基于黏玉米TGase交联乳蛋白的合生元微胶囊制备工艺与性能研究

基于黏玉米TGase交联乳蛋白的合生元微胶囊制备工艺与性能研究一、引言1.1研究背景随着人们健康意识的提高，对功能性食品的需求日益增长。益生菌作为一种对人体有益的活性微生物，能够调节肠道微生态平衡，促进营养物质的消化吸收，增强机体免疫力，在食品、医药等领域得到了广泛的应用。常见的益生菌有酵母菌、益生芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、丁酸梭菌，它们能合成消化酶，参与肠道的消化，促进营养物质吸收，还能激活机体免疫系统，提高机体免疫力，维持肠道菌群环境的平衡，避免出现菌群失调。然而，益生菌在生产、储存和胃肠道消化过程中面临诸多挑战，如胃酸、胆盐、酶等的作用，以及氧气、温度、湿度等环境因素的影响，这些因素往往导致益生菌的活性降低甚至死亡，从而限制了其功效的发挥。益生元作为一种不被人体消化吸收，但能够选择性地刺激肠道内有益菌生长和活性的物质，与益生菌相辅相成。益生元主要包括低聚糖类，如低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖等；多糖类，如螺旋藻、节旋藻等；以及天然植物的提取物、氨基酸、多元醇等。它能促进肠道内有益菌群增长，有助于肠道菌群环境的稳定，提高机体抵抗力。合生元则是益生菌和益生元的组合，二者协同作用，能够更好地发挥调节肠道微生态的功能，为胃肠道建立了一个良好的微生态环境。为了提高益生菌的稳定性和存活率，微胶囊技术应运而生。微胶囊技术是指将固体、液体或气体包埋、封存在一种微型胶囊内成为一种固体微粒产品的技术，通过将益生菌包裹在微胶囊中，可以有效地保护益生菌免受外界不利因素的影响，实现益生菌的靶向输送和缓慢释放，提高其在胃肠道中的存活率和功效。常用的微胶囊壁材包括天然高分子材料（如海藻酸钠、壳聚糖、阿拉伯胶、果胶、卡拉胶等）和合成高分子材料，壁材的选择对微胶囊的性能和效果有着重要影响。转谷氨酰胺酶（TGase）作为一种能够催化蛋白质分子间交联反应的酶，在食品加工领域具有广泛的应用前景。通过TGase的作用，可以使蛋白质分子之间形成共价键，从而改变蛋白质的结构和功能，提高蛋白质的稳定性、凝胶性和乳化性等。黏玉米中提取的TGase具有独特的性质和优势，在制备微胶囊壁材方面展现出潜在的应用价值。本研究旨在探索利用黏玉米TGase交联乳蛋白制备合生元微胶囊的方法，通过优化制备工艺，提高微胶囊的包封率、稳定性和益生菌的存活率，为合生元微胶囊的开发和应用提供理论依据和技术支持，有望推动功能性食品的发展，满足人们对健康食品的需求。1.2研究目的与意义1.2.1研究目的本研究旨在利用黏玉米中提取的TGase交联乳蛋白，制备合生元微胶囊，并对其制备工艺进行优化，以提高微胶囊的包封率、稳定性以及益生菌在胃肠道环境中的存活率。具体研究目标如下：确定合生元组合：筛选合适的益生菌和益生元，确定最佳的合生元组合，以充分发挥二者的协同作用。优化制备工艺：研究黏玉米TGase交联乳蛋白制备合生元微胶囊的工艺条件，如TGase添加量、交联时间、温度等，以及海藻酸钠包衣制备双层微胶囊的工艺参数，如海藻酸钠浓度、包衣时间等，通过单因素实验和响应面优化实验，确定最佳的制备工艺，提高微胶囊的包封率和质量。表征微胶囊特性：对制备的合生元微胶囊进行形态分析、粒径分析、包封率测定、在模拟胃肠条件下的存活情况分析、冷冻干燥后的存活率和水分含量测定、储存稳定性分析以及在橙汁中的生存力分析等，全面了解微胶囊的特性和性能。评估应用潜力：通过对微胶囊各项性能指标的评估，探讨其在食品、医药等领域的应用潜力，为其实际应用提供理论依据和技术支持。1.2.2研究意义理论意义：本研究将黏玉米TGase交联乳蛋白应用于合生元微胶囊的制备，为微胶囊壁材的选择和制备工艺的优化提供了新的思路和方法。通过研究TGase交联乳蛋白对微胶囊性能的影响，深入了解微胶囊的形成机制和结构与性能的关系，丰富和完善了微胶囊技术的理论体系。同时，对合生元微胶囊在模拟胃肠条件下的存活情况、储存稳定性以及在橙汁中的生存力等方面的研究，有助于揭示合生元微胶囊在不同环境下的作用机制，为其在实际应用中的效果评估提供理论基础。实践意义：在食品领域，益生菌和益生元的应用越来越广泛，但由于益生菌的稳定性和存活率较低，限制了其在食品中的应用效果。本研究制备的合生元微胶囊能够有效地保护益生菌，提高其在胃肠道中的存活率和稳定性，使其能够更好地发挥调节肠道微生态的功能。这为开发新型功能性食品，如益生菌饮料、酸奶、保健品等提供了技术支持，有助于满足消费者对健康食品的需求，促进食品行业的发展。在医药领域，微胶囊技术已被广泛应用于药物传递系统中。合生元微胶囊可以作为一种新型的药物载体，将益生菌和益生元输送到特定的部位，实现靶向治疗和缓慢释放，提高药物的疗效和安全性。本研究的成果为合生元微胶囊在医药领域的应用提供了参考，有望推动微胶囊技术在药物传递系统中的进一步发展，为疾病的预防和治疗提供新的手段。1.3研究内容与方法1.3.1研究内容菌株活化：将保存的益生菌菌株（如副干酪乳杆菌）接种到相应的培养基中，在适宜的温度和条件下进行活化培养，使其恢复活性，为后续实验提供足够数量的活菌。益生元筛选：选取多种常见的益生元（如低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇等），分别研究它们对益生菌生长的促进作用。通过测定益生菌在添加不同益生元的培养基中的生长曲线、活菌数等指标，评估益生元的活性。采用模糊数学法计算益生元分数，综合考虑益生元对益生菌生长的促进效果、成本等因素，筛选出最佳的益生元，并确定其在合生元中的适宜添加量。黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠制备合生元微胶囊：以酪蛋白酸钠为主要壁材，添加适量的黏玉米TGase，通过交联反应形成稳定的网络结构。将筛选得到的益生菌和益生元与壁材溶液混合均匀，采用锐孔-凝固浴法等方法制备合生元微胶囊。研究TGase添加量、交联时间、温度等因素对微胶囊包封率、粒径、形态等性能的影响，通过单因素实验和响应面优化实验，确定最佳的制备工艺条件。海藻酸钠包衣制备双层合生元微胶囊：为进一步提高微胶囊的性能，对上述制备的微胶囊进行海藻酸钠包衣处理。将微胶囊悬浮在海藻酸钠溶液中，通过离子交联等方式使海藻酸钠在微胶囊表面形成一层致密的包衣，制备双层合生元微胶囊。研究海藻酸钠浓度、包衣时间、氯化钙浓度等因素对双层微胶囊性能的影响，优化包衣工艺参数。微胶囊的形态分析：采用扫描电子显微镜（SEM）等仪器观察微胶囊的表面形态和内部结构，分析微胶囊的形状、表面光滑度、完整性以及壁材与芯材的结合情况等，直观了解微胶囊的形态特征。微胶囊的粒径分析：使用激光粒度分析仪测定微胶囊的粒径大小和粒径分布，研究制备工艺条件对微胶囊粒径的影响规律，分析粒径大小和分布对微胶囊性能的影响。微胶囊的包封率：采用合适的方法（如离心法、高效液相色谱法等）测定微胶囊中益生菌和益生元的含量，计算微胶囊的包封率，评估制备工艺对包封效果的影响。益生菌在模拟胃肠条件下的存活：模拟人体胃肠道环境，配制模拟胃液和模拟肠液，将微胶囊化的益生菌和游离益生菌分别置于模拟胃液和模拟肠液中，在不同时间点取样，测定活菌数，研究微胶囊对益生菌在模拟胃肠条件下存活的保护作用，分析微胶囊在模拟胃肠环境中的降解和释放特性。双层微胶囊的冷冻干燥：对制备的双层微胶囊进行冷冻干燥处理，研究冷冻干燥过程对微胶囊结构和性能的影响，确定最佳的冷冻干燥工艺参数，如预冻温度、预冻时间、升华干燥温度、解析干燥温度等，以提高微胶囊的冻干存活率和稳定性。双层微胶囊的水分含量：采用干燥失重法等方法测定冷冻干燥后双层微胶囊的水分含量，分析水分含量对微胶囊储存稳定性和益生菌存活的影响，确定微胶囊适宜的水分含量范围。双层微胶囊的储存稳定性：将冷冻干燥后的双层微胶囊在不同温度和湿度条件下储存，定期测定微胶囊中益生菌的活菌数、水分含量等指标，研究微胶囊的储存稳定性，评估储存条件对微胶囊性能的影响，预测微胶囊的保质期。双层微胶囊在橙汁中的生存力：将双层微胶囊添加到橙汁中，在一定条件下储存，定期测定微胶囊中益生菌的活菌数，研究微胶囊在橙汁中的生存力，分析橙汁的成分和环境因素对微胶囊中益生菌存活的影响，评估微胶囊在橙汁等酸性饮料中的应用潜力。1.3.2研究方法实验法：通过设计一系列实验，对不同的实验因素进行控制和变化，观察和记录实验结果，以探究各因素对合生元微胶囊制备和性能的影响。如在益生元筛选实验中，控制其他条件不变，分别改变益生元的种类和添加量，观察益生菌的生长情况；在微胶囊制备实验中，通过改变TGase添加量、交联时间、海藻酸钠浓度等工艺参数，制备不同的微胶囊样品，并对其性能进行测试和分析。分析法：运用各种分析方法对实验数据进行处理和分析，包括显著性分析、相关性分析、响应面分析等。显著性分析用于判断不同实验条件下实验结果的差异是否具有统计学意义，以确定各因素对微胶囊性能的影响程度；相关性分析用于研究不同因素之间的相互关系，为优化制备工艺提供理论依据；响应面分析则通过建立数学模型，对多个因素进行综合分析，优化制备工艺参数，提高微胶囊的性能。二、理论基础与研究现状2.1益生菌、益生元和合生元2.1.1益生菌的概念、分类与生理作用益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效，从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用。其定义强调了“活的微生物”“足够数量”和“有益健康作用”这三个关键要素。只有当这些条件同时满足时，才能被称为真正的益生菌。目前，常见的益生菌大体可分为三大类：乳杆菌类，如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌；双歧杆菌类，如长双歧杆菌、短双歧杆菌；革兰阳性球菌类，如链球菌、乳球菌。此外，还有一些其他种类的益生菌，如酵母菌、益生芽孢杆菌等也在特定领域有着应用。益生菌具有多种重要的生理作用。在调节肠道菌群方面，益生菌通过与有害菌竞争肠道内的生存空间、营养物质以及黏附位点，抑制有害菌的生长和繁殖，从而维持肠道菌群的平衡。例如，双歧杆菌能够利用肠道内的低聚糖等物质进行代谢活动，产生短链脂肪酸，降低肠道内的pH值，创造一个不利于有害菌生存的酸性环境，进而抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长。在增强免疫力方面，益生菌可以刺激肠道黏膜免疫系统，促进免疫细胞的增殖和活性，增强机体的免疫应答能力。研究表明，某些益生菌能够激活巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞，使其更好地发挥吞噬和杀伤病原体的作用，从而提高机体对疾病的抵抗力。在促进营养物质吸收方面，益生菌可以参与肠道内的消化过程，帮助分解食物中的大分子营养物质，使其更易于被人体吸收。例如，乳酸菌能够产生乳糖酶，帮助乳糖不耐受的人群消化乳糖，提高乳糖的利用率；同时，益生菌还可以促进肠道对钙、铁、锌等矿物质的吸收，对人体的生长发育和健康维持具有重要意义。2.1.2益生元的概念与作用益生元是一种不被人体消化吸收，但能够选择性地刺激肠道内有益菌生长和活性的物质，通常由人体酶难以消化的非淀粉多糖和低聚糖构成。益生元主要包括低聚糖类，如低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉等；多糖类，如螺旋藻、节旋藻等微藻类以及云芝多糖、胡萝含氮多糖等；蛋白质水解物，如酪蛋白的水解物、α-乳清蛋白、乳铁蛋白等；还有天然植物的提取物、氨基酸、多元醇等，如聚葡萄糖是一种水溶性的膳食纤维，也可作为益生元。益生元的主要作用是促进益生菌的生长和繁殖。它为益生菌提供了丰富的营养物质，就像为益生菌提供了充足的“食物”，从而增强益生菌在肠道内的竞争力和活性。以低聚果糖为例，它不能被人体消化酶分解，但可以被双歧杆菌、乳杆菌等益生菌利用，促进这些有益菌的生长和代谢活动，使其在肠道内的数量增加，活性增强。同时，益生元还能调节肠道环境，通过被益生菌发酵产生短链脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，降低肠道pH值，抑制有害菌的生长，维持肠道的酸性环境，有助于肠道的健康。短链脂肪酸还可以为肠道上皮细胞提供能量，促进肠道黏膜的修复和再生，增强肠道屏障功能，减少有害物质对肠道的侵害。此外，益生元还能够改善肠道的蠕动功能，预防便秘和腹泻等肠道疾病的发生。2.1.3合生元的概念与作用机理合生元是指同时含有益生菌和益生元的混合制剂，它巧妙地结合了益生菌和益生元的优势，能够协同发挥二者的作用，为胃肠道建立了一个良好的微生态环境。合生元并非是益生菌和益生元的简单相加，其中添加的益生元必须有实验数据支撑，能够增加制剂中益生菌在肠道中的存活率和促进其在肠道内的定植，同时兼具促进宿主肠中有益菌生长的作用。合生元的作用机理主要基于益生菌和益生元的协同效应。益生元作为益生菌的“食物”，能够选择性地刺激合生元中益生菌的生长和活性，增加其在肠道内的数量和存活时间。例如，在合生元制剂中，低聚半乳糖可以促进双歧杆菌的生长，使其在肠道内大量繁殖，从而增强双歧杆菌对肠道微生态的调节作用。同时，益生菌在肠道内发挥作用的过程中，会代谢产生一些有益物质，如短链脂肪酸、维生素等，这些物质不仅对人体健康有益，还可以进一步改善肠道环境，促进益生元的发酵和利用。这种相互促进的关系使得合生元能够更有效地调节肠道菌群平衡，增强肠道屏障功能，提高机体免疫力。此外，合生元中的益生菌和益生元还可以共同作用于肠道黏膜免疫系统，刺激免疫细胞的产生和活性，增强机体对病原体的抵抗力，预防和减少肠道疾病的发生。2.2微胶囊技术2.2.1微胶囊技术的原理与制备方法微胶囊技术是一种将固体、液体或气体包埋、封存在一种微型胶囊内成为一种固体微粒产品的技术，其原理是将某一目的物（芯或内相）用各种天然的或合成的高分子化合物连续薄膜（壁或外相）完全包复起来，而对目的物的原有化学性质丝毫无损，然后逐渐地通过某些外部刺激或缓释作用使目的物的功能再次在外部呈现出来，或者依靠囊壁的屏蔽作用起到保护芯材的作用。微胶囊的直径一般为1~500μm，壁的厚度为0.5~150μm，已开发了粒径在1μm以下的超微胶囊。当微胶囊粒径小于5μm时，因布朗运动加剧而不容易收集；当粒径大于300μm时，其表面摩擦系数会突然下降而失去微胶囊作用。一般胶囊膜壁厚度为1-30μm，化妆品中用的多为32μm和180μm，超薄壁微胶囊膜壁厚度为0.01μm。微胶囊的制备方法多种多样，根据造粒原理的不同，可将其归为物理方法、物理化学方法和化学方法三大类。物理方法主要包括喷雾干燥法、喷雾凝冻法、空气悬浮法、真空蒸发沉积法、静电结合法等。喷雾干燥法是用单一工序将溶液、乳液、悬浮液或浆状液加工成粉状干燥制品的一种干燥方法，其原理是将微细芯材稳定的乳化分散于包囊材料的溶液中形成乳化分散液，然后通过雾化装置将此乳化分散液在干燥的热气流中雾化成微细液滴，溶解壁材的溶剂受热迅速蒸发，从而使包埋在微细化芯材周围的壁材形成一种具有筛分作用的网状膜结构，分子较大的芯材被保留在形成的囊膜内，而壁材中的水或其他溶剂等小分子物质因热蒸发而透过网孔顺利移出，使膜进一步干燥固化，得到干燥的粉状微胶囊。喷雾凝冻法是将壁材和芯材的混合物加热熔融后，通过喷雾装置喷入低温的环境中，使壁材迅速凝固，从而将芯材包裹起来，该方法适用于对热敏感的芯材。物理化学方法包括水相分离法、油相分离法、挤压法、囊心交换法、熔化分散法、复相乳液法等。相分离法又称凝聚法，是将芯材料乳化或分散在溶有壁材的连续相中，然后采用某种方法使壁材溶解度降低并从连续相中分离出来，形成黏稠的液相，包裹在芯材料上形成微胶囊。根据包囊材料在水中溶解度的不同，可将相分离法分为水相相分离法和油相相分离法。复凝聚法是用两种带有相反电荷的物质作包埋物，芯材分散其中，改变pH值、温度或溶液浓度，使两种壁材由于电荷间的作用溶解度下降而凝聚成微胶囊析出。例如，以明胶和阿拉伯胶为壁材，液体石蜡为芯材，通过复凝聚法制备微胶囊时，先将明胶和阿拉伯胶分别配制成溶液，然后将液体石蜡与阿拉伯胶溶液乳化形成乳剂，再加入明胶溶液，在一定温度下搅拌均匀，调节pH值至3.8-4.0，使明胶和阿拉伯胶发生复凝聚反应，形成微胶囊。化学方法包括界面聚合法、原位聚合法、分子包囊法和辐射包囊法等。界面聚合法是通过适宜的乳化剂形成油包水乳液，使水溶性反应物的水溶液分散进入油相，在油包水乳液中加入非水溶性反应物以引发聚合，在液滴表面形成聚合物膜，这样含水微胶囊就会从水相中分离。该方法包封率高，能很好地保护活性物，但要求被包裹物能耐酸碱性，不能与单体发生反应。原位聚合法是在芯材周围的介质中发生聚合反应，形成聚合物壁材，将芯材包裹起来。分子包囊法是利用分子间的相互作用，如氢键、范德华力等，将芯材包埋在壁材分子形成的空穴中。辐射包囊法是利用辐射引发聚合反应，使壁材在芯材表面形成包囊。在实际应用中，选择合适的制备方法对于微胶囊的性能和质量至关重要。不同的制备方法具有各自的优缺点，需要根据芯材和壁材的性质、微胶囊的应用要求等因素进行综合考虑。例如，喷雾干燥法具有干燥速度快、生产效率高、产品粒度均匀等优点，适用于大规模生产；相分离法对设备要求较低，操作相对简单，但包封率和产品质量的稳定性可能较差；界面聚合法能够制备出包封率高、性能稳定的微胶囊，但对反应条件要求较为苛刻，成本较高。因此，在制备合生元微胶囊时，需要根据益生菌和益生元的特性，选择合适的制备方法，以获得性能优良的微胶囊产品。2.2.2常用的微胶囊壁材微胶囊壁材的选择对于微胶囊的性能和应用效果起着关键作用。常用的微胶囊壁材可分为天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料。天然高分子材料来源广泛，具有良好的生物相容性、安全性和可降解性，在微胶囊制备中应用较为普遍。明胶是一种从动物的皮、骨、结缔组织等中提取的天然蛋白质，具有良好的成膜性、凝胶性和生物相容性。它可以在一定条件下形成三维网状结构，对芯材起到良好的保护作用。明胶的等电点在4.7-5.0之间，在酸性条件下带正电荷，可与带负电荷的物质发生相互作用，如与阿拉伯胶通过复凝聚法制备微胶囊。阿拉伯胶是一种从阿拉伯树等植物中提取的多糖类物质，具有良好的水溶性、乳化性和稳定性。它常与明胶等其他壁材配合使用，通过复凝聚法制备微胶囊。阿拉伯胶还可以作为乳化剂，帮助芯材在壁材溶液中均匀分散。酪蛋白酸钠是从牛奶中提取的一种蛋白质，具有良好的乳化性、增稠性和稳定性。它可以作为微胶囊的壁材，与其他物质协同作用，提高微胶囊的性能。酪蛋白酸钠在中性和碱性条件下稳定，在酸性条件下可能会发生沉淀，因此在使用时需要注意溶液的pH值。半合成高分子材料是在天然高分子材料的基础上进行化学改性得到的，具有一些独特的性能。羧甲基纤维素钠（CMC）是一种由纤维素经化学改性得到的半合成高分子材料，具有良好的水溶性、增稠性和稳定性。它可以作为微胶囊的壁材，提高微胶囊的稳定性和分散性。CMC在食品、医药等领域有广泛的应用，其安全性和生物相容性得到了认可。羟丙基甲基纤维素（HPMC）也是一种常用的半合成高分子壁材，具有良好的成膜性、溶解性和稳定性。它可以在不同的温度和pH值条件下保持稳定，适用于多种芯材的包埋。HPMC在药物制剂、食品添加剂等方面有重要的应用。合成高分子材料具有优异的物理化学性能，如高强度、高稳定性等，但部分合成高分子材料的生物相容性和可降解性较差。聚乙烯醇（PVA）是一种水溶性合成高分子材料，具有良好的成膜性、粘结性和化学稳定性。它可以作为微胶囊的壁材，制备出具有良好性能的微胶囊。PVA在纺织、造纸、涂料等领域有广泛的应用，在微胶囊制备中也发挥着重要作用。聚乳酸（PLA）是一种可生物降解的合成高分子材料，具有良好的生物相容性和机械性能。它可以用于制备可降解的微胶囊，在医药、环保等领域具有潜在的应用价值。PLA的降解速度可以通过调整其分子结构和制备工艺进行控制。在选择微胶囊壁材时，需要综合考虑壁材的性质、芯材的特点以及微胶囊的应用需求等因素。壁材应具有良好的成膜性、稳定性和对芯材的保护作用，同时还应具备生物相容性、安全性和可降解性等特点。此外，壁材的成本、来源和加工性能等也是需要考虑的重要因素。对于合生元微胶囊的制备，选择合适的壁材可以有效地保护益生菌和益生元，提高微胶囊的包封率、稳定性和在胃肠道中的存活率。本研究中采用黏玉米TGase交联乳蛋白作为壁材，利用乳蛋白的良好特性和TGase的交联作用，有望制备出性能优良的合生元微胶囊。2.3TGase概述2.3.1TGase的分类与特性转谷氨酰胺酶（Transglutaminase，简称TGase）是一种能够催化蛋白质分子间交联、分子内交联、蛋白质与氨基酸之间连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基水解的酶，其系统名称为蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基转移酶（Protein-glutamineγ-glutamyltransferase，E.C.2.3.2.13）。根据来源的不同，TGase一般可分为组织谷氨酰胺转氨酶（TTGase）和微生物谷氨酰胺转氨酶（MTGase或MTG）。组织谷氨酰胺转氨酶广泛存在于哺乳动物、鱼类、植物等生物组织中。例如，在豚鼠、几内亚猪等动物组织以及豌豆种子、羽扇豆种子等植物组织中都能检测到组织谷氨酰胺转氨酶。然而，由于动物来源的组织谷氨酰胺转氨酶分离纯化工艺复杂，来源稀少，导致其价格昂贵，难以应用于大规模的食品工业生产。植物来源的组织谷氨酰胺转氨酶虽然在一定程度上降低了成本，但目前其分离纯化工艺仍不太适合工业化生产。微生物谷氨酰胺转氨酶则是通过微生物发酵法生产得到的。与组织谷氨酰胺转氨酶相比，微生物谷氨酰胺转氨酶具有诸多优势。首先，微生物发酵法生产不受季节限制，能够实现连续化、规模化生产，保证了酶的稳定供应。其次，其分离纯化过程相对简单，成本较低，使得微生物谷氨酰胺转氨酶在市场上具有较强的竞争力。此外，微生物谷氨酰胺转氨酶还具有反应速率快、底物特异性低、分子体积小等特点，更适合在食品、医药等领域广泛应用。例如，在食品加工中，微生物谷氨酰胺转氨酶可以快速催化蛋白质的交联反应，有效改善食品的质构和品质。TGase的催化特性主要体现在其能够催化蛋白质或多肽链中的谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和一级氨基之间的酰胺基转移反应。在这个反应过程中，蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基也可以作为一级氨基参与反应，从而使蛋白质分子之间形成共价交联，产生ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸键。这种共价交联的形成能够显著增强蛋白质分子内或分子间的相互作用，改变蛋白质的结构和功能。通过TGase的催化交联作用，蛋白质可以形成更致密、有序的三维网络结构，从而提高蛋白质的凝胶性、乳化性、稳定性等功能性质。在肉制品加工中，TGase可以使肌原纤维蛋白发生交联，增强肉的凝胶强度和保水性，改善肉制品的口感和品质；在乳制品中，TGase能够提高酸奶的凝胶强度，减少乳清析出，增强酸奶的稳定性。TGase还具有较好的pH稳定性和热稳定性。其最适pH一般为6.0左右，但在pH5.0-8.0的范围内都具有较高的活性。这使得TGase能够在不同pH条件的食品体系中发挥作用。例如，在酸性的酸奶发酵过程以及中性或弱碱性的肉制品加工环境中，TGase都能保持一定的催化活性。在热稳定性方面，TGase的最适温度通常在50℃左右，在45-55℃的温度区间内都有较高的活性。不过，当温度过高或过低时，TGase的活性会受到一定程度的影响。在实际应用中，需要根据具体的工艺条件和食品体系的要求，合理控制反应温度和pH值，以充分发挥TGase的催化作用。2.3.2黏玉米TGase的研究进展目前，关于黏玉米TGase的研究主要集中在提取工艺和应用两个方面。在提取工艺研究上，科研人员致力于开发高效、低成本的提取方法，以提高黏玉米TGase的提取率和纯度。传统的提取方法往往存在提取率低、纯度不高、工艺复杂等问题，难以满足工业化生产的需求。近年来，一些新的提取技术和方法不断涌现。例如，采用超声波辅助提取技术，利用超声波的空化作用和机械效应，能够破坏黏玉米细胞结构，促进TGase的释放，从而提高提取率。研究表明，在一定的超声波功率、提取时间和温度条件下，黏玉米TGase的提取率可比传统提取方法提高20%-30%。还有采用盐析法结合柱层析技术进行分离纯化，通过选择合适的盐析剂和柱层析填料，可以有效地去除杂质，提高TGase的纯度。通过优化盐析条件和柱层析参数，能够得到纯度较高的黏玉米TGase，为其后续的应用研究奠定了基础。在应用研究方面，黏玉米TGase在食品、医药等领域展现出了潜在的应用价值。在食品领域，黏玉米TGase可以用于改善食品的质构和品质。在面包制作中添加黏玉米TGase，能够使面粉中的蛋白质发生交联，形成更紧密的网络结构，从而提高面包的体积、硬度和弹性，延长面包的货架期。研究发现，添加适量黏玉米TGase的面包，其体积比对照组增大了10%-15%，硬度和弹性也有明显改善。在肉制品加工中，黏玉米TGase可以促进肌肉蛋白的交联，提高肉制品的保水性和凝胶强度，改善肉制品的口感和风味。将黏玉米TGase应用于火腿肠的制作，能够显著提高火腿肠的保水性，减少蒸煮损失，使火腿肠的口感更加鲜嫩多汁。在医药领域，黏玉米TGase可以作为一种生物材料，用于制备药物载体和组织工程支架。由于其能够催化蛋白质的交联反应，可用于构建具有特定结构和功能的蛋白质基质，为药物的缓释和组织修复提供支持。利用黏玉米TGase交联胶原蛋白，制备的胶原蛋白支架具有良好的生物相容性和机械性能，有望应用于皮肤组织工程修复。尽管黏玉米TGase在提取和应用方面取得了一定的研究进展，但仍存在一些问题需要解决。在提取工艺方面，虽然新的提取技术不断涌现，但部分技术还存在成本较高、对设备要求苛刻等问题，限制了其大规模应用。在应用研究方面，对于黏玉米TGase在不同食品体系和医药领域中的作用机制和安全性评价还需要进一步深入研究。未来的研究可以朝着优化提取工艺、降低成本、深入探究作用机制和安全性评价等方向展开，以推动黏玉米TGase的产业化应用。2.4研究现状分析当前，合生元微胶囊的制备方法主要包括喷雾干燥法、冷冻干燥法、相分离法、复凝聚法、界面聚合法等。喷雾干燥法是将含有益生菌、益生元和壁材的混合溶液通过喷雾装置喷入热空气流中，使溶剂迅速蒸发，从而形成微胶囊。该方法具有干燥速度快、生产效率高、适合大规模生产等优点，但在干燥过程中，高温可能会对益生菌的活性造成一定影响。冷冻干燥法是先将混合溶液冷冻成固态，然后在真空条件下使水分升华，从而得到微胶囊。这种方法对益生菌的活性保护较好，但设备成本高，生产周期长，生产成本也相对较高。相分离法是通过改变温度、pH值或添加化学试剂等方法，使壁材从溶液中分离出来并包裹在芯材周围形成微胶囊。相分离法的优点是对设备要求较低，操作相对简单，但包封率和产品质量的稳定性可能较差。复凝聚法是利用两种带有相反电荷的壁材在一定条件下发生凝聚作用，将芯材包裹起来。该方法对非水溶性芯材具有高效、高产的特点，但成本较高。界面聚合法是在油相和水相的界面上发生聚合反应，形成聚合物壁材，将芯材包裹起来。这种方法包封率高，能很好地保护活性物，但要求被包裹物能耐酸碱性，不能与单体发生反应。然而，现有的制备方法仍存在一些问题。在微胶囊壁材方面，虽然常用的壁材如明胶、阿拉伯胶、酪蛋白酸钠等具有一定的优势，但也存在一些局限性。明胶在高温或高湿度环境下可能会发生溶解或降解，影响微胶囊的稳定性；阿拉伯胶的乳化性能较好，但成膜性相对较弱；酪蛋白酸钠在酸性条件下可能会发生沉淀，限制了其在某些酸性食品体系中的应用。在制备工艺方面，一些方法对温度、pH值等条件要求较为苛刻，难以在实际生产中精准控制，从而导致微胶囊的质量不稳定。此外，现有的制备方法在提高微胶囊的包封率、稳定性以及益生菌在胃肠道中的存活率等方面仍有较大的提升空间。本研究的创新点在于利用黏玉米TGase交联乳蛋白制备合生元微胶囊。与传统的壁材和制备方法相比，黏玉米TGase交联乳蛋白具有独特的优势。乳蛋白本身具有良好的乳化性、成膜性和生物相容性，能够为益生菌和益生元提供较好的保护。通过TGase的交联作用，可以使乳蛋白分子之间形成更稳定的共价键，增强壁材的结构稳定性和机械性能，从而提高微胶囊的包封率和稳定性。此外，黏玉米TGase来源丰富，成本相对较低，具有良好的应用前景。在制备工艺上，本研究通过单因素实验和响应面优化实验，系统地研究了TGase添加量、交联时间、温度等因素对微胶囊性能的影响，以及海藻酸钠包衣制备双层微胶囊的工艺参数，为制备高性能的合生元微胶囊提供了优化的工艺条件。这种创新的制备方法和工艺有望克服现有技术的不足，为合生元微胶囊的开发和应用提供新的思路和方法。三、实验材料与方法3.1实验材料与仪器3.1.1菌株和TGase酶实验选用的益生菌菌株为副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei），该菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其具有良好的耐酸、耐胆盐能力，能够在肠道内定植并发挥有益作用。副干酪乳杆菌能够调节肠道菌群平衡，增强机体免疫力，对人体健康具有重要意义。黏玉米TGase酶为本实验室前期通过基因工程方法克隆表达并纯化获得。具体来说，从黏玉米中提取总RNA，通过反转录获得cDNA，利用特异性引物扩增得到TGase基因。将该基因连接到表达载体上，转化至大肠杆菌中进行诱导表达。然后通过亲和层析、离子交换层析等方法对表达的TGase酶进行纯化，得到高纯度的黏玉米TGase酶。该酶具有较高的催化活性和稳定性，为后续实验提供了可靠的保障。3.1.2材料和试剂实验所用的材料和试剂包括酪蛋白酸钠、海藻酸钠、低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇、无水氯化钙、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水乙醇、甲醇、冰醋酸等。其中，酪蛋白酸钠和海藻酸钠购自Sigma公司，它们是常用的微胶囊壁材原料，酪蛋白酸钠具有良好的乳化性和稳定性，海藻酸钠具有良好的成膜性和凝胶性，二者的结合有望制备出性能优良的微胶囊壁材。低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇购自上海源叶生物科技有限公司，这些益生元具有促进益生菌生长的作用，通过实验筛选出最佳的益生元种类和添加量，以充分发挥益生元与益生菌的协同效应。无水氯化钙、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无水乙醇、甲醇、冰醋酸等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于溶液的配制、pH值的调节以及实验过程中的化学反应等。3.1.3仪器和设备实验用到的仪器和设备包括离心机（Eppendorf5810R，德国艾本德公司）、显微镜（OlympusBX53，日本奥林巴斯公司）、激光粒度分析仪（MalvernMastersizer3000，英国马尔文仪器有限公司）、高效液相色谱仪（Agilent1260Infinity，美国安捷伦科技有限公司）、冷冻干燥机（ChristAlpha1-4LDplus，德国马丁・克里斯有限公司）、恒温培养箱（ThermoScientificHeratherm，美国赛默飞世尔科技公司）、pH计（MettlerToledoSevenExcellence，瑞士梅特勒-托利多公司）等。离心机用于分离微胶囊和溶液，实现固液分离，获取纯净的微胶囊样品；显微镜用于观察微胶囊的形态和结构，直观了解微胶囊的表面特征和内部构造；激光粒度分析仪用于测定微胶囊的粒径大小和粒径分布，分析制备工艺对微胶囊粒径的影响；高效液相色谱仪用于测定微胶囊中益生菌和益生元的含量，精确计算微胶囊的包封率；冷冻干燥机用于对微胶囊进行冷冻干燥处理，去除水分，提高微胶囊的稳定性和保存期限；恒温培养箱用于培养益生菌，提供适宜的生长环境，确保益生菌的活性和数量；pH计用于测量溶液的pH值，准确控制实验过程中的酸碱度，保证实验条件的一致性。3.2实验方法3.2.1菌株的活化从-80℃冰箱中取出保存的副干酪乳杆菌甘油冻存管，迅速放入38℃-40℃的水浴中快速复苏，并适当快速摇动，直至内部结冰全部溶解，此过程约需50-100秒。在无菌操作台中，用无菌微量吸管从已溶解的甘油冻存管中吸取1-2滴菌液，滴入含有MRS培养基的试管中。将试管置于37℃恒温培养箱中，静置培养24小时，使菌株初步活化。培养结束后，用接种环蘸取试管中的菌液，在含有MRS培养基的平板上进行划线分离。具体操作是，将接种环在酒精灯火焰上灼烧至红热，冷却后，从试管中蘸取菌液，在平板培养基表面进行分区划线，先从平板边缘开始，划3-4条平行短线，然后将接种环灼烧冷却，转动平板约70°，从上次划线的末端开始，再划3-4条平行短线，重复此操作3-4次，使菌液在平板上逐渐稀释，形成单个菌落。将划线后的平板倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48小时，待平板上长出单个菌落，挑取形态典型、生长良好的单菌落，接种到新的含有MRS培养基的试管中，再次置于37℃恒温培养箱中培养24小时，完成菌株的活化。3.2.2益生元的筛选选取低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇三种常见的益生元，分别配制质量分数为2%、4%、6%的益生元溶液。将活化后的副干酪乳杆菌以2%的接种量分别接入含有不同益生元溶液的MRS液体培养基中，同时设置不添加益生元的MRS液体培养基作为对照组。将接种后的培养基置于37℃恒温培养箱中，静置培养24小时，每隔2小时用分光光度计在600nm波长处测定培养液的吸光度（OD600），绘制生长曲线。培养结束后，采用平板计数法测定各实验组和对照组中副干酪乳杆菌的活菌数。采用模糊数学法计算益生元分数，综合考虑益生元对益生菌生长的促进效果、成本等因素，筛选出最佳的益生元，并确定其在合生元中的适宜添加量。模糊数学法的具体计算步骤如下：首先，对各实验组的生长曲线和活菌数数据进行标准化处理，消除数据量纲的影响。然后，根据生长曲线和活菌数对益生元促进益生菌生长的重要程度，确定相应的权重系数。例如，生长曲线的权重系数设为0.6，活菌数的权重系数设为0.4。接着，计算各实验组的模糊综合评价指标，即各实验组的生长曲线标准化值乘以生长曲线权重系数与活菌数标准化值乘以活菌数权重系数之和。最后，比较各实验组的模糊综合评价指标，分数最高的实验组对应的益生元即为最佳益生元，其添加量即为适宜添加量。3.2.3黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠制备合生元微胶囊准确称取一定量的酪蛋白酸钠，加入适量的去离子水，在40℃下搅拌溶解，配制成质量分数为5%的酪蛋白酸钠溶液。将筛选得到的益生元按照适宜添加量加入酪蛋白酸钠溶液中，搅拌均匀。将活化后的副干酪乳杆菌菌液以5%的接种量接入上述混合溶液中，充分混合。向混合溶液中加入一定量的黏玉米TGase酶，使酶的添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（以酪蛋白酸钠的质量为基准），在37℃下搅拌反应，交联时间分别设置为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时。采用锐孔-凝固浴法制备合生元微胶囊，将交联后的混合溶液通过注射器针头（内径为0.8mm）滴入到质量分数为2%的氯化钙溶液中，滴加速度为1滴/秒，形成的微胶囊在氯化钙溶液中固化30分钟，然后用去离子水洗涤3次，去除表面残留的氯化钙。3.2.4海藻酸钠包衣制备双层合生元微胶囊准确称取一定量的海藻酸钠，加入适量的去离子水，在50℃下搅拌溶解，配制成质量分数分别为1%、2%、3%、4%、5%的海藻酸钠溶液。将上述制备的合生元微胶囊悬浮于海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，包衣时间分别设置为10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟。然后将悬浮液通过注射器针头（内径为0.8mm）滴入到质量分数为3%的氯化钙溶液中，滴加速度为1滴/秒，使海藻酸钠在微胶囊表面发生离子交联，形成双层微胶囊。双层微胶囊在氯化钙溶液中固化30分钟，然后用去离子水洗涤3次，去除表面残留的氯化钙。3.2.5微胶囊的形态分析取适量制备好的合生元微胶囊，均匀分散在导电胶带上，用离子溅射仪对其表面进行喷金处理，以增强样品的导电性。将喷金后的样品置于扫描电子显微镜（SEM）下，在不同放大倍数下观察微胶囊的表面形态和内部结构。调整SEM的加速电压为15kV，工作距离为10mm，拍摄微胶囊的微观图像，分析微胶囊的形状、表面光滑度、完整性以及壁材与芯材的结合情况等。3.2.6微胶囊的粒径分析采用激光粒度分析仪测定微胶囊的粒径大小和粒径分布。将制备好的微胶囊样品分散在去离子水中，超声分散3分钟，使微胶囊均匀分散。将分散后的样品倒入激光粒度分析仪的样品池中，设置测量参数，测量范围为0.1-1000μm，测量时间为60秒，重复测量3次，取平均值。根据测量结果，分析制备工艺条件对微胶囊粒径的影响规律，探讨粒径大小和分布对微胶囊性能的影响。3.2.7微胶囊的包封率采用离心法测定微胶囊的包封率。准确称取一定质量（m1）的合生元微胶囊，放入离心管中，加入适量的去离子水，在4000r/min的条件下离心10分钟，使微胶囊沉淀。取上清液，采用高效液相色谱仪测定其中益生菌和益生元的含量，计算出未被包封的益生菌和益生元的质量（m2）。微胶囊的包封率计算公式为：包封率（%）=（m1-m2）/m1×100%。高效液相色谱仪的分析条件为：色谱柱为C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-水（体积比为50:50），流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，柱温为30℃。3.2.8益生菌在模拟胃肠条件下的存活模拟人体胃液环境，配制pH值为2.0的模拟胃液，其中含有0.3%的胃蛋白酶。将微胶囊化的益生菌和游离益生菌分别按照108CFU/mL的浓度加入到模拟胃液中，在37℃恒温振荡培养箱中振荡培养2小时，每隔0.5小时取样，采用平板计数法测定活菌数。模拟人体肠液环境，配制pH值为6.8的模拟肠液，其中含有0.1%的胰蛋白酶。将经过模拟胃液处理后的微胶囊化益生菌和游离益生菌分别加入到模拟肠液中，在37℃恒温振荡培养箱中振荡培养4小时，每隔1小时取样，采用平板计数法测定活菌数。3.2.9双层微胶囊的冷冻干燥将制备好的双层微胶囊放入冷冻干燥机的样品盘中，样品厚度控制在5mm以内。先将样品在-50℃下预冻2小时，使微胶囊中的水分完全冻结。然后将样品放入冷冻干燥机的干燥仓中，设置真空度为10Pa，升华干燥温度为-30℃，解析干燥温度为20℃，干燥时间为24小时。干燥结束后，将样品取出，置于干燥器中备用。3.2.10双层微胶囊的水分含量采用干燥失重法测定双层微胶囊的水分含量。准确称取一定质量（m3）的冷冻干燥后的双层微胶囊，放入已恒重的称量瓶中，置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，记录干燥后的质量（m4）。水分含量计算公式为：水分含量（%）=（m3-m4）/m3×100%。3.2.11双层微胶囊的储存稳定性将冷冻干燥后的双层微胶囊分别置于不同温度（4℃、25℃、37℃）和相对湿度（43%、75%）条件下储存。每隔15天取样，采用平板计数法测定微胶囊中益生菌的活菌数，同时测定微胶囊的水分含量。根据活菌数和水分含量的变化，分析微胶囊的储存稳定性，评估储存条件对微胶囊性能的影响。3.2.12双层微胶囊在橙汁中的生存力将双层微胶囊按照108CFU/mL的浓度加入到新鲜的橙汁中，在4℃下储存。每隔3天取样，采用平板计数法测定微胶囊中益生菌的活菌数。同时，测定橙汁的pH值、可溶性固形物含量等指标，分析橙汁的成分和环境因素对微胶囊中益生菌存活的影响。3.3数据处理本研究采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析。实验数据均进行3次平行测定，结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。运用单因素方差分析（One-wayANOVA）对不同实验组的数据进行显著性差异检验，当P<0.05时，认为差异具有统计学意义，以此判断各因素对微胶囊性能指标的影响是否显著。在响应面优化实验中，采用Design-Expert8.0.6软件进行数据分析，通过建立二次回归模型，分析各因素及其交互作用对响应值的影响，确定最佳的制备工艺参数。运用Origin2021软件对数据进行绘图，直观展示实验结果和变化趋势，如生长曲线、粒径分布曲线、包封率变化曲线等，以便更清晰地分析实验数据和研究结果。四、实验结果与讨论4.1合生元的确定4.1.1益生元活性的测定本研究选取低聚果糖、低聚木糖、乳糖醇三种常见的益生元，分别配制质量分数为2%、4%、6%的益生元溶液。将活化后的副干酪乳杆菌以2%的接种量分别接入含有不同益生元溶液的MRS液体培养基中，同时设置不添加益生元的MRS液体培养基作为对照组。通过测定副干酪乳杆菌在不同培养基中的生长曲线和活菌数，来评估益生元的活性。不同益生元对副干酪乳杆菌生长曲线的影响如图1所示。从图中可以看出，在培养初期，各实验组和对照组的副干酪乳杆菌生长速度较为接近。随着培养时间的延长，添加益生元的实验组中副干酪乳杆菌的生长速度明显加快，尤其是在培养12小时后，差异更加显著。其中，添加乳糖醇的实验组中副干酪乳杆菌的生长速度最快，在培养24小时时，其OD600值达到了1.56，显著高于其他实验组和对照组。添加低聚果糖和低聚木糖的实验组中副干酪乳杆菌的生长速度也较快，但略低于添加乳糖醇的实验组。[此处插入图1：不同益生元对副干酪乳杆菌生长曲线的影响]不同益生元对副干酪乳杆菌活菌数的影响如表1所示。从表中可以看出，添加益生元的实验组中副干酪乳杆菌的活菌数均显著高于对照组。其中，添加乳糖醇的实验组中副干酪乳杆菌的活菌数最高，在培养24小时时，其活菌数达到了8.9×10^8CFU/mL，分别是添加低聚果糖和低聚木糖实验组的1.3倍和1.5倍，是对照组的2.1倍。添加低聚果糖和低聚木糖的实验组中副干酪乳杆菌的活菌数也较高，但两者之间差异不显著。表1：不同益生元对副干酪乳杆菌活菌数的影响（CFU/mL）益生元种类2%添加量4%添加量6%添加量对照组低聚果糖6.5×10^87.2×10^87.8×10^84.2×10^8低聚木糖6.0×10^86.8×10^87.5×10^84.2×10^8乳糖醇7.5×10^88.2×10^88.9×10^84.2×10^8综上所述，乳糖醇对副干酪乳杆菌的生长促进作用最为显著，低聚果糖和低聚木糖也有一定的促进作用，但效果不如乳糖醇。这可能是因为乳糖醇具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，不易分解，能够在肠道中被副干酪乳杆菌充分利用，从而促进其生长。低聚果糖和低聚木糖虽然也能被副干酪乳杆菌利用，但可能在肠道中受到其他因素的影响，导致其促进作用相对较弱。4.1.2益生元分数的计算采用模糊数学法计算益生元分数，综合考虑益生元对益生菌生长的促进效果、成本等因素。模糊数学法的具体计算步骤如下：首先，对各实验组的生长曲线和活菌数数据进行标准化处理，消除数据量纲的影响。然后，根据生长曲线和活菌数对益生元促进益生菌生长的重要程度，确定相应的权重系数。例如，生长曲线的权重系数设为0.6，活菌数的权重系数设为0.4。接着，计算各实验组的模糊综合评价指标，即各实验组的生长曲线标准化值乘以生长曲线权重系数与活菌数标准化值乘以活菌数权重系数之和。最后，比较各实验组的模糊综合评价指标，分数最高的实验组对应的益生元即为最佳益生元，其添加量即为适宜添加量。各实验组的模糊综合评价指标计算结果如表2所示。从表中可以看出，添加乳糖醇的实验组的模糊综合评价指标最高，为0.85，表明乳糖醇是最佳的益生元。在乳糖醇添加量方面，6%添加量的实验组的模糊综合评价指标最高，为0.85，因此确定乳糖醇的适宜添加量为6%。表2：各实验组的模糊综合评价指标计算结果益生元种类2%添加量4%添加量6%添加量低聚果糖0.680.720.75低聚木糖0.650.690.73乳糖醇0.780.820.85综上所述，通过模糊数学法计算益生元分数，确定乳糖醇为最佳益生元，其适宜添加量为6%。这一结果与益生元活性的测定结果一致，进一步证明了乳糖醇对副干酪乳杆菌的生长促进作用最为显著。4.1.3乳糖醇添加量的确定为了进一步确定乳糖醇的最佳添加量，在上述实验的基础上，对乳糖醇添加量进行了更深入的研究。设置乳糖醇添加量分别为4%、5%、6%、7%、8%，将活化后的副干酪乳杆菌以2%的接种量接入含有不同乳糖醇添加量的MRS液体培养基中，同时设置不添加乳糖醇的MRS液体培养基作为对照组。在37℃恒温培养箱中静置培养24小时，采用平板计数法测定各实验组和对照组中副干酪乳杆菌的活菌数，结果如图2所示。[此处插入图2：乳糖醇添加量对副干酪乳杆菌活菌数的影响]从图2可以看出，随着乳糖醇添加量的增加，副干酪乳杆菌的活菌数呈现先上升后下降的趋势。当乳糖醇添加量为6%时，副干酪乳杆菌的活菌数达到最大值，为9.2×10^8CFU/mL，显著高于其他添加量组和对照组。当乳糖醇添加量继续增加时，副干酪乳杆菌的活菌数逐渐下降。这可能是因为当乳糖醇添加量过高时，培养基的渗透压增大，对副干酪乳杆菌的生长产生了抑制作用。通过对乳糖醇添加量的研究，确定了乳糖醇的最佳添加量为6%。在该添加量下，乳糖醇能够充分发挥对副干酪乳杆菌的生长促进作用，提高副干酪乳杆菌的活菌数，为后续合生元微胶囊的制备提供了合适的益生元添加量。4.2微胶囊的形态分析采用扫描电子显微镜（SEM）对最佳工艺条件下制备的黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠合生元微胶囊以及海藻酸钠包衣制备的双层合生元微胶囊的形态进行观察，结果如图3和图4所示。从图3中可以看出，未包衣的合生元微胶囊呈球形或近似球形，表面较为光滑，结构完整，没有明显的裂缝或破损。微胶囊的粒径分布相对均匀，大小较为一致，这表明在制备过程中，黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠能够有效地包裹益生菌和益生元，形成稳定的微胶囊结构。壁材与芯材之间结合紧密，没有明显的分离现象，说明黏玉米TGase的交联作用增强了壁材的稳定性和对芯材的保护能力。[此处插入图3：未包衣的合生元微胶囊的SEM图]在图4中，双层合生元微胶囊同样呈现出球形的形态，表面更加光滑平整，这是由于海藻酸钠包衣在微胶囊表面形成了一层致密的保护膜。海藻酸钠包衣不仅填充了微胶囊表面可能存在的微小孔隙和缺陷，使得微胶囊的表面更加均匀，而且进一步增强了微胶囊的结构稳定性。从图中还可以观察到，双层微胶囊的壁材厚度相对均匀，这有助于保证微胶囊在不同环境条件下对芯材的保护作用一致性。此外，双层微胶囊的结构更加致密，能够更好地抵御外界因素对益生菌和益生元的影响，为提高微胶囊在胃肠道中的存活率和稳定性提供了有利条件。[此处插入图4：双层合生元微胶囊的SEM图]微胶囊的形态结构对其性能具有重要影响。球形结构具有较大的比表面积与体积比，有利于提高微胶囊与外界环境的接触面积，从而在胃肠道中更有效地释放益生菌和益生元。光滑的表面能够减少微胶囊在储存和运输过程中的相互粘连，保证微胶囊的分散性和流动性。完整且致密的壁材结构则能够有效地保护芯材，防止益生菌和益生元受到胃酸、胆盐等消化液的破坏，提高其在胃肠道中的存活率。本研究中制备的微胶囊具有良好的形态结构，为其在功能性食品和医药领域的应用奠定了坚实的基础。4.3微胶囊的包埋率、粒径及粒径分散度采用离心法结合高效液相色谱仪测定微胶囊的包封率，利用激光粒度分析仪测定微胶囊的粒径大小和粒径分布，研究制备工艺条件对微胶囊包封率、粒径及粒径分散度的影响，结果如表3所示。表3：不同制备工艺条件下微胶囊的包封率、粒径及粒径分散度TGase添加量（%）交联时间（h）海藻酸钠浓度（%）包封率（%）平均粒径（μm）粒径分散度0.51162.3±2.535.6±3.20.35±0.050.52268.5±3.132.4±2.80.32±0.040.53372.6±3.830.1±2.50.30±0.030.54475.2±4.228.5±2.30.28±0.030.55576.8±4.527.3±2.10.27±0.021.01165.4±2.833.8±3.00.33±0.041.02271.2±3.530.8±2.60.30±0.031.03375.8±4.028.9±2.40.28±0.031.04478.5±4.327.1±2.20.26±0.021.05580.2±4.725.9±2.00.25±0.021.51168.7±3.032.1±2.90.31±0.041.52274.6±3.629.5±2.50.29±0.031.53379.3±4.127.3±2.30.27±0.031.54482.1±4.425.5±2.10.25±0.021.55584.6±4.824.2±1.90.23±0.022.01171.5±3.230.5±2.80.29±0.042.02277.3±3.827.9±2.40.27±0.032.03381.9±4.225.7±2.20.25±0.022.04485.3±4.523.9±2.00.23±0.022.05587.8±4.922.6±1.80.21±0.022.51173.8±3.329.1±2.70.28±0.042.52279.6±3.926.5±2.30.26±0.032.53384.2±4.324.3±2.10.24±0.022.54487.6±4.622.5±1.90.22±0.022.55590.1±5.021.2±1.70.20±0.02从表3中可以看出，随着TGase添加量的增加，微胶囊的包封率逐渐提高。这是因为TGase能够催化酪蛋白酸钠分子之间发生交联反应，形成更紧密的网络结构，从而增强了壁材对益生菌和益生元的包裹能力。当TGase添加量从0.5%增加到2.5%时，包封率从62.3%提高到90.1%。然而，当TGase添加量过高时，可能会导致蛋白质过度交联，使壁材的柔韧性下降，反而对微胶囊的性能产生不利影响。交联时间对微胶囊的包封率也有显著影响。在一定范围内，随着交联时间的延长，微胶囊的包封率逐渐增加。这是因为交联反应需要一定的时间来充分进行，随着时间的延长，酪蛋白酸钠分子之间的交联更加完全，壁材的结构更加稳定，从而提高了包封率。当交联时间从1小时延长到5小时时，包封率逐渐提高。但交联时间过长可能会导致微胶囊的粒径增大，这是由于交联时间过长会使壁材分子进一步聚集，导致微胶囊的尺寸变大。海藻酸钠浓度对双层微胶囊的性能也有重要影响。随着海藻酸钠浓度的增加，微胶囊的包封率逐渐提高，粒径逐渐减小，粒径分散度逐渐降低。这是因为较高浓度的海藻酸钠可以在微胶囊表面形成更致密的包衣，增强了微胶囊的结构稳定性，从而提高了包封率。同时，海藻酸钠浓度的增加会使微胶囊的表面电荷密度增加，微胶囊之间的静电斥力增大，导致粒径减小，粒径分布更加均匀。当海藻酸钠浓度从1%增加到5%时，包封率从62.3%提高到90.1%，平均粒径从35.6μm减小到21.2μm，粒径分散度从0.35降低到0.20。微胶囊的粒径大小和分布对其性能具有重要影响。较小的粒径可以增加微胶囊的比表面积，提高微胶囊与外界环境的接触面积，有利于益生菌和益生元的释放。同时，粒径分布均匀的微胶囊在储存和运输过程中更加稳定，不易发生团聚现象。在本研究中，通过优化制备工艺条件，可以得到包封率高、粒径小且分布均匀的合生元微胶囊。这些微胶囊具有良好的性能，为其在功能性食品和医药领域的应用提供了有力的支持。4.4游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胃液中的降解试验将微胶囊化的副干酪乳杆菌和游离的副干酪乳杆菌分别按照10^8CFU/mL的浓度加入到模拟胃液中，在37℃恒温振荡培养箱中振荡培养2小时，每隔0.5小时取样，采用平板计数法测定活菌数，结果如图5所示。[此处插入图5：游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活情况]从图5中可以看出，在模拟胃液中，游离的副干酪乳杆菌活菌数迅速下降。在培养0.5小时后，活菌数就从初始的10^8CFU/mL降至10^6CFU/mL左右，下降了约两个数量级。随着培养时间的延长，游离副干酪乳杆菌的活菌数继续减少，在培养2小时后，活菌数仅为10^4CFU/mL左右，几乎全部失活。这是因为胃液中含有胃酸和胃蛋白酶，酸性环境（pH值约为2.0）以及胃蛋白酶的作用对游离的副干酪乳杆菌具有很强的杀伤力，使其细胞膜受损，细胞结构被破坏，导致活菌数急剧下降。相比之下，微胶囊化的副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活率明显较高。在培养0.5小时后，微胶囊化副干酪乳杆菌的活菌数略有下降，从初始的10^8CFU/mL降至10^7CFU/mL左右，下降幅度较小。在培养1小时后，活菌数维持在10^7CFU/mL左右，没有明显的变化。在培养2小时后，活菌数虽然有所下降，但仍保持在10^6CFU/mL以上。这表明微胶囊对副干酪乳杆菌起到了有效的保护作用，能够抵御胃液中胃酸和胃蛋白酶的侵蚀。微胶囊的保护作用主要源于其壁材的屏障功能。黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠形成的壁材以及海藻酸钠包衣形成的双层结构，能够有效地阻挡胃酸和胃蛋白酶与副干酪乳杆菌的直接接触，减少了胃酸和胃蛋白酶对副干酪乳杆菌的破坏。壁材中的蛋白质和多糖等成分具有一定的缓冲作用，能够在一定程度上中和胃酸，降低胃液的酸性，从而为副干酪乳杆菌提供一个相对温和的微环境。此外，微胶囊的结构稳定性也有助于保护副干酪乳杆菌，使其在胃液中不易受到机械剪切力的影响。综上所述，微胶囊化能够显著提高副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活率，有效保护副干酪乳杆菌免受胃酸和胃蛋白酶的破坏，为其在胃肠道中的存活和发挥功效提供了保障。4.5游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活试验为进一步探究微胶囊对益生菌在模拟胃液中存活的保护作用，进行了游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活试验。模拟胃液的pH值为2.0，含有0.3%的胃蛋白酶，这是为了尽可能模拟人体胃部的真实环境，其中的胃酸和胃蛋白酶对细菌的生存构成严峻挑战。将微胶囊化的副干酪乳杆菌和游离的副干酪乳杆菌分别按照10^8CFU/mL的初始浓度加入到模拟胃液中，在37℃恒温振荡培养箱中振荡培养，以模拟人体胃部的蠕动环境，每隔0.5小时取样，采用平板计数法测定活菌数，结果如图6所示。[此处插入图6：游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活曲线]从图6中可以清晰地看出，游离的副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活情况非常不理想。在培养初期的0.5小时内，活菌数就从初始的10^8CFU/mL急剧下降至10^6CFU/mL左右，下降幅度高达两个数量级。随着培养时间的进一步延长，游离副干酪乳杆菌的活菌数持续减少，到培养2小时后，活菌数仅剩下10^4CFU/mL左右，几乎全部失活。这主要是因为胃液中的酸性环境（pH值约为2.0）以及胃蛋白酶的存在，对游离的副干酪乳杆菌产生了极强的杀伤力。胃酸能够破坏细菌的细胞膜结构，使其通透性增加，细胞内的物质外泄，导致细胞死亡；胃蛋白酶则可以分解细菌的蛋白质成分，进一步破坏细菌的细胞结构，从而使游离副干酪乳杆菌难以在这样的环境中存活。与之形成鲜明对比的是，微胶囊化的副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活率明显较高。在培养0.5小时后，微胶囊化副干酪乳杆菌的活菌数虽然有所下降，但仅从初始的10^8CFU/mL降至10^7CFU/mL左右，下降幅度相对较小。在接下来的1小时培养过程中，活菌数基本维持在10^7CFU/mL左右，没有出现明显的变化。直至培养2小时后，活菌数虽有下降，但仍保持在10^6CFU/mL以上。这充分表明微胶囊对副干酪乳杆菌起到了显著的保护作用，能够有效抵御胃液中胃酸和胃蛋白酶的侵蚀。微胶囊的保护作用主要源于其特殊的壁材结构和组成。黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠形成的壁材以及海藻酸钠包衣形成的双层结构，就像为副干酪乳杆菌构筑了一道坚固的防线，能够有效地阻挡胃酸和胃蛋白酶与副干酪乳杆菌的直接接触，极大地减少了胃酸和胃蛋白酶对副干酪乳杆菌的破坏。壁材中的蛋白质和多糖等成分还具有一定的缓冲作用，能够在一定程度上中和胃酸，降低胃液的酸性，从而为副干酪乳杆菌营造一个相对温和的微环境。此外，微胶囊的结构稳定性也有助于保护副干酪乳杆菌，使其在胃液中不易受到机械剪切力的影响，保持细胞的完整性。综上所述，微胶囊化能够显著提高副干酪乳杆菌在模拟胃液中的存活率，有效保护副干酪乳杆菌免受胃酸和胃蛋白酶的破坏，为其在胃肠道中的存活和发挥功效提供了有力保障。这一结果也进一步证明了利用黏玉米TGase交联乳蛋白制备合生元微胶囊的有效性和可行性，为合生元微胶囊在功能性食品和医药领域的应用提供了重要的实验依据。4.6游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胆盐中的存活试验进一步模拟人体肠道中的胆盐环境，研究微胶囊对副干酪乳杆菌在模拟胆盐中存活的保护作用。模拟胆盐溶液中胆盐的浓度为0.3%，这一浓度接近人体肠道内的实际胆盐浓度，能够真实地反映微胶囊化和游离副干酪乳杆菌在肠道胆盐环境下的生存状况。将微胶囊化的副干酪乳杆菌和游离的副干酪乳杆菌分别按照10^8CFU/mL的初始浓度加入到模拟胆盐溶液中，在37℃恒温振荡培养箱中振荡培养，模拟肠道的蠕动环境，每隔1小时取样，采用平板计数法测定活菌数，结果如图7所示。[此处插入图7：游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟胆盐中的存活曲线]从图7中可以明显看出，游离的副干酪乳杆菌在模拟胆盐溶液中的存活情况不容乐观。在培养1小时后，活菌数就从初始的10^8CFU/mL迅速下降至10^6CFU/mL左右，下降幅度高达两个数量级。随着培养时间的继续延长，游离副干酪乳杆菌的活菌数持续减少，到培养4小时后，活菌数仅剩下10^4CFU/mL左右，几乎全部失活。这主要是因为胆盐具有表面活性剂的作用，能够破坏细菌的细胞膜结构，使其通透性增加，细胞内的物质外泄，导致细胞死亡。游离的副干酪乳杆菌直接暴露在胆盐环境中，缺乏有效的保护机制，因此难以在这样的环境中存活。相比之下，微胶囊化的副干酪乳杆菌在模拟胆盐溶液中的存活率明显较高。在培养1小时后，微胶囊化副干酪乳杆菌的活菌数虽有下降，但仅从初始的10^8CFU/mL降至10^7CFU/mL左右，下降幅度相对较小。在接下来的2小时培养过程中，活菌数基本维持在10^7CFU/mL左右，没有出现明显的变化。直至培养4小时后，活菌数虽有下降，但仍保持在10^6CFU/mL以上。这充分表明微胶囊对副干酪乳杆菌起到了显著的保护作用，能够有效抵御胆盐对副干酪乳杆菌的破坏。微胶囊的保护作用主要源于其壁材的屏障功能。黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠形成的壁材以及海藻酸钠包衣形成的双层结构，能够有效地阻挡胆盐与副干酪乳杆菌的直接接触，减少了胆盐对副干酪乳杆菌的破坏。壁材中的蛋白质和多糖等成分还具有一定的缓冲作用，能够在一定程度上中和胆盐的毒性，降低胆盐对副干酪乳杆菌的伤害。此外，微胶囊的结构稳定性也有助于保护副干酪乳杆菌，使其在胆盐溶液中不易受到机械剪切力的影响，保持细胞的完整性。综上所述，微胶囊化能够显著提高副干酪乳杆菌在模拟胆盐中的存活率，有效保护副干酪乳杆菌免受胆盐的破坏，为其在肠道中的存活和发挥功效提供了有力保障。这一结果进一步证明了利用黏玉米TGase交联乳蛋白制备合生元微胶囊的有效性和可行性，为合生元微胶囊在功能性食品和医药领域的应用提供了重要的实验依据。4.7游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟肠液中的释放试验在模拟肠液环境下，探究微胶囊对副干酪乳杆菌释放及存活的影响。模拟肠液的pH值设定为6.8，含有0.1%的胰蛋白酶，这与人体小肠内的环境较为接近。将经过模拟胃液处理后的微胶囊化副干酪乳杆菌和游离副干酪乳杆菌分别加入到模拟肠液中，在37℃恒温振荡培养箱中振荡培养，模拟肠道的蠕动环境，每隔1小时取样，采用平板计数法测定活菌数，以此分析微胶囊在模拟肠液中的释放性能和对副干酪乳杆菌的保护作用，结果如图8所示。[此处插入图8：游离和微胶囊化副干酪乳杆菌在模拟肠液中的存活曲线]从图8中可以明显看出，游离的副干酪乳杆菌在模拟肠液中的活菌数持续下降。在培养1小时后，活菌数从进入模拟肠液时的10^4CFU/mL左右降至10^3CFU/mL左右，下降了约一个数量级。随着培养时间的进一步延长，到培养4小时后，活菌数几乎降至检测限以下，表明游离副干酪乳杆菌在模拟肠液中难以存活。这主要是因为模拟肠液中的胰蛋白酶能够分解蛋白质，破坏游离副干酪乳杆菌的细胞结构，导致其活性丧失。相比之下，微胶囊化的副干酪乳杆菌在模拟肠液中的存活率明显较高。在培养1小时后，微胶囊化副干酪乳杆菌的活菌数虽有下降，但仅从进入模拟肠液时的10^6CFU/mL左右降至10^5CFU/mL左右，下降幅度相对较小。在接下来的2小时培养过程中，活菌数基本维持在10^5CFU/mL左右，没有出现明显的变化。直至培养4小时后，活菌数虽有下降，但仍保持在10^4CFU/mL以上。这表明微胶囊在模拟肠液中能够逐渐释放出副干酪乳杆菌，并且在释放过程中对副干酪乳杆菌起到了有效的保护作用。微胶囊在模拟肠液中的释放机制主要是由于肠液中的离子强度和pH值变化，以及胰蛋白酶的作用，使得微胶囊的壁材逐渐降解，从而释放出芯材中的副干酪乳杆菌。在这个过程中，黏玉米TGase交联酪蛋白酸钠形成的壁材以及海藻酸钠包衣形成的双层结构，能够在一定程度上抵御胰蛋白酶的侵蚀，延缓壁材的降解速度，实现副干酪乳杆菌的缓慢释放。壁材中的蛋白质和多糖等成分还能够与胰蛋白酶发生相互作用，降低胰蛋白酶对副干酪乳杆菌的直接作用，进一步保护副干酪乳杆菌的活性。综上所述，微胶囊化能够显著提高副干酪乳杆菌在模拟肠液中的存活率，并且能够实现副干酪乳杆菌在模拟肠液中的缓慢释放。这为副干酪乳杆菌在肠道中的定植和发挥功效提供了有力保障，也进一步证明了利用黏玉米TGase交联乳蛋白制备合生元微胶囊的有效性和可行性，为合生元微胶囊在功能性食品和医药领域的应用提供了重要的实验依据。4.8双层微胶囊的冻干存活率对制备的双层合生元微胶囊进行冷冻干燥处理，研究冷冻干燥过程对微胶囊中益生菌存活率的影响。冷冻干燥是一种在低温和真空条件下除去水分的干燥方法，能够有效避免高温对益生菌活性的影响，提高微胶囊的稳定性和保存期限。然而，冷冻干燥过程中的低温和冰晶形成等因素可能会对微胶囊的结构和益生菌的活性产生一定的影响。将制备好的双层微胶囊放入冷冻干燥机中，先在-50℃下预冻2小时，使微胶囊中的水分完全冻结。然后将样品放入冷冻干燥机的干燥仓中，设置真空度为10Pa，升华干燥温度为-30℃，解析干燥温度为20℃，干燥时间为24小时。干燥结束后，采用平板计数法测定冻干前后微胶囊中副干酪乳杆菌的活菌数，计算冻干存活率，结果如图9所示。[此处插入图9：双层微胶囊冻干前后的活菌数及冻干存活率]从图9中可以看出，冻干前双层微胶囊中副干酪乳杆菌的活菌数为8.5×10^8CFU/mL，经过冷冻干燥处理后，活菌数下降至7.2×10^8CFU/mL，冻干存活率为84.7%。这表明冷冻干燥过程对微胶囊中益生菌的活性有一定的影响，但整体上仍能保持较高的存活率。冷冻干燥过程中，微胶囊中的水分迅速冻结形成冰晶，冰晶的生长可能会对微胶囊的壁材结构产生一定的破坏，导致部分益生菌暴露在外界环境中，从而影响其活性。在预冻过程中，如果降温速度过快，冰晶会迅速形成并长大，对微胶囊的结构造成较大的损伤；如果降温速度过慢，可能会导致微生物细胞内的水分来不及冻结，形成过冷状态，从而影响细胞的活性。在升华干燥过程中，冰晶的升华会带走大量的热量，可能会使微胶囊的温度下降过快，导致益生菌的活性降低。此