PCR技术PCR技术的应用

PCR技术PCR技术的应用

一滴残留在裙子上的精液使得美国总统BillC1inton不得不坦承他与白宫实

习生有不合法的关系。由于他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做

为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymer

asechainreaction)--聚合酶链式反映具有的特色之一。这也是分子生

物医学令人震撼的一例。

何谓PCR

简朴的说，PCR就是运用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(InV

itro)的大量合成。基本上它是运用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常

用的技术，可以将一段基因复制为本来的一百亿至一千亿倍。

APCR的要素

基本的PCR须具有1.要被复制的DNA模板(Template)2.界定复制范

围两端的引物(Primers).3.DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料

及水。PCR的反映涉及三个重要环节，分别是1).Denaturation2).A

nnea1ingofprimers,and3).Extensionofprimerso所谓

Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以

做为复制的模板.而Annealing则是令Primers于一定的温度下附着于模板

DNA两端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-poIymerase)的作用下进行

引物的延长(Extensionofprimers)及另一股的合成。

PCR的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容

整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助C

④一、引物设计A所谓“工欲善其事泌先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不

多，还是用软件方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来

也方便。设计软件有很多，既可以在线设计(如Primer3http://frodo.wi.mi

t.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi),也可以用Primer5、0

Iigo6.65等等。

1.引物设计的原则

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。抱负的引物对只同目的序列两

侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物也许会同时扩增其他的非目

的序列。下面的指导描述了一个可以增长特异性的引物所具有的令人满意的特

点:S)典型的引物18到24个核昔长。引物需要足够长，保证序列独特性，并

减少序列存在于非目的序列位点的也许性。但是长度大于24核昔的引物并不

意味着更高的特异性。较长的序列也许会与错误配对序列杂交，减少了特异性,

并且比短序列杂交慢，从而减少了产量。42)选择GC含量为40%到60%或G

C含量与模板GC含量接近的引物。分)设计5'端和中间区为G或C的

引物。这会增长引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

4)避免引物对3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体，克制扩增。在用软件

设计时大家经常会疑惑,究竟？G不能低于多少?这里有个数据：？G为

0~-2时,PCR产率可达100%,?G=-6时，为40%.W)避免3末端富含

GCo设计引物时保证在最后5个核昔中具有3个A或T。A6）避免3'末端

的错误配对。3,端核昔需要同模板退火以供聚合醐催化延伸。3,最佳以G或C

结尾，防止AT的松散结合引起错配。7A）避免存在也许会产生内部二级结

构如发夹结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

8）引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50%的引物和互补序列表现为

双链DNA分子时的温度。两引物的Tm值相差不应大于5C。计算Tm有

几种公式。第一个公式（Wallace规则）:Tm=4℃（g+C）+2℃（a+T）,

这来源于高盐溶液中的杂交，合用于小于15—20个碱基的引物，也合用于手工设

计时的简朴计算.第二个公式（Ba1dino算法）合用于计算14-70个核昔酸

在WO.4moi\L的阳离子溶液中的Tm,也可用于扩增产物的Tm计算.Tm=

81.5+16.6*lg[K+]+0.41（%[G+C]）-（675/n）0以上两种算法都是基于碱基

组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm也许差异不小:

GGGAA和GAGAG的Tm是不同样的，所以拟定引物Tm最可信的方法

是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳

定性。大部分计算机程序如Primer5等均使用近邻分析法。

9）当在引物5,端添加酶切位点时要考虑：a）该目的序列内部不得具有相同的酶

切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的

粗心人。这样的错误会给将来的克隆导致麻烦。b）假如打算PCR后直接酶处

不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的规定是

不同的。假如不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这

时要注意Taq酶的选择，这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并入存

在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5,端而不影响特异性。当

计算引物Tm值时并不涉及这些序列，但是应当对其进行互补性和内部二级结

构的检测。A10）有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如,假如仅

知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有

不同碱基也许性的不同序列的混合物。为了增长恃异性，可以参考密码子使用

表，根据不同生物的碱基使用偏好,减少兼并性。次英噪吟可以同所有的碱基配

对，减少引物的退火温度。特别要注意的是:不要在引物的3'端使用兼并碱基,

由于3,端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物

浓度（IpM到3pM）,由于许多兼并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

说了半天了,想起来还得提醒大家一句：千万别搞错了引物的位置!这句话似乎多

余。

看了上面的图吧，假如要扩增目的序列为“ATG.............TGA”的片段，则引物分

别为“ATG……”和"TCA……”仔细琢磨一下，特别是5'端再接上酶切位点可

别搞错了！合成错了一条可就是50块钱，届时候挨老板批的时候别怪我没提醒

你哦：）设计好『引物就要让公司合成，这时候别忘「谈价格:）现在竞争很历害,

价格已经挺便宜了，注意两个参数:一个是0D值，假如公司说1OD能比20D

优惠,那通常1OD足够了。第二是纯度，是HPLC的还是0PC的，事先

要说好，建议看看这里（唉，不是我给他们做广告，只是他们的说明书写得真不

错）：http：〃www.tak/product/cs/c3.htm#1弓I物设计

方面尚有很多话题可说，比如如何运用引物搭桥将两个片段通过PCR而不是

酶连接起来、假如要设计引物表达蛋白时注意“N端规则”。

A二、PCR成分A引用《分子克隆3》提供的PCR标准反映条件：*模板1p

g-1的

引物1pmol/L

DNA聚合酶1-5单位

Mg2+1.5mmoI/L'dNTPs200pmol/LAKCI50mmol/LlA.模板A

模板可是PCR的关键，模板的质量是PCR成功的先决条件，巧妇难为无米之

炊嘛!如何得到模板，这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组DNA就有很多

的名堂，这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦，有问题来论坛讨论吧。P

不出东西的时候不妨先考虑:模板有没有问题？（DNA样品中发现有多种污染

物会克制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS,在浓

度低至0.01%时就会克制扩增反映。）所需的最佳模板量取决于基因组的大小。

你的目的片段在基因组中占多少？至少要保证模板中具有一个单拷贝吧！100

ng至i」1pg的人类基因组DNA,相称于3x104到3x105个分子。所以对

于单拷贝基因，这需要0.1用的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠

杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，

一个抱子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则也许增长非特

异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。2A.引物A引物以干粉形式运

送。最佳用TE重溶引物，使其最终浓度为1OOpM。TE比去离子水好，由于

水的pH经常偏酸，会引起寡核昔的水解。当然，假如紧张TE对于PCR的

影响,不妨用ddH2Oo引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储

存在-20℃。以大于10uM浓度溶于TE的引物在-20°C可以稳定保存6个月，

但在室温（15C到30C）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20C保存至少

1年,在室温（15°C到30℃）最多可以保存2个月。注意：溶解之前先离心

一下,防止一开盖就飞了。引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.

1到0.5pM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物来的说

明书会告诉你.关于寡核苗酸的计算可以看看这里：http：//www.takara.。。

/product/fl/i1.htm

3.聚合酶的选择A这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题。重要考虑

两个方面:用途一对保真度的规定高不高？成本一高保真的前总是会贵一

些的。综合考虑一下找个平衡点吧，当然啦，该花钱的时候可不能省。TaqDN

A聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，由于其缺少3'到5外切核酸酶（校正）

活性。使用带有3'到5,外切核酸酶活性的热稳定聚合醐可以提高保真度。但

是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶

特性的描述，大家不妨比较一下。提醒一点:高保真醵除了我所知的Merck的E

asy-A以外，都不会在3,端加A尾巴（由于其3-5，外切酶活性），所以做TA

克隆的时候需要一点小诀窍一扩增完了再加普通Taq去加个Ao此外尚有个

方法:将TaqDNA聚合酶同带有3'到S外切核酸酶活性第二种聚合酶混合

在一起可以获得比单独TaqDNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及

扩增长模板。务.Mg2+浓度A镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的

活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子

结合,减少了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引

物对和模板都不同，但是包含200pMdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM

（注意:对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。在多

数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增长产量,但也会增长非特异性扩增，减少

忠实性（当然，也有相反的报道）。为了拟定最佳浓度，可以用0.1-5mm。

1/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反映

混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA

等也许影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。

5.dNTPs

高浓度的dNTPs会对扩增反映起克制作用。将每种dNTP的浓度从200口

M减少到25-5O|jM可以使扩增产物获得满意的产率。

6.KC1A标准浓度为50mmo1/L,对于较短片段可将其提高到70-100m

mol/L.

三，PCR反映参数.变性:在第一轮循环前，在94c下变性5・10min非常

重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart),

这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合

物所导致的错误。变性不完全,往往使PCR失败，由于未变性完全的DNA双

链会不久复性，减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃imino在变性温

度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间重要是为使反映体系完全

达成适当的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度.但变性温度过

高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2.退火:这是PCR的一个关键参数。在抱负状态下，退火温度足够低,以保证

引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火

温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃,当产物中包具有

影响实验的非可异性扩增带时，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退

火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。假如两个引物Tm不同，将退

火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm

设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行

剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火

温度越高，所得产物的特异性越高。有些反映甚至可将退火与延伸两步合并，只用

两种温度(例如用60c和94C)完毕整个扩增循环，既省时间又提高了特异

性。退火一般仅需数秒钟即可完毕,反映中所需时间重要是为使整个反映体系这

成合适的温度。分.延伸:延伸反映通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最

适反映温度75c.事实上，引物延伸在退火时即已开始，由于TaqDNA聚合酶

的作用温度范围可从20℃-85c.延伸反映时间的长短取决于目的序列的长度和

浓度.在一般反映体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。

延伸时间过长会导致产物非特异性增长.但对很低浓度的目的序列，则可适当增

长延伸反映的时间。一般在扩增反映完毕后,都需要一步较长时间(10-30min)

的延伸反映,以获得尽也许完整的产物，这对以后进行克隆或测序反映尤为重

要。尔.循环次数：当其它参数拟定之后，循环次数重要取决于DNA浓度。

一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异

性产物大量增长。通常经25-30轮循环扩增后，反映中TaqDNA聚合南已

经局限性，假如此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品

稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反映底物进行扩增，这样经60轮循

环后，扩增水平可达109-1010。扩增产物的量还与扩增效率有关，扩增产物的

量可用下列公式表达：C=Co(1+P)no其中:C为扩增产物量,CO为起始D

NA量，P为增效率，n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累，使本来呈指

数扩增的反映变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。

平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达成较

高水平。因此,应适当调节循环次数，在平台期前结束反映，减少非特异性产物。

会④四、提高PCR扩噌特异性

1,递减PCR（TouchDownPCR）A递减PCR通过在PCR的前几个循环

使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5c的退入温

度下开始，然后每个循环减少1℃到2°C（当然，也可以每几个循环降1-2℃）,直

到退火温度低于Tm5℃o特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在

随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板

同源性限度的方法更为有用，如AFLP?DNA指纹分析。

2.热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性。因

此，在进行PCR反映配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温

度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。

在用于引物设计的位点由于遗传元件的定位而受限时,如定点突变、表达克隆或

用于DNA工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效。并且,热启动

在很大限度上防止引物二聚的发生。限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法

是在冰上配制PCR反映液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简朴便宜，

但并不能完毕克制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动

通过克制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达成变性温度。涉及延

缓加入TaqDNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，特别是对

高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶,

包裹起来，或者将反映成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡

熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法同样，蜡防护层法

比较烦琐，易于污染，不合用于于高通量应用。A.促进PCR的添加剂

退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩

增，但是，某些模板，涉及高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA

熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的此外一种方法。为获得最佳

的结果需要模板的完全变性。此外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。P

CR添加剂，涉及甲酰胺,DMSO,甘油，甜菜碱以及PCRxEnhancerSolu

tion可以增强扩增。它们也许的机理是减少熔解温度，从而有助于引物退火

并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRxSolution尚有其他优点。

在同P1atinumTaqDNA聚合酶和PlatinumPfxDNA聚合酶一起使用

时，仅需很少的镁离子优化。这样，将P1atinum技术同添加剂结合，增强了特

异性，同时减少了第三种方法■镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加

剂的浓度，特别是会克制TaqDNA聚合酶的DMS0,甲酰胺和甘油。心.

巢式PCR

使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到2

0个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到

第二轮扩增中进行15到20个循环。或者,也可以通过凝胶纯化将起始扩增产

物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内

侧的靶序列结合。巢式PCR的使用减少了扩增多个靶位点的也许性，由于同两

套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到

40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增长有限量靶序列（如稀有mRN

A）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5RACE）的特异性。④

五、PCR产物测序A对于PCR产物的测序有两个方式:1MDNA直接测序:

指直接分析不经分离•的PCR扩增产物，假如各个位点上碱基序列都是一致的,

则所得信号是拟定的，否则,在那些有相异碱基的位点出现模糊信号，假如模

板在多数情况下被对的扩增，则少数的突变将被掩盖，这是结果显示的是模板的

序列.但是，当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累,这时就不再反

映模板的状况.2.PCR产物经克隆后测序：这是对单克隆测序，其结果是反

映单一扩增产物的序列，结果是拟定的.

A六、PCR污染与对策

PCR反映的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题

是易污染，极其微量的污染即可导致假阳性的产生.1A、污染因素

（一）标本间交叉污染标本污染重要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，

由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而导致互相间交叉污染;标本核酸

模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本特别是病

毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.

（二）PCR试剂的污染：重要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、

容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.A（三）PCR扩增产物污染.

这是PCR反映中最重要最常见的污染问题.由于PCR产物拷贝量大（一般为

1013拷贝/ml）,远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产

物污染，就可导致假阳就可形成假阳性.△尚有一种容易忽视，最也许导致PCR

产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作

时比较剧烈地摇动反映管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成

气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其导致的污染

是一个值得特别重视的问题Q（四）实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验

室及某些用克隆质粒做阳性对照的检查室，这个问题也比较常见.由于克隆质粒

在单位容积内含量相称高，此外在纯化过程中需用较多的用品及试剂，并且在

活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染

也许性也很人.2M污染的监测

一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么因素导致的污染，

以便采用措施，防止和消除污染Q对照实验：S）阳性对照:在建立PCR反映实

验室及一般的检查单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反映是否成功、

产物条带位置及大小是否合乎理论规定的一个重要的参考标志.阳性对照要选

择扩增度中档、反复性好,经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对

照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）.但阳性对照特别是重组质粒及高浓

度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的也许性很大.因而当某一PCR试剂

经自己使用稳定，检查人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.

2）阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它涉及①标本对照:被检的标不是

血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细

胞作对照.②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR

扩增，以监测试剂是否污染.

3）反复性实验心）选择不同区域的引物进行PCR扩增

3、防止污染的方法

（一）合理分隔实验室:招样品的解决、配制PCR反映液、PCR循环扩增及P

CR产物的鉴定等环节分区或分室进行，特别注意样本解决及PCR产物的鉴定

应与其它环节严格分开.最佳能划分①标本解决区；②PCR反映液制备区;③PC

R循环扩增区；④PCR产物鉴定区.其实验用品及吸样枪应专用.实验前应

将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA.

（二）吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板

核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要

十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完毕，忌多次抽吸，以免交叉污染或产气

愤溶胶污染内三）预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如

有也许，PCR反映液应预先配制好，然后小量分装，・20℃保存.以减少反复加

样次数，避免污染机会.此外，PCR试剂,PCR反映液应与样品及PCR产物

分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱.

（四）防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.

（五）设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标

准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的也许性，每次反映都应有一管不加模板的

试剂对照及相应不具有被扩增核酸的样品作阴性对照.

（六）减少PCR循环次数，只要PCR产物达成检测水平就适可而止.

（七）选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入，打

开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要把,以防管

内液体溅出.A4、PCR污染解决对策（这是从另一篇文章总结而来，与前面的

部分略有反复，大家随便看看吧）PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残

留污染的问题。A

一.污染的防止A进行PCR操作时，操作人员应当严格遵守一些操作规程，最

大限度地减少也许出现的APCR污染或杜绝污染的出现。④（一）划分操作区：

目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全团管操作,但无论是否可以达成

单人单管,均规定实验操作在三个不同的区域内进行FCR的前解决和后解决

要在不同的隔离区内进行：1A.标本解决区，涉及扩增摸板的制备;2A.pcR

扩增区，涉及反映液的配制和PCR扩增；3A,产物分析区，凝胶电泳分析，

产物拍照及重组克隆的制备。A各工作区要有一定的隔离，操作器材专用,要有一

定的方向性。如:标本制备-PCR扩增？产物分析？产物解决…牢记产物分

析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

（二）分装试剂:PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负

压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增

后的DNA和其他来源

的DNA：

1.PCR用水应为高压的双蒸水；

2.引物和dNTP用高压的双蒸水在尢PCR扩增产物区配制；裂.引物和dNT

P应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找因素。A（三）实验操

作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反映的因素，样品间的交

叉污染也是因素之一。因此，不仅要在进行扩增反映是谨慎认真，在样品的收集、

抽提和扩增的所有环节都应当注意：

1.戴一次性手套，若不小心溅上反映液，立即更换手套；

2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露

于空气中,避免气溶胶的污染；

3.避免反映液飞溅，打开反映管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管

底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;心.操

作多份样品时，制备反映混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分

装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增长反映的精确度35.最后加入反

映模板，加入后盖紧反映管；

6.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反映的可靠性，又可以

协助判断扩增系统的可信性；

7.尽也许用可替换或可高压解决的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶

或标本DNA的污染，最佳使用可替换或高压解决的加样器。如没有这种特殊

的加样器，至少PCR操作过程中加样器应当专用，不能交叉使用，特别是PCR

产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；A8.反复实验，验证结果，慎下结

论。④

二.追踪污染源

假如不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐个分析，排除污染。

（一）设立阴阳性对照:有助于监测反映体系各成分的污染情况。选择阳性对照时,

应选择扩增弱，且反复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，

反而也许成为潜在的污染源。假如以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝

之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，由于PCR敏感

性极高，可以从其它方法（Sourthern印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测

出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应涉及PCR体系中各试剂的时机对照，

即涉及PCR反映所需的所有成分，而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR

产物残留污染是非常有益的。假如扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一

种或数种试剂被污染了。此时，要所有更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设

立不同的反映管，每一管具有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应立即解

决。A（二）环境污染:在排除试剂污染的也许性外,更换试剂后，若不久又发现

试剂被污染了，假如防止措施比较严密，则考虑也许为环境污染。

环境污染中常见的污染源重要有：

1.模板提取时真空抽干装置;A2.凝胶电泳加样器;秘.电泳装置;4.紫外分析

仪泠5.切胶用刀或手术刀片；

6.离心机；

7.冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等;此时可用擦拭实验来查找可疑污

染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源;2）0.1ml去离子水

浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。

8.气溶胶。假如通过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染也许是

由空气中PCR产物的气溶胶导致的，此时就应当更换实验场合，若条件不允许，

则重新设计新的弓I物（与原引物无相关性）。A

三.污染解决

（-）环境污染

1.稀酸解决法：对可疑器具用1m。1/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱

喋吟泠2.紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm,照射30

min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑P

CR产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV照射仅对500bp以上长片

段有效，对短片段效果不大。UV照射时,PCR产物中喀咤碱基会形成二聚体，

这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有喀咤均能形成二聚体，且

UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的限度取决于UV波长，喀陡二聚

体的类型及与二聚体位点相邻核甘酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成

二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型喀

嚏复合体,胸腺喀唾乙二醇,DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止T

aqDNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相称。假如这些位点（

0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有3

2处损伤位点，那么,105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，

假如100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子

没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的因素。A△（二）反映液

污染A可采用下列方法之一解决：

1.DNaseI法:PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNa

seI,室温反映30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常

PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；

2.内切酶法：选择辨认4个碱基的内切酶（如MspI和TaqI等），

可同时选择几种，以克服用一种酶只能辨认特定序列的缺陷，室温作用1h后加

热灭活进行PCR；

3.紫外照射法:未加模板和Taq聚合前的PCR混合液进行紫外照射，注意

事项与方法同上述UV照射法;张.g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完

全破坏0.1ng基因组DNA,2.0kGy可破坏104拷贝的质粒分子,4.0k

Gy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而

不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。

4（三）尿喀咤糖甘酶（UNG）法

由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测

的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的防止作用日益受到直