DB34T 4878-2024包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测 胶体金免疫层析法

34RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater—Colloidalgoldimmunochromatographicass.I本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。1包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法GB/T6682分析实验室用水规格和GB8538食品安全国家标准饮用天然矿泉样品中的铜绿假单胞菌经滤膜过滤富集，超声处理提取DNA，以此为模板，设计经异硫（FITC）和生物素（biotin）修饰的上下游引物，通过聚合酶链式反应（PCR）得到扩增导致T线颜色加深，通过T线与控制线（C线）颜色比较，铜绿假单胞菌标准菌株：CMCC（B）10282或等效25.9TE缓冲溶液：量取1mLTris-HCl溶液(5.7)于100mL容量瓶中，再加入0.2mLEDTA(5.8)溶液，加水(5.1)定容至100mL。4℃保存，有效期一年。5.12上样缓冲液：主要成分为Tris-HC1溶液、柠檬酸钠缓冲液、吐温20、聚乙二醇20000。5.13营养肉汤：主要成分为蛋白胨、牛肉粉、氯化钠、葡萄糖。5.14铜绿假单胞菌菌悬液：用接种环挑取平皿上培养20h~24h的铜绿假单胞菌标准菌株(5.2)典型菌落，接种到营养肉汤(5.13)中，37℃±1℃培养18h~20h,至活菌数达到1×108CFU/mL~5×108CFU/mL时，即制得铜绿假单胞菌菌悬液。5’-FITC-ACCGCCGTCAGAA6.1PCR仪。6.6电子天平：感量分别为0.01g和0.001g。6.9离心机：离心转速≥5000rpm。6.10pH计。6.12胶体金读卡仪(可选)。7检测将250mL待检水样通过孔径0.45μm的无菌滤膜(6.7)过滤，滤膜备用。以无菌水作为空白对照，以铜绿假单胞菌菌悬液(5.14)作为阳性质控对照。将7.1得到的滤膜置于无菌瓶底部，加入1mL的TE缓冲溶液(5.9)重悬，超声后将瓶中溶液转移到1.5mL离心管中，5000rpm室温离心5min,取上清液备用。7.3PCR扩增取7.2得到的上清液2μL,加入PCR预混液(5.10)12.5μL,10μmol/L上下游引物(5.15)各0.8μL,ddH₂O(5.11)8.9μL61℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环；72℃再延伸2min,得到扩增产物，备用。3取7.3得到的扩增产物2μL,滴加在胶体金免疫层析检测试纸条(6.11)上，再滴加48μL上样缓冲液(5.12)于样品垫上，静置3min,观察T线和C线显色情况，进行结果判定。控制线(C线)不显色，或空白试验检测线(T线)显色，或阳性质控试验检测线(T线)不显色，均判定无效。示意图见图1。控制线(C线)显色，检测线(T线)不显色。控制线(C线)与检测线(T线)均显色。LT线L阴性阳性无效空白无效质控无效图1目视判定示意图检出限为1CFU/250mL。45N12N21N22N2.=N21+N22N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异(х2）2=（|N12-N21