4完整版本.第四章-抗菌药物敏感试验(上)

第四章

抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验（AST）：指体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。AST意义：预测抗菌治疗的效果指导临床选择用药进行耐药菌监测评价新药的效果第一节抗菌药物敏感性试验一、抗菌药物选择A组常规首选药物，全部报告B组医院感染重要药物，选择性报告C组用于A、B组耐药或过敏的患者U组用于尿道分离细菌O组一般不允许常规试验并选择的药物二、常用方法1.纸片扩散法—K-B纸片法2.稀释法肉汤稀释法：宏量、微量琼脂稀释法3.抗菌药物梯度法—E-test4.自动化仪器法二、纸片扩散法（K-B法）（一）实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含有的药物溶解后向周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关（二）培养基和抗菌药物纸片1.抗菌药物纸片专用药敏纸片：直径-6.35mm

吸水量-20微升2.培养基水解酪蛋白（M-H）琼脂，琼脂厚度4mm链球菌属、肠球菌属、脑膜炎奈瑟菌：加5%脱纤维羊血嗜血杆菌属：Ⅴ、Ⅹ因子纸片扩散法3.菌液比浊管-0.5麦氏比浊管的制备：1%氯化钡：0.5ml1%硫酸溶液：99.5ml625nm处吸光度值为0.08~0.10，相当于1.5×108cfu/ml用前混匀有效期：6个月纸片扩散法（三）实验方法1.校正菌液浓度无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落，置于无菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管校正菌浓度。纸片扩散法纸片扩散法2.接种细菌-涂布法用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。纸片扩散法3.贴药敏纸片室温干燥3~5min各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。纸片扩散法4.读取试验结果经过35℃16～24h孵育，量取抑菌圈直径。纸片扩散法（四）结果判读和报告1.敏感（S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后所达到的血药浓度所抑制或杀死2.中介（I）：提高药物浓度或药物浓集部位有效。意义不确定3.耐药（R）：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，且不管其剂量大小或细菌所在部位纸片扩散法（五）质量控制1.菌液浓度：0.5麦氏比浊2.培养基：M-H琼脂，厚度为4mm3.质控菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等ATCC:AmericanTypeCultureCollection纸片扩散法4.培养要求大部分需氧菌：（35±2）℃，空气培养，16~18h；不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽窄食单胞菌：（35±2）℃，空气培养，20~24h；嗜血杆菌属：（35±2）℃，5%CO2，16~18h；链球菌属和奈瑟菌属的培养时间为20~24h；淋病奈瑟菌：（36±1）℃（不能超过37℃），5%CO2，20~24h

纸片扩散法葡萄球菌检测对甲氧西林、苯唑西林、奈夫西林和万古霉素敏感性时培养时间必须延长至24h（金葡为18h）且温度不超过35℃；检测肠球菌对万古霉素的敏感性时，必须延长培养时间至24h。

纸片扩散法三、稀释法（一）肉汤稀释法有宏量稀释法和微量稀释法原理：以M-H液体培养基将抗菌药物做不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度(MBC)。MIC：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。单位：μg/ml

或U/mlMBC：抗菌药物能够杀灭99.9%接种菌所需要的最低浓度1.

培养基离子校正M-H肉汤（CAMHB）：Ca2+、Mg2+2.

药物稀释（1）配制抗菌药物原液：

1000

μg/ml重量（mg）=溶剂（ml）×浓度（μg/ml）/药物效价（μg/mg）体积（ml）=重量（mg）×药物效价（μg/mg）/

浓度（μg/ml）稀释法例：需配制100ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg，需要精确称取抗生素粉剂的量为多少？重量=100×1280÷750=170.7mg（2）稀释抗菌药物的制备抗菌药物终含量：128、64、32……0.25μg/ml原液10倍稀释备用稀释法3.菌液菌液的准备：0.5麦氏比浊标准（同纸片法）最终菌液浓度：5×105CFU/ml稀释法4.实验方法1）抗菌药物稀释：取试管10支，另取3支标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”、“质控菌生长对照”。除第1管外每管加肉汤2ml，1、2号管加待测最高浓度药液（128μg/mg

）2ml，依次对倍稀释至10管。2）测试菌的准备：0.5麦氏比浊标准，10倍稀释3）接种细菌：取0.1ml待测菌依次由低浓度到高浓度加到10支管中。4）孵育：35℃孵育16~18h稀释法

5.

结果判读以肉眼观察无菌生长管为最低抑菌浓度（MIC）结果报告：MIC（μg/ml）稀释法6.质量控制（1）细菌终浓度：5×105CFU/ml（2）基础培养基：离子校正的MH肉汤苛养菌：加入必要的补充物质（3）质控菌株：同纸片法稀释法微量稀释法（二）琼脂稀释法

原理将待测菌接种于含不同浓度的抗菌药物的琼脂平板上。经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。优点比液体稀释法重复性好每个平板同时可测定多株细菌可观察被检菌集落生长良好与否可发现污染菌落1.培养基：M-H琼脂2.含药琼脂的制备配制抗菌药物原液稀释抗菌药物加到融化MH琼脂中贮存日期：5天接种菌液的准备0.5麦氏标准，10倍稀释琼脂稀释法3.

细菌接种（1）画格编号（2）点种待测菌：1~3μl/格直径5-8mm

（104CFU/点）（3）培养18~24h观察结果琼脂稀释法4.结果判读先读质控平板的MIC，再读待检菌平板的MIC；在前后二个不同梯度浓度的抗生素M-H琼脂平板上，细菌生长数量由80%~90%突然减少为结果终点，即MIC值。结果报告：MIC（μg/ml）或敏感（S）、中介(I)、耐药(R)琼脂稀释法四、E试验结合了稀释法和扩散法的原理和特点操作简便同扩散法可以直接定量出测试药物对测试菌的MIC（一）原理

E试条是一条5mm×50mm，内含有一系列预先制备的、浓度呈连续指数增长稀释抗生素。将E试条放在接种细菌的平板上，孵育过夜，出现椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑菌浓度（IC）。（二）培养基

M-H琼脂（三）细菌接种和加样1.接种菌准备、平板接种：同扩散法2.用E试验加样器或镊子将试条放在接种细菌的平板表面，试条刻度面朝上。150mm平板：可放6条90mm平板：1~2条E试验（四）结果判断和报告读取椭圆环和E试条交界点的IC值1.试条两侧的抑菌圈与试条相交在同一点，读取相交处的刻度数值。2.试条两侧的抑菌圈与试条相交处位于试条上所示上下两刻度之间时，读取较高的刻度值。E试验3.试条两侧的抑菌圈与试条相交处不一致时，读取刻度值较高的一侧所示的读数。4.沿试条边缘生长的纤细菌线可忽略不计。5.在椭圆形抑菌圈与试条相交处或圈内有小菌落或大菌落时，应读生长被完全抑制的部分与试条相交处的读数。E试验五、联合药物敏感试验（一）联合