吸光光度法课件

吸光光度法光谱分析法原子吸收法红外光谱法原子发射法核磁共振法荧光光谱法紫外可见分光光度法分子光谱原子光谱光分析方法可见分光光度法概述仪器和方法显色反应和显色条件的选择吸光光度法原理物质对光的选择性吸收光的吸收定律具体应用单组分测定多组分测定示差法测定测定条件的选择参比液入射光读数范围一.概述

吸光光度法:

基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法。分类：根据物质所吸收光的波长范围不同，分为紫外、可见及红外分光光度法。基本方法：有色物质浓度~颜色深浅~吸收光程度通过比较颜色深浅（吸收光程度），测定物质的浓度。方法分类和比较10-5~10-6mol·L-110-5~10-8mol·L-1比色分析法分光光度法测定下限相对误差5%~10%2%~5%适用于分析半微量和微量的物质一.概述方法的评价适用面广快速、简便分析有色、无色、浅色物溶液状态、均质固态样品灵敏度高：浓度下限达10-5~10-6mol·L-1准确度高：相对误差通常为2~5％，显色比色一.概述用于化学平衡等的研究二.吸光光度法的基本原理1.可见光与颜色阳光棱镜连续光谱物质不连续光谱由两种或两种以上波长的光所组成复合光可见光区的划分:400450500550600650760λ/nm互补光的对应关系光的互补：蓝

黄二.吸光光度法的基本原理光谱示意表观现象示意2.物质对光的选择性吸收二.吸光光度法的基本原理物质的颜色与光的关系复合光完全吸收完全透过吸收黄色光复合光

（3）同一物质c不同时吸收曲线不同,λmax

不变;

（4）λmax有特征性，可作为定性依据。（1）同一物质对不同波长光的吸收程度不同;（2）每种物质都有一个最大吸收波长(λmax);信息：物质对光的选择性吸收及吸收曲线A

c1c2λmax二.吸光光度法的基本原理3.光吸收定律Beer-Lanbert定律Lanbert

定律:λ,c,T一定A∝光程距离

(b)A∝物质的浓度c-dI∝Idb-dI=k1Idb吸光度二.吸光光度法的基本原理λ,b,T一定bBeer定律:Beer-Lanbert定律——光吸收定律A——吸光度Io——入射光强度a——吸光系数I——透射光强度b——光程距离

c——浓度当一束平行单色光通过溶液时，溶液的吸光度A与溶液的c和b成正比。A∝cb

当b

一定时，A∝c，可以定量二.吸光光度法的基本原理

吸收光，A

，物质浓度。

注意:（1）物质不吸光，I=Io，A=0

物质吸收部分光，I＜Io，A＞0（2）A具有加和性，A总=A1+A2+……+An（3）入射光的λ：可见光,紫外光,红外光（4）光吸收定律的应用条件

稀溶液入射光为单色光二.吸光光度法的基本原理（5）也可以用透射光强度（透射率T%）表示T%的含义：物质不吸收光I=Io，

T%

=100%物质吸收部分光，I＜Io，T%＜100%T%，物质的浓度。二.吸光光度法的基本原理二.吸光光度法的基本原理A、T%和c的关系A

、T%

、c

。（6）吸光系数的二种表示形式浓度为1g/L的溶液，在某波长时，用1cm的比色皿，所测得的吸光度浓度为1mol/L的溶液，在某波长时，用1cm的比色皿，所测得的吸光度吸光系数a摩尔吸光系数ε

意义单位L/g·cmL/mol·cmA=abcA=εbc二.吸光光度法的基本原理（1）

在数值上等于c=1mol·L-1、b=1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波长和溶剂下的特征常数。（2）不随c和b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，故ε可作为定性鉴定的参数。摩尔吸收系数ε的讨论二.吸光光度法的基本原理（3）ε是物质的吸光能力的度量。同一吸收物质在不同波长下的ε值不同。在λmax处的εmax表明了吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测定可能达到的最大灵敏度。

（4）

ε

max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6~10）×104

：高灵敏；

ε=104~103

：中等灵敏；

ε<103：不灵敏。二.吸光光度法的基本原理例：

已知含[Fe2+]=500μg/L的溶液，当用邻二氮杂菲为显色剂测定铁时，用2cm比色皿，在波长508nm处测得吸光度A为0.19。请计算铁的摩尔吸光系数。解：二.吸光光度法的基本原理步骤配制一组浓度系列的标准溶液（ci）仪器测量一组相应的吸光度值（Ai）制图（ci

为横坐标，

Ai为纵坐标）标准曲线(1)(2)配制样品仪器测量相同条件Axcx查图得出cxAc·····Ax二.吸光光度法的基本原理4.吸光度测定方法5.偏离Beer-Lanbert定律的原因

出现的现象：

Ac

产生原因：1）单色光不纯在高浓度端，工作曲线呈弯曲状。A与c偏离线性现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小范围的复合光。二.吸光光度法的基本原理按光吸收定律:IoIo1Io2I1I2I试样

若入射光包含λ1和λ2二种波长光,

当照射试样后二.吸光光度法的基本原理讨论:当为纯单色光时，A总=ελ1bc当单色光不纯时，λ1=λ2ελ1=ελ2A总∝

c线性破坏结论：单色光纯度越差，线性越差λ1=λ2ελ1=ελ2二.吸光光度法的基本原理

2

1

A1

A2例

1=

2但

A1》A2

0减少单色光不纯引起偏差方法

———在

max处测量

在

max

处单色光不纯但

ε2=0测量误差较小二.吸光光度法的基本原理2）溶液本身引起的偏差（1）若溶液浓度＞0.01mol·L-1时，粒子间的相互作用（2）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在时，有反射、散射作用二.吸光光度法的基本原理例:(橙色)(黄色)λmax=450nmA总包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体使原物质浓度改变吸光度值变化产生偏离pH，平衡移,（3）溶液内部的化学变化二.吸光光度法的基本原理目视比色法c1c2c3c4c5[Fe(SCN)n]3-n配制一组标准浓度系列Cx三.仪器和方法分光光度法:仪器—分光光度计基本组成：光源单色器样品室显示器检测器三.仪器和方法＊光源(钨灯、氢灯、氘灯）能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱；足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长基本要求:常用的光源:可见光区:钨灯

(辐射波长为320nm~2500nm)紫外区:氢灯、氘灯(辐射波长为185nm~400nm)三.仪器和方法＊单色器作用:

将光源发射的复合光分解成单色光的光学系统（棱镜或光栅）三.仪器和方法组成:棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等棱镜分光三.仪器和方法入射狭缝：光源的光由此进入单色器准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束聚焦装置：将分光后的单色光聚焦至出口狭缝（透镜或凹面镜）色散元件：将复合光分解成单色光光栅分光原理三.仪器和方法

利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射角不同而将复合光分成单色光。＊样品室用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相应的池架附件三.仪器和方法比色皿厚度:0.5,1,2,3,…cm比色皿:石英池和玻璃池＊检测器作用：通过光电效应，使透过吸收池的光信号变成可测的电信号的装置。（光电管或光电倍增管）三.仪器和方法要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。(1)光电管(2)光电二极管阵列

(1)光电管三.仪器和方法涂光敏材料光照光敏材料产生电子产生电流电压光强度大电流大(2)光电二极管阵列三.仪器和方法电容器充电电容器放电光照射再次充电测量周期

光照射使电容放电

电容器再次充电

充电电量与二极管检测到的光子数目成正比

光子数与光强度成正比。＊显示器由检流计、数字显示、微机组成的自动控制和结果处理系统三.仪器和方法

四、显色反应和显色条件的选择1.显色剂作用2.显色反应的选择3.影响显色反应的因素4.显色剂的分类1.作用无色或浅色试样有色物+显色剂比色显色反应配合反应氧化还原反应缩合反应重氮化—偶氮化反应

四、显色反应和显色条件的选择2.显色反应的选择灵敏度高

ε=104－105(2)选择性好(3)有色物组成恒定，化学性质稳定(4)显色剂在测定波长处无明显吸收对比度=λmax有色物-λmax显色剂＞60nm

四、显色反应和显色条件的选择3.影响显色反应的因素(1)显色剂用量根据吸光度A与显色剂浓度cR的关系来确定cR选择——引起A变化最小处的cR（即曲线平坦处）M+RMR

四、显色反应和显色条件的选择例：Fe(ssal)+

紫红色pH=1.8~2.5pH=4~8Fe(ssal)-2

橙红色pH=8~11.5Fe(ssal)33-

黄色显色时间和温度由实验得出溶剂一般选择水作溶剂(2)显色溶液的pH值

测定不同pH值下，显色溶液的吸光度A，以A为纵坐标，pH为横坐标，制图。选择曲线平坦处pH

四、显色反应和显色条件的选择(3)共存离子的干扰可能存在的几种情况：本身有颜色

与显色剂反应生成有色物消除的方法：*加掩蔽剂（掩蔽剂不与被测离子反应，本身及反应产物不影响测定）*选择合适的显色反应条件*分离干扰离子

与显色剂与被测物生成更稳定的有色物共存离子

四、显色反应和显色条件的选择显色剂的种类:无机显色剂过氧化氢钼酸铵硫氰酸盐等有机显色剂生色基团：偶氮基、硫羰基、亚硝基等助色基团：含胺基、羟基等

四、显色反应和显色条件的选择1.入射光波长的选择2.参比溶液的选择

3.读数范围的选择五.测量条件的选择1.入射光波长的选择:一般选择最大吸收波长λmax若有干扰按实际情况而定波长选择适当，可提高灵敏度和准确性原则：吸收最大，干扰最小五.测量条件的选择2.参比溶液的选择（在测定波长处）溶剂空白试样空白试剂空白试样+掩蔽剂+显色剂无色无色无色有色无色无色无色略有略有试样显色剂其他试剂参比溶液有色有色其他组分有色五.测量条件的选择选择的原则选择的意义：扣除非待测组分的吸收，可获得被测定溶液真实的吸光度。3.读数范围的选择选择的原因:因为吸光度（透光度）刻度时的误差÷（εbc）浓度相对误差透光度读数绝对误差五.测量条件的选择结论：T%=10%~70%（A=1.0~0.15）不同透光度的相对误差（ΔT=1％）T%T%T%9520.8603.3203.29010.7502.9104.3805.6402.756.7704.0302.8122.0∴透光度T（A）的读数范围为：ΔT=1％由读数引起的浓度相对误差最小Tmin=36.8%Amin=0.434T与浓度读数误差的关系曲线：36.8%五.测量条件的选择1.单组分含量测定六.具体应用2.多组分含量测定1、单组分含量的测定Ac/mol·L-1Axcx步骤:注意:标准溶液和样品的配制方法，工作曲线的制作和样品测定时，所使用的仪器、条件必须一致。c1λAλ测量六.具体应用1）选择显色反应2）选择显色剂3）优化显色反应条件4）选择检测波长5）选择合适的浓度6）选择参比溶液7）建立标准曲线8）样品测定吸收曲线标准曲线2、多组分含量的测定多组分样品的吸收曲线有三种情况I.各组分吸收曲线的λmax互不干扰在各自的λmax处,按单组分的测定方法进行测定Aλ1=ελ1

bcaAλ2=ελ2

bcb六.具体应用II.a组分的λ1处，b组分无干扰，但b组分的测量λ2处，a组分有吸收Aλ1=εaλ1bcaAλ2=εaλ2bca+εbλ2bcbIII.各组分吸收曲线的λmax互有干扰Aλ1=εaλ1bca+εbλ1bcbAλ2=εaλ2bca+εbλ2bcb六.具体应用思考题：P270：3、4、6、7、8习题：P271：1、2、4、7、13第十章吸光光度法10.1概述

基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法，称为吸光光度法，包括比色法、可见紫外分光光度法及红外光谱法等。

红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。

紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm，主要用于有色物质的定量分析。10.1.1比色分析法和分光光度法的特点和适用范围1.灵敏度高；测定浓度的下限一般为10-5~10-6mol/L2.准确度较高；比色分析法的相对误差为5%~10%，分光光度法为2%~5%3.快速简便，应用广泛；10.1.2光的基本性质光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。400nm760nm可见光区域紫外区红外区在可见光区域各种光的波长范围：红光650~760nm橙光600~650nm黄光580~600nm黄绿光560~580nm绿光500~560nm蓝绿光480~500nm蓝光450~480nm紫光400~450nm

光的波动性和微粒性10.1.3光的选择吸收与溶液颜色1.光的互补色红橙黄绿青青蓝蓝紫白光

单色光与复合光单色光：具有同一波长的光复合光：不同波长组成的光可见光的波长大约在400～760nm之间，由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成，各种光具有一定的波长范围。

互补色光如果把适当颜色的两种色光按一定强度比例混合，可以组成白光，这两种色光称为互补色光。2.物质对光的选择吸收与物质颜色当一束白光通过溶液时，溶液能够选择性地吸收白光中的某一种波长的光，而让其余波长的光透过，我们看到的溶液颜色是吸收光的互补色。例如：CuSO4溶液呈兰色，是由于该溶液选择性的吸收了白光中的黄色光。又例：KMnO4溶液呈紫色，是由于溶液选择性的吸收了白光中的绿光。物质颜色和吸收颜色的关系物质颜色吸收光颜色波长范围

/nm黄绿紫400～450黄蓝450～480橙绿蓝480～490红蓝绿490～500紫红绿500～560紫黄绿560～580蓝黄580～600绿蓝橙600～650蓝绿红650～750例、某溶液在阳光（白光）下呈兰色，在钠光（黄光）下呈（）A、黄色B、兰色

C、无色D、黑色10.2吸光光度法基本原理10.2.1光吸收定律

当一束平行的单色光通过某一溶液时，由于溶液对光的吸收，透过光的强度必小于入射光的强度，单色光通过溶液被吸收的程度称为吸光度，用“A”表示。实验证明：式中：T——透光率,I0——入射光强度；It——透过光强度；a——吸光系数；b——液层厚度；c——溶液浓度；如果浓度c单位为mol/L，液层厚度b单位为cm,吸光系数a用表示，称为摩尔吸光系数，单位为——称为光吸收定律，又叫朗伯－比耳定律。摩尔吸光系数ε的讨论（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）可作为定性鉴定的参数；（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度（5）

εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6～10）×104

：高灵敏；

ε=(2～6）×104

：中等灵敏；

ε<2×104：不灵敏。（6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。例１：某溶液遵循光吸收定律，当浓度为C时透光率为T，当浓度为2C，液层厚度不变时，透光率为（）A、2TB、TC、D、T2例２：一束单色光通过厚度为1cm的有色溶液后，强度减弱20%，当它通过厚度为5cm的相同溶液时，强度将减弱（）A、42%B、58%C、67%D、78%例３、已知Fe2＋的浓度为560ug/l的溶液，显色后在2.00cm的比色皿中测得吸光度为0.2，则有色化合物的摩尔吸光系数为____L·mol－1·cm－1.（已知Fe的式量为55.85）例４、某有色溶液在2.00cm吸收池中，测得百分透光率T%=50,若改用（1）1cm（2）3cm厚的吸收池时，其T%和A各为多少？

10.２.２吸收光谱曲线同一溶液对不同波长的光，其吸光度不同，将不同波长的光通过某一固定溶液，测得每一波长下的吸光度，如果以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，所得曲线叫吸收光谱曲线。由图可知，（１）不同浓度的KMnO4溶液，其最大吸收波长相同，为５２５nm.即对绿光产生最大程度的吸收。（２）同一物质，吸收光谱曲线形状类似。例、下列表述不正确的是（）A、吸收光谱曲线表明了吸光度随波长的变化；B、吸收光谱以波长为纵坐标，吸光度为横坐标；C、吸收光谱曲线中，最大吸收处的波长为最大吸收波长；D、吸收光谱曲线表明了吸光物质的光吸收特性。某一物质的最大吸收波长是吸光光度分析中选择入射光的依据。10.３显色反应及显色条件的选择有些物质本身具有明显的颜色，如KMnO4，可以直接进行比色分析。但大多数物质本身无颜色或颜色浅，进行吸光光度分析时，须加入一种显色剂，将被测物质转化为一种有色物质，这个反应叫显色反应。10.３.１显色反应的要求１.灵敏度要高，２.选择性要好，３.有色化合物组成固定，４、有色化合物稳定性高10.３.２显色反应的条件１.显色剂用量；２.溶液酸度；３.温度；４.时间５.溶剂１.显色剂的适宜用量是通过实验测定的；２.综合考虑酸度对金属离子，显色剂的浓度及颜色，对配合物组成和稳定性的影响；３.显色反应有快有慢，适宜的显色时间和有色溶液的稳定程度必须通过实验来测定；４.温度影响有色化合物对光的吸收，表样和试样的显色温度应保持一致；10.４分光光度计光源单色器吸收池检测器显示记录系统1.光源：通常用低压钨丝灯，或氢灯、氘灯；2.单色器：在光电比色计中常用滤光片，在分光光度计中用棱镜或光栅。3.吸收池：又称为比色皿，石英玻璃制成，规格有0.5、1、2、3、5cm等。单色器滤光片:由有色玻璃片制成，只允许和它颜色相同的光通过，得到的是近似的单色光。棱镜:用光学玻璃或石英制成，光通过棱镜发生折射而色散。

光栅:光通过光栅发生衍射和干涉现象而分光。例：用光度比色计测量CuSO4溶液的吸光度，应选用_____颜色的滤光片，该溶液能最大程度的吸收__________颜色的光。A、兰兰B、绿黄C、黄黄D、黄兰

选择滤光片的原则：滤光片的颜色应与有色溶液的颜色互补。检测器：利用光电效应将光信号转化为电信号的一种装置。通常用硒光电池。检流计：常用光点反射式微电计，其标尺上有两种刻度，一是等分的百分透光度，另一种是不等分的吸光度。双光束紫外分光光度计10.5测定条件的选择1、选择适当波长的入射光

为使实验结果有较高的灵敏度，一般选择最大吸收波长的的入射光。例如KMnO4溶液，应选用波长为525nm的绿光为入射光。2、控制合适的吸光度范围在吸光度为0.2~0.8时，测定的准确度较高。例：为提高光度分析灵敏度的方法有（）A、增加显色剂用量B、增加被测溶液用量C、选择适当的参比溶液D、选择合适的入射光例：光度法测定某试液时，若A＞0.8,为提高其读数的准确度，应采取的最简便的措施是：A、减小入射光波长B、稀释被测液C、改换厚度较小的比色皿D、改换厚度较大的比色皿3、选择适当的参比溶液（1）当试样溶液、显色剂和其它试剂均无色时，——纯溶剂（蒸馏水）做参比溶液（溶剂空白).（２）如果显色剂无色，而试样溶液中其它离子有色时，应选用不加显色剂的试样溶液为参比溶液（试液空白）。（３）当试剂、显色剂有色，而待测试液无色时，则采用不加待测试液，按操作步骤加入显色剂和试液配置成参比溶液。（试剂空白）10.6吸光光度法应用1.标准曲线法0.20.80.40.6A

012

345C/mg·L-1分光光度法第十章吸光光度法思考题1．朗伯-比耳定律的物理意义是什么？写出其数学表达式。2．摩尔吸光系数ε的物理意义是什么？其大小与哪些因素有关？ε在分析化学中有何意义？3．什么是吸收曲线？什么是标准曲线？它们有何实际意义？4．显色反应如何选择？5．吸光度测量条件如何选择？6．光度分析法中，参比溶液应如何选择？1.答：当一束平行的单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶液的吸光度A与液层的厚度b和溶液的浓度c成正比。即A=lg(I0/I)=εbc2.答：摩尔吸光系数ε在数值上等于1mol·L-1吸光物质在1