高三生物学一轮复习微专题课件RT－PCR反向PCR与PCR定点诱变技术

SHENGWUXUERT－PCR、反向PCR与PCR定点诱变技术热点1

RT－PCR与反向PCR(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。注：F1～F3，R1～R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是___________________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是___________________________________________________。水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA(2)本操作中获取目的基因的方法是_______________和_____________。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是_________________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是_____________________________。PCR技术扩增人工合成RNA聚合酶识别并结合的部位提高目的基因的转录效率(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。HygBRF3R2(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达C.将1～1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列D.用1～1362合成基因序列和1363～1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白D情境素材反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。(1)要扩增未知序列，应选择哪两种引物？引物1和引物4。(2)上述PCR产物是环状DNA分子还是链状DNA分子？链状DNA分子。(3)上述PCR过程中使用了哪些酶？限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶。1.RT－PCR：即逆转录PCR，是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。命题要点提醒：由于RNA不稳定，因此PCR不能直接扩增RNA；需要先将RNA逆转录得到cDNA，再进行PCR扩增。2.反向PCR：反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间的DNA片段。 (1)原理 ①酶切：选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切； ②连接：用DNA连接酶使靶序列环化连接； ③扩增：用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外的未知序列。(2)应用通过反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。命题要点提醒：①选择限制酶时，要保证其在已知序列内部没有限制酶切割位点；②选择引物时，要选择反向引物对(相对于已知序列)；若选择的是相向引物对，则扩增的是已知序列。(2025·广东江门期中)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(

)DA.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列B.PCR技术的操作步骤依次是高温变性、低温复性、中温延伸C.图中引物应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对D.PCR扩增时，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状热点2

PCR定点诱变技术(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。(1)限制酶切割的化学键是_______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________________________________________________。磷酸二酯键保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是____________。C—G、U—A、A—T菌株B2的基因组DNA无PCR产物(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_____________________________________________________________________(答出2点即可)。无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等情境素材一在基因工程实践中，常用重叠延伸PCR技术。(1)操作中哪些引物应含有拟突变位点？引物2和引物3。(2)进行PCR1和PCR2时，应分别选择哪些引物？进行PCR1时需选择引物1和引物2，进行PCR2时需选择引物3和引物4。(3)为获得大量目的基因序列，进行PCR3时应选择哪两种引物？引物1和引物4。情境素材二瑞典科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变。基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。(1)第一轮PCR所用的引物有哪些？诱变引物和侧翼引物。(2)第二轮PCR所用的引物除了侧翼引物外，还有大引物。该大引物是第一次PCR扩增产物中的①链还是②链？②链。(3)与常规引物相比，大引物有何特点？大引物特异性高。1.利用引物中引入突变位点——在目的基因一端引入突变位点(1)两个引物均从内部扩增，在某一引物引入突变位点提醒若两个引物均从内部扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第3次扩增后才可获得双链等长的DNA片段，第n轮扩增后可获得2n－2n个突变DNA。(2)一个引物从内部扩增，另一个引物从侧翼扩增，在某一引物引入突变位点提醒若一个引物从内部扩增，另一个引物从侧翼扩增，其中一个引物引入突变位点，则至少第2次扩增可获得双链等长的DNA片段，第n轮扩增后可获得2n－(n＋1)个突变DNA。2.利用重叠延伸PCR技术引入突变位点——在目的基因内部引入突变位点

重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如下图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和引物2，引物3和引物4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可检验定点突变是否成功。3.利用大引物PCR技术引入突变位点——在目的基因内部引入突变位点

大引物PCR需要用引物进行两次PCR，其操作步骤如下：①根据目的基因序列设计引物，得到两个常规引物，分别为常规上游引物和常规下游引物；②根据突变碱基所处序列设计突变上游引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；③由突变上游引物与常规下游引物进行第一次PCR反应得到下游大引物；④用得到的下游大引物和另一个常规上游引物进行第二次PCR扩增，得到突变目的基因序列。1.(2025·广东佛山质检)PCR定点突变技术是一种基因工程技术，它可以通过人工合成的引物，使目标DNA序列发生特定的突变，从而实现对基因的精确编辑。PCR定点突变技术的过程如图所示(图中对应的字母为引物，黑点为定点诱变的位点)。下列叙述错误的是(

)BA.获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1B.获得片段2所需要的引物为R和F_m，且1次循环即得片段2C.图中两种引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对D.图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对2.(2024·长郡中学模拟)研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解塑料中聚乙烯(PE)的能力，并通过基因工程拼接黄粉虫肠道内菌株WZ降解塑料中聚氯乙烯(PVC)的胞外酶基因A，培育降解塑料的“超级菌”。请回答下列问题：(1)菌株的筛选。配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1mm厚度的PE塑料，分组实验，结果如表所示：从功能上讲，该培养基属于________培养基。培养基3中接种混合培养后的YP1，与单独培养并接种YP1比较，降解PE的能力____________，其原因可能是_________________________________________________________________________________。培养基及接种菌株培养基1培养基2培养基3单独培养并接种YT1单独培养并接种YP1混合培养YT1和YP1后，选取YP1接种降解圈直径R1/cm1.221.551.43菌落R2/cm0.350.550.43R1/R23.52.83.3选择增大/增强YP1和YT1混合培养过程中，YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因，发生了转化(2)培育“超级菌”。对菌株WZ的A基因测序可知，如果在其调节功能区增加一个碱基对A/T，则可以大大增强其基因表达能力。通过经典的大引物PCR定点诱变技术在体外改造A基因，操作过程如图1。改造A基因与图2所示的质粒构建表达载体，培育“超级菌”。①通过PCR1构建大引物：需要两步，先后使用的引物分别是__________________。PCR中引物的作用是__________________________________________________。②通过PCR2获得完整的改良的A基因。③构建改良基因表达载体：为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是__