《肉与肉制品外源成分残留规范》标准（征求意见稿）

3T/HNSPXHXXXX—XXXX肉制品中动物性外源基因最大残留限量本文件规定了肉制品中动物性外源基因的最大残留限量。本标准适用于肉制品的动物性（猪牛羊鸡鸭）外源成分的最大残留检测，不适用于猪牛羊鸡鸭外的其他动物性成分检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1肉制品以畜禽肉或其食用副产品等为主要原料，添加或者不添加辅料，经腌、卤、酱、蒸、煮、黑、烤、烘焙、干燥、油炸、成型、发酵、调制等有关生产工艺加工而成的生或熟的肉类制品。3.2动物性外源成分肉制品标签上未标注，即生产中所用原料肉之外的其他动物源成分。3.3动物性内源成分肉制品标签上标注，即生产中所用原料肉动物源成分。4应用原则4.1食品生产时，食品生产者、加工者应尽可能避免外源成分的带入，不允许蓄意加入产品标签之外的原料肉。4.2样品的采集和处理及检验按照附件执行。5要求5.1外源成分检出率要求T/HNSPXHXXXX—XXXX4类别动物性外源成分要求检测方法肉制品未检出1，或相对含量≤1%2附件11：成分筛查检测中未检出外源性成分（只出现动物性内源成分熔解曲线峰，未出现动物性外源成分熔解曲线峰）2：表示被检动物源性成分占内外源动物源性成分的百分比含量。T/HNSPXHXXXX—XXXX5附件1畜禽肉产品、单一型肉制品、混合型肉制品动物性外源成分检测方法本方法是利用RT-PCR技术，对样品中动物源性成分定性筛查和相对定量检测。其中，源性成分筛查，通过扩增子热力学多态性设计，构建能同步特异性扩增多个具有Tm值显著差异动物源性成分的多重RT-PCR扩增体系，依据扩增后熔解曲线峰的个数和位置，可判定样品中的动物源性成分组成。相对定量，是利用动物线粒体DNA序列物种多态性和保守性共存的特点，设计物种特异性和物种通用性引物/Taqman探针组成共链参比扩增体系，依据∆Ct值-百分比含量标准曲线，可测定动物源性成分的相对含量（占所有肉种成分的百分比含量）。2.检测用引物和探针2.1定性筛查表1动物源性成分筛查引物名称序列猪上游引物：5’-TACTTCTACTATCCCTGCCAGTTC-3’下游引物：5’-TGATAAAGGATAGGGTCTCCACCA-3’牛上游引物：5’-GTTCTTCACGACACATACTACGTT-3’下游引物：5’-GCAAATACAGCTCCTATTGATAAA-3’羊上游引物：5’-AACAAAGCGCCTTAAACCAATT-3’下游引物：5’-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT-3’鸡上游引物：5’-CCCTAAAAATAGACATATACTCC-3’下游引物：5’-ATGTTATTTGCGATGGTTAGTG-3’鸭上游引物：5’-TCTTAACTGTCTCTCACGGAT-3’下游引物：5’-CGAAAAATATCGGCCATGCTC-3’上游引物：5'-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3'下游引物：5'-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3'2.2相对定量表2动物源性成分相对定量引物名称序列上游引物：5'-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3'下游引物：5'-AGATAGAAACCGACCTGGAT-3'探针：5'-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3'猪上游引物：5'-ATCTGAATCAATGCAACAGTACAT-3'下游引物：5'-TGATAGTGAGTCGGAGAAGAATGT-3'或65'-GAACTAGTAGGGGTGCTGATAGTG-3'或5'-ATTAAGGCTGTTTTCGCCTAGT-3'探针：5'-FAM-TCTCCTCATTAGCCTGATCAGTCTATCCC-TAMERA-3'羊上游引物：5'-ATAATCTGAATCAACACCACACTTC-3'下游引物：5'-TAGATAAGGAGTCGGAGAAAAAAGT-3'探针：5'-FAM-AGCTTGCTAATCAGCCTCACAAGCC-TAMERA-3'牛上游引物：5'-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3'下游引物：5'-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3'探针：5'-FAM-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-TAMERA-3'鸡上游引物：5'-AGTGCGTCAAAGCTCCCTCAT-3'下游引物：5'-GTGTGGGGGTATAAGTTGAGT-3'探针：5'-FAM-AAATCTAAAACCCTATTTGACTCCCTCAACC-TAMERA-3'鸭上游引物：5'-TCTTAACTGTCTCTCACGGAT-3'下游引物：5'-CGAAAAATATCGGCCATGCTC-3'探针：5'-FAM-TCAGTGAAATTGATCTCCCCGTGCAAAAGC-TAMERA-3'3.试剂苯酚（Tris饱和酚，pH8.0）、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70%乙醇。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GIB/T6682中二级水的要求。4.配制溶液TE缓冲液（Tris-HCl，EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0，1%CTAB裂解液（0.05mol/LTris-HCl（pH8.00.7mol/LNaC1，0.01mol/LEDTA（pH8.0、CTAB沉淀液（三氯甲烷+异戊醇（24﹕1）。5.仪器5.1实时荧光PCR仪。5.2恒温水浴锅。5.3离心机。5.4微量移液器。5.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.6涡旋振荡器。5.7分析天平。6.样品采集称取3~50g肉样至匀浆杯中（根据样品量选择合适的匀浆杯）按照1﹕3.2~5.2的重量比加入去离子双蒸水，8000~12000r/min搅拌8~15分钟，用1000μL微量移液器吸取3~5mL离心管中，用涡旋振荡器震荡1~3min，用100μL微量移液器吸取50~100μL匀浆液至1.5mL离心管中（取3个平行），待T/HNSPXHXXXX—XXXX7后续处理。7.试验步骤7.1DNA提取在取完样品的1.5mL离心管中，加入600~900μL裂解液，65°C孵育25~50min，期间不时振荡混匀。11000~13000g离心5~10min，转移600~900μL上清液于洁净离心管中，加入400~600μLCTAB蛋白沉淀液，振荡混匀后，11000~13000g离心5~10min，取300~500μL上清液于洁净离心管中，加200~400μL异丙醇，室温下沉淀1-2h。11000~13000g离心5min，弃掉上清液，然后用400~600μL70%乙醇洗涤一次（11000~13000g离心5min），弃掉上清液，晾干，加入50~200μLTE缓冲液，溶解沉淀，4°C过夜。或使用等效商用DNA提取试剂盒。7.2DNA提取质量控制按照GB/T34796方法测定并计算DNA的浓度，判定DNA的浓度和纯度。注：实测荧光PCR扩增试验前，使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，DNA浓度稀释至5ng/μL~50ng/μL范围，A260/A280值在1.7~2.1之间。7.3成分筛查7.3.1多重实时荧光PCR扩增检测过程设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有目标成分的样品或含有扩增靶序列的质粒作为阳性对照，以不含目标成分的样品或不含有扩增靶序列的质粒作为阴性对照，用双蒸水作为空白对照。样品和对照设置2个平行的反应体系，分别进行多重靶向基因和内参基因扩增，以Tm值为作为结果判定依据。反应体系总体积为25μL，可根据使用仪器的需要调整该比例反应体系各组分的量，详见表3多重RT-PCR反应体系组分及配比（总体积25μL）PremixExTaqTM预混液(μL）*引物名称上游引物（5μM，μL）下游引物（5μM，μL）水(μL）12.5μL猪0.20.2补足25μL牛0.30.3羊0.40.4鸡0.20.2鸭4.04.0*：或使用等效试剂或商品试剂盒。7.3.2实时荧光PCR反应参数预变性：95℃*300秒；T/HNSPXHXXXX—XXXX8变性：95℃*15秒；退火+延伸：57℃*45秒；28个循环；在每次循环的退火时收集荧光；熔解曲线：95℃*60秒；65℃*60秒；以0.02℃/s速率升温至95℃,同时连续检测荧光强度；降温：40℃*60秒。7.3.3结果判定根据物种特异性扩增产物Tm值的熔解曲线峰的有/无，判定试样中是/否含有该物种。其中，Tm值在71.50~73.50℃范围内出现熔解峰为羊源性成分检出；Tm值在75.50~77.00℃范围内出现熔解峰为牛源性成分检出；Tm值在80.00~81.50℃范围内出现熔解峰为猪源性成分检出；Tm值在82.00~83.00℃范围内出现熔解峰为鸡源性成分检出；Tm值在84.50~86.00℃范围内出现熔解峰为鸭源性成分检出。如果有外源动物源性成分检出，则进行后续相对定量检测。7.4相对定量检测对7.3筛查出的动物性内外源成分进行相对定量检测。7.4.1实时荧光PCR反应设置3个平行的反应体系，实时荧光PCR反应体系总体积为25μL，可根据使用仪器的需要调整该比例反应体系各组分的量，详见见表4。表4相对定量RT-PCR反应体系组分及配比（总体积25μL）体系PremixExTaqTM预混液(μL）上游引物（5μM，μL）下游引物（5μM，μL）探针水(μL）猪0.6补足25羊0.6补足25牛0.6补足25鸡0.6补足25鸭0.6补足25通用0.6补足257.4.2实时荧光PCR反应参数预变性：95℃*300秒；变性：95℃*10~15秒；退火+延伸：58~62℃*45~60秒；35个循环；在每次循环的退火时收集荧光；降温：40℃*60秒。7.4.3标准曲线标准样品：按照上述样品处理方法和DNA提取步骤。提取3~50g（根据待测样品量而定）纯待测动物源性成分肉总DNA（或商品化标准样品），用灭菌双蒸水稀释成浓度分别为100%、50%、20%、10%、1%、0.1%的DNA模板标准样品，用于制作标准曲线。T/HNSPXHXXXX—XXXX9标准曲线设置方法：用猪特异性反应体系对系列浓度DNA模板标准样品和用通用反应体系对100%猪肉DNA模板标准样品进行RT-PCR扩增，1g（纯猪肉样品浓度）vs（Ct纯绪肉Ct通用）做图，即制得相对定量法标准曲线。标准曲线斜率为k2、截距为C2。7.4.4样品检测将混合肉样按前述方法处理和提取DNA模板，按表1的试剂体系加样到RT-PCR板（每个样品都分别在平行孔内加入括猪反应体系和通用反应体系两种反应体系同时按照前述的标准曲线加样方法进行加样。按照上述反应条件进行RT-P