,梯度脱水各2分钟,干燥玻片.变性杂交洗涤DAPI复染50%甲酰胺2XSSC0.1%NP-4075%乙醇探针变性玻片变性83

ºC5min42ºC

湿盒孵育过夜羊水处理的步骤玻片制备悬液滴片及预处理变性杂交加探针变性杂交过荧光显微镜下观察计数结果统计羊水标本玻片的制备离心胰酶消化低渗（0.075M

KCL）预固定、固定滴片（控制好悬液浓度、量、高度）胰蛋白酶（Trypsin）消化操作中要控制好酶的工作浓度,适量加大酶有助于加强消化作用,但盲目加大酶量超过酶饱和度不一定起到加强消化的作用。实验中应控制好酶的工作浓度,不同批次、不同储存时间及温度影响酶消化强度及饱和度。低渗处理和固定细胞置于KCL低渗溶液中吸收水分可使细胞胀破，使探针更容易与核内DNA杂交结合，便于结果分析。固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形成核蛋白交联定型。提高细胞核与载玻片的亲和力，使探针DNA易于进入细胞。预处理37

ºC

PBS

5min37

ºC

0.005%胃酶15min1xPBS

3min1%多聚甲醛10min1xPBS

3min

2次梯度脱水胃蛋白酶处理胃蛋白酶处理可以取出细胞浆中的蛋白质，减少探针在载玻片上与核酸和蛋白质的非特异结合，提高杂交效率。变性杂交变性使DNA变性保持单链结构杂交

湿润密闭环境结果分析洗涤DAPI复染镜下观察计数FISH结果分析及注意事项FISH成像分析系统荧光显微镜的使用自己眼睛的保护。汞灯/氙灯的使用和保养。标本荧光信号的保护。AF细胞观察计数及结果分析100X油镜下选择探针杂交充分，不重叠的细胞计数50个阳性：异常细胞比率占60%以上阴性：正常细胞比率占90%以上无法判断：没达到以上标准，可扩大计数范围HER-2细胞观察计数及结果分析100X油镜下浸润区随机计数30个细胞，计算红绿信号的比值（Ratio）阳性（扩增）：

I:Ratio>2.2

II：成簇扩增阴性：Ratio<1.8无法判断：Ratio在1.8-2.2之间，分析更多细胞或重复实验HER-2基因扩增模式肺癌细胞观察计数及结果分析100X油镜下癌区随机计数100个细胞，计算红绿信号的比值（Ratio）扩增：I:

Ratio>2II:15copy>或=10%III:成簇扩增IV：Ratio<2但4copy>或=40%阴性：除以上扩增的情况EGFR基因扩增检测试剂盒（FISH）镜下观察可能现的问题无荧光信号出没有用酶进行处理,用了不恰当的滤光镜没有加入探针(或探针没有经过适当变性),杂交条件不够恰当探针不合格(或探针没有适当保存),荧光显微镜没有适当地起作用荧光信号微弱杂交条件不够充分探针过分稀释造成浓度太低,没有适当变性,探针和杂交液没有充分混合,洗涤条件不够恰当(或洗涤太过),滤光镜不对有背景荧光杂交后洗涤不够充分洗涤缓冲液盐的浓度过高洗涤时温度过低荧光信号计数问题选择分散较好不重叠的细胞计数IGH/CHER-2HER-2扩增C-MYCCBFB基因断裂重组检测试剂盒探针：GLP

CBFBCBFB基因（Core

binding

factor

β，CBFB）：核心结合因子,位于16号染色体上。CBFB也是早期造血所必需的转录因子，通过与AML1的Runt同源结构域结合，由AM