DB36-T1654-2022-饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程-江西省

ICS65.020.20DB36CCSB35江西省地方标准DB36/T1654—2022饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程Technicalregulationsofbreedingofchrysanthemumvirus-freeseedseedlings江西省市场监督管理局发布DB36/T1654—2022目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14基本要求..........................................................................25网室建造与隔离....................................................................26原原种繁殖........................................................................27原原种鉴定........................................................................38原种网室繁殖......................................................................39质量检测..........................................................................4附录A（规范性）RNA病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法......................5IDB36/T1654—2022前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及本专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本文件主要起草人：汤泳萍、叶艳英、胡文亭、张冰冰、周劲松、尹玉玲、程正新、谢启鑫、罗绍春。IIDB36/T1654—2022饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程1范围本文件规定了饮用菊花（Chrysanthemummorifolium(Ramat.)TzveL.）脱毒原种苗的范围、规范性引用文件、术语和定义、基本要求、网室建造与隔离、原原种繁殖、原原种鉴定、原种网室繁殖、质量检测等要求。本文件适用于饮用菊花脱毒原种苗的生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则GB/T51057种植塑料大棚工程技术规范GB/T51183农业温室结构荷载规范NY/T391绿色食品产地环境质量NY/T1224农用塑料薄膜安全使用控制技术规范NY/T1591菊花切花种苗等级规格NY/T1657花卉脱毒种苗生产技术规程香石竹、菊花、兰花、补血草、满天星3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1饮用菊花DrinkableChrysanthemum用于泡饮的多年生草本植物菊的头状花序。3.2脱毒种苗（virus-freeseedlings）经RT-PCR检测方法鉴定，确认脱除了菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、黄瓜花叶病毒（CMV）等的脱毒核心材料（或脱毒苗）在隔离条件下生产的原原种、原种。1DB36/T1654—2022育种家选育的性状稳定纯正的用于繁殖原种的材料或种苗。3.4原种（foundationseed）由原原种繁殖的用于繁育生产用种的材料或种苗。4基本要求4.1产地环境产地环境符合NY/T391的规定。4.2场地要求选择排灌方便，地下水位较低，土层深厚、肥沃、疏松，3年内未种过茄科作物、5年内未种过菊科植物的中性或微酸性土壤地块，且周围800m范围内无其它菊科和茄科植物种植。4.3化学农药使用应符合GB/T8321（所有部分）的要求。4.4肥料要求应符合NY/T496和NY/T525的要求。5网室建造与隔离大棚所有通风处安装60目防虫网。大棚搭建应符合GB/T51057和GB/T51183要求，大棚覆盖薄膜应符合NY/T1224要求。大棚入口处宜配套缓冲间，田间操作人员进入防虫大棚温室、网室应更换工作衣和鞋具。6原原种繁殖选具有繁育品种典型性状、生长健壮的植株，至光照培养箱中采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为26℃/20℃下培养2d，每2d昼/夜温度分别升高2℃、直至38℃/30℃下培养40d，取高温培养长出的茎段，剪去叶片，留取心叶或腋芽，放在烧杯中，用肥皂水冲洗干净，再用自来水冲洗1h。滤干，移入无菌操作台，用20%的次氯酸钠灭菌8min～10min，取出后用无菌水冲洗3～5次待用。将制备好的MS+6-BA0.1mg/L培养基溶液分装于培养瓶，每瓶30ml，瓶口盖紧瓶盖。在121℃，1.1MPa条件下灭菌20min，冷却后放入无菌操作台待用。在无菌条件下，在解剖镜下剥取已灭菌材料的生长点0.3mm～0.5mm，接种到已灭菌的培养基上，置于26℃，光强2000lx～3000lx，光照时间16h/d条件下培养，一周左右茎尖转绿并萌动，20d～30d形2DB36/T1654—2022在无菌条件下将已分化的带芽茎段剪成小段，每段带1～2个腋芽，转入培养基（MS+6-BA0.1mg/L）中进行增殖，3～4周后获30～40个带腋芽芽段。6.3病毒检测取继代培养壮芽或叶片提取RNA，经RT-PCR检测方法鉴定，没有病毒宜继续培养，脱毒不彻底应弃之不用。具体操作见附录A。6.4生根培养、炼苗及移栽管理6.4.1生根培养将继代培养的茎段转入生根培养基（MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L）诱导生根，培养温度25℃～26℃，3～4周后95%均生根。6.4.2炼苗瓶苗株高6cm～7cm，5～6片平展叶，生根5条以上3cm～4cm长的根时即可炼苗，幼苗炼苗1d～2d后，定植在营养钵或苗床，于具60目防虫网的防虫网室或防虫温室内进行培育。6.4.3移栽管理原原种采用9cm×9cm营养钵或苗床移栽，珍珠岩+蛭石+泥炭按体积比1︰1︰1的比例混合做基质，移栽前用广谱保护性杀菌剂喷洒消毒。移栽后浇透定根水，以后保持基质70%的持水量，空气湿度保持在80%～90%。太阳光强时要注意采用遮阳网遮荫。当植株发新叶后，逐步恢复自然光照，并进行叶面施肥。气温不足时采取小拱棚膜和大棚相结合的双膜覆盖方式。白天保持25℃～26℃，夜间18℃～20℃。成活后白天保持25℃～27℃，夜间16℃～18℃，注意控水降温，防止幼苗徒长。移栽前一周注意揭膜通风炼苗。7原原种鉴定随机抽取每批次脱毒苗5～10株，以其母株为对照种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母株无差异者则可确认为原原种，有差异则淘汰。8原种繁育田要求育苗环境除应符合NY/T391的规定外，要选择排灌方便、地下水位较低，地势高燥，土层深厚、肥沃、疏松，阳光充足，通风条件好，3年内未种过茄科植物、5年内未种过菊科植物的中性或微酸性土壤地块，且周围800m范围内无其它菊科和茄科植物种植。育苗地于冬前深耕晒垡，每667平方米施入完全腐熟的农家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除杂草，畦面做到平、细、碎。育苗畦高25cm～30cm，畦面宽100cm，畦间距40cm。苗床四周开宽50cm的深沟，便于排水。3DB36/T1654—20228.2.2苗床消毒苗床先利用太阳光暴晒消毒，均匀喷洒广谱杀菌剂和灭线剂至畦面上预防杂菌和根结线虫病，再每平方米用茶枯饼0.03kg杀灭地下害虫。在整平的畦面上均匀铺上5cm～10cm厚的河沙。8.3剪顶扦插原种母株定植行株距应为45cm×45cm，从炼苗移栽成活的原原种上取健壮枝条扦插于苗床上，于网室中扩繁。当原种母株长到7～8片叶时，从基部留3～4片叶处剪下顶芽进行扦插。8.4田间管理在原种基地扩繁种苗应周年进行，当温度低于0℃时，应搭小拱棚，盖上薄膜保温。当母株苗越冬后，要及时掀开薄膜，中耕除草，松土保墒。苗高7cm～8cm时，要开沟施1次复合肥。施用肥料应符合NY/T496和NY/T525规定。具体田间管理参照NY/T1657操作，经过一年生产和集中繁育，繁育出健壮原种苗。9质量检测脱毒原种苗质量检测参照NY/T1591中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T1591中5.2的内容进行检测，确定种苗的质量等级。A4DB36/T1654—2022BA附录A（规范性）RNA病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法A.1主要仪器设备与试剂、耗材表A.1各步骤主要仪器设备与试剂、耗材主要试剂盒与试剂步骤/类别主要仪器设备主要耗材（试剂均使用分析纯试剂）无RNA酶的离心管（1.5mL，2mL）、移液器配套枪头、配套枪头盒、研钵、研棒、PE手套、乳胶手套RNA提取试剂盒：TaKaRaMiniBESTPlant高压灭菌锅、电子天平、高速冷冻离心机、微量移液器、微量核酸测定仪RNAExtractionKitRNA提取试剂：无水乙醇、液氮第一链cDNA合成水浴锅、制冰机、PCR扩增仪反转录试剂盒：PrimeScript™II1stStrand无RNA酶PCR管器PCR扩增仪器、制冰机PremixTaq™(TaKaRaTaq™Version2.0plus微量移液器、微量离心机dye)、引物、矿物油和枪头、乳胶手套三角瓶、量筒、制胶板、梳子、乳胶手套RNA提取按照试剂盒（TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit）Protocol-II的说明书进行。用1.0%的琼脂糖凝胶对总RNA提取结果进行电泳检测，利用微量核酸测定仪检测RNA浓度，测量A260与A280值。按照反转录试剂盒（PrimeScript™II1stStrandcDNASynthesisKit）说明书进行。5DB36/T1654—2022A.2.3.1PCR反应体系总体积10μL，其中0.4μL上游引物（10mM），0.4μL下游引物（10mM），5μLPremixTaq(TaKaRaTaq™Version2.0plusdye)（0.05U/μl），1μLcDNA模板（20ng/μL），3.2μLddH2O。A.2.3.2PCR反应程序按照以下程序进行：1）94℃预变性4min；2）94℃变性45s；3）按表A.2推荐的引物退火温度，退火45s；4）72℃延伸45s；5）重复步骤2）～4），共35个循环；6）72℃延伸7min；7）4℃保存