医药领域的革命

医药领域的革命——

基因治疗卢大儒复旦大学遗传学研究所世界首富：比尔.盖茨预言：超过他的下一个世界首富必定出自基因领域。

基因是什么？基因是生命的密码基因记录和传递遗传信息基因决定生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象

UnitedGene

UnitedGene

基因是染色体上的一段DNA染色体基因1基因2基因与疾病

基因与人类的疾病密切相关,遗传病是由于基因先天缺陷所致;肿瘤的发生涉及多种基因改变,包括癌基因激活或抑癌基因失活;高血压,糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变;由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关,存在易感人群和耐受人群.基因是生物医药产业的源头基因基因诊断基因治疗反义RNA免疫学诊断基因工程药物化学合成药物设计的靶分子DNA疫苗或核酶等基因治疗-新的医学革命

*基因治疗是最彻底的治疗,分子外科。

*基因治疗是把药物工厂开到人体里去，在需要的时候就生产药物，不需要的时候自动关闭。

*基因药物是继公共卫生,麻醉术,抗菌素和疫苗以后的医药工业的第四次革命，它将成为医药工业的发展趋势。

基因治疗-新的医学革命

基本概念:将正常有功能的基因导入人体,以基因作为药物治疗疾病.与传统治疗区别:基因治疗的特异性:针对性强;药物本质为DNA;DNA在人体细胞内表达成为蛋白质;

**基因治疗作用的持续性.

基因治疗的基本原理基因治疗什么病?遗传病:基因先天缺陷,理论上疾病治疗的希望根本所在;如隐性单基因遗传病.肿瘤:为肿瘤治疗提供了一条新路,发展迅速,具有潜在的商业价值传染病:艾滋病,肝炎等疾病的治疗一种新的尝试.其他疾病:心脑血管疾病,神经系统退行性疾病,不妨一试,意外效果.基因治疗-从治疗到预防

基因治疗不仅可以用于疾病的治疗,还可以用于疾病的预防.

传染病的预防:基因免疫(DNA疫苗),肝炎,肺结核,腹泻,流感等;HIV预防

肿瘤预防:鼻咽癌,宫颈癌病毒导致肿瘤等;

肿瘤复发预防:各种基因转移肿瘤瘤苗免疫基因治疗--从治疗到提高

基因治疗不仅可以用于疾病的治疗和预防,还可以用于人类生活质量的提高和改善.1.肥胖,秃顶患者的福音2.长命百岁不再难求3.耳聪目明易如反掌4.性格重塑随心所欲问题焦点:基因治疗的伦理学的挑战基因治疗的限定范围

理论上,基因治疗可以从基因层次上彻底治疗遗传性疾病,改善人的体质.但是,目前基因治疗严格局限在体细胞,不允许对生殖细胞(卵细胞和精子)进行基因改造,即基因治疗限制在当代,而不能影响下一代.另外一方面,基因治疗在提高人的体质方面存在一定的争议,如给正常人进行增高的基因治疗,基因兴奋剂.基因治疗的策略

缺陷基因的修补:基因哪里坏了修补哪里,完美无缺,不留痕迹.

缺陷基因的补充:基因坏了,增加一条好的基因进行代偿.好比交通堵塞,另外开辟一条新路.

缺陷基因的关闭:抑制缺陷有害基因表达.如肿瘤基因,显性遗传病等.

全新基因导入:为了达到预防和治疗疾病的目的,将人体原本不存在的基因引入.

DNA片段:不是基因,不产生蛋白产物,但是可以抑制基因表达.反义ODN,反义RNA,核酶等.*基因调控治疗:根据基因代谢通路进行上中下调节.基因定点修复和基因替补基因治疗的途径1.exvivo

途径:将人体细胞从体内取出,基因改造,再移植到人体中.自体,同种异体,异种细胞,同种异体或异种组织和器官等.2.invivo

途径:直接将基因转移到人体中,如DNA注射,口服,喷雾等.有如普通治疗药物,商业化发展方向所在.基因治疗的exvivo

途径基因治疗就向打针和吃药一样.基因治疗的invivo

途径基因治疗的靶细胞/器官1.基因缺陷的细胞:如受体缺陷细胞,肿瘤细胞等,原位细胞.2.广泛的细胞类型:基因产物进入血液

干细胞:包括骨髓,脐血和外周血干细胞

皮肤:成纤维细胞,上皮细胞

血液:淋巴细胞

肌肉:成肌细胞和肌小管

肝脏:肝细胞

口腔:涎腺细胞基因治疗--三大要素1.基因转移系统2.基因表达调控3.治疗相关基因基因治疗的“枪炮”---基因转移系统1.物理方法:基因枪;基因针,基因缝线;DNA

直接注射;电穿孔,射频电穿孔超声导入.2.化学方法:磷酸钙;脂质体,多聚赖氨酸等3.生物方法:反转录病毒;腺病毒;腺相关病毒;单纯疱疹病毒;细小病毒;沙门氏细菌,厌氧细菌基因转移物理化学方法评价

物理化学方法用基因转移取得了长足的进步,效率不断提高,安全可靠,已经广泛用于临床试验,代表了基因治疗未来的发展方向.但是需解决以下问题:

1.基因转移的效率和稳定性;2.基因表达的持续性;3.基因转移的靶向性;

基因转移的生物学途径

人类设想基因转移最初从病毒感染人体而来,希望将有害的病毒进行改造,用目的基因替换有害基因为人类治病.病毒介导的基因转移是目前最为成熟的方法,面临最大的问题是安全性,尤其是长期安全性.不同的病毒载体需要解决不同的问题.主要包括:基因转移的效率,稳定性,遗传毒性,免疫反应,表达时间,转移的靶向性,目的基因的装载容量等.

RVAVAAVHSV基因组成ssRNAdsDNAssDNAdsDNA基因组长度10kb36kb5kb152kb装载容量<8kb8kb4.5kb30kb病毒滴度107

1011

108

108感染细胞谱窄宽宽窄感染能力中很强强强整合能力有无有无毒性作用遗传毒细胞毒遗传毒细胞毒免疫原性弱中等弱强基因治疗病毒载体比较反转录病毒载体(RV)

RV为单链RNA病毒. 1.Murineleukemiavirus,MLV结构:重组病毒制备原理:反式互补研究问题:安全性;滴度和感染效率;合适的靶细胞

安全性研究

1.辅助细胞的制备:多次同源重组PA317;PG132.反转录病毒载体:减少同源;起始码突变N2,LN系列;G1Na系列;3.具有复制能力的RCR的检测:S+/L-;补救分析;RT-PCR4.病毒的插入致癌作用:1.病毒滴度的提高:VSV-G蛋白包装;低温培养方法2.病毒的感染效率:磷酸钙沉淀;流动感染离心感染病毒的滴度和感染效率病毒感染的靶向性1.病毒感染靶向性原理:env膜蛋白嗜双性辅助细胞:PA3172.病毒的靶向性感染:膜蛋白的基因置换受体配体基因的置换抗原-抗体基因的置换优点:感染非分裂细胞的RV举例:HIV;SIV

RRE结构:LTR-gag-pol--env--LTR

TARtat,rev,tev应用:宿主广泛;干细胞,艾滋病基因治疗问题:安全性,需要多次同源重组

Lentivirus腺病毒载体双链DNA无包膜病毒.1.优点:易制备;高滴度;宿主广;高感染;低毒;安全;途径多,简便2.可能缺点:免疫原性;不整合3.第一代重组腺病毒293细胞:15%E1等AdDNA缺陷载体制备:E1缺陷;同源重组腺病毒载体基因治疗研究

1.遗传病基因治疗:CF;血友病B,A

局限性:短期表达;不能重复;炎症2.肿瘤基因治疗:免疫反应;短期表达广泛应用:多种基因,多种肿瘤IL-2;MHC;P53;P21;FasL;IGF-IHSV-TK,VEGF,Angiostatin

第二代腺病毒载体1.早期AVE1+E3区缺失的有限性2.E2,E4区的置换:Wilson报道:温度敏感E2突变AV降低免疫性,表达延长;未根本解决；制备293/E2A,293/E4细胞;相应载体;扩大容量;降低毒性和免疫性;效果有限;滴度下降.*293T细胞:转染SV40大T抗原降低腺病毒免疫原性

1.腺病毒载体插入B7反义基因,阻断共刺激途径;2.腺病毒载体插入ICAM-1反义基因,阻断粘附因子作用.3.腺病毒载体插入CTLA4基因,胞内结合B7.4.腺病毒载体插入MHC-I,II基因的调控基因反义片段.增强腺病毒的感染效率1.腺病毒与葡聚糖,聚凝胺,多聚赖氨酸,脂质体混合感染细胞,组织,提供感染效率10-100倍,降低炎症反应.2.重组腺病毒感染前,进行腺病毒封闭3.不同亚型腺病毒互换应用.辅助病毒策略1.野生Ad作为辅病毒替代293细胞优点:载体的容量扩大36kb缺点:病毒的纯化2.辅助病毒补充293细胞优点:载体的容量扩大缺点:混合病毒分离;

微小腺病毒载体1.原理:ITR和包装信号<1kb;不含有任何病毒蛋白基因,安全.辅助病毒+293细胞进行反式互补2.优点:包装容量36kb,无毒,无免疫性，表达时间长尚未完善:滴度;辅助病毒干扰利用Cre/loxP系统制备辅助病毒辅助病毒5‘’ITR下游包装信号区域以及结构基因区域分别引入loxP顺序.同时制备293/cre产病毒辅助细胞,诱导Cre表达,从而控制辅助病毒的产生.ITRloxPloxPITR

微小腺病毒制备方法1.直接构建30kb大小的质粒困难:30kb大小载体构建复杂2.同源重组制备微小腺病毒载体.

3.病毒载体首尾连接,重组载体5’3’

5’3’5’

微小腺病毒研究1.1996,Kochanek包装28kb的微小腺病毒2.1997,Alemany,包装容量研究,FVIII基因Baxter公司Dai,FVIII,血友病A小鼠研究3.1998,Schiedner包装AAT基因组DNA研究焦点:辅助病毒的设计:野生型E1缺失型包装缺陷型提高微小腺病毒的滴度:长度;顺式序列腺相关病毒(AAV)

结构:单链DNAITR-rep-cap-ITRAAV的优点:靶向整合,低免疫原性缺点:rep毒,制备困难容量有限应用:遗传病等基因治疗发展:解决rep,cap细胞系,AAV的大量制备;靶基因的拼接

rAAVProduction

PurificationGenetransfertoBHKcellsHelpervirusrHSVReleasevirus

单纯疱疹病毒(HSV)双链DNA有包膜病毒,包括:HSV-1,2,VZV,EB,CMV.主要以HSV-1型为主.

HSV载体含包装信号,复制位点等顺序结构,HSV病毒启动子,目的基因表达框架.由辅助病毒共转染补足细胞M64A,制备重组病毒.HSV重组病毒另一种形式是复制子,不含有任何病毒结构基因.

辅助病毒的改造:IE3温度敏感突变型;缺失突变型:IE3缺失;应用:感染心肌细胞,神经元,神经胶质细胞.VEGF---血管形成;脑肿瘤;帕金森病

HSV-AAV系统

利用HSV作为辅助病毒,包装制备AAV病毒,开创了一种从病毒到病毒的简便的技术路线.构建含有AAV-rep-cap基因的HSV载体,制备重组HSV病毒,感染带有AAV-载体的细胞,即可获得重组AAV病毒.微小AV-AAV系统利用同源重组制备微小腺病毒,去除所有腺病毒结构基因;利用AAV-ITR结构,促使微小腺病毒中AAV载体表达框架整合到宿主染色体中,长期表达.AdITRAAVITRAAVITRAdITR细小病毒系列载体1.H-1,MVM;LuIII等自主性细小病毒ssDNA,5kb,非结构蛋白NS1,2;结构蛋白Vp1,2野生型H-1对人特异性消化道肿瘤抑制生长;重组病毒:细胞因子基因替换VP基因,增强细胞杀伤作用.2.MVM,LuIII针对小鼠等肿瘤特异性作用痘苗病毒(VacciniaVirus)VV为双链DNA有包膜病毒,结构复杂,基因组200kb,可以插入25kb容量,主要用于制备重组疫苗,传染病及肿瘤免疫,也用于肿瘤基因治疗.VV载体通过目的基因置换,转染细胞,分离重组病毒.细胞毒作用强,短期表达.猴多空病毒(SimianVirus40)SV40病毒为双链DNA病毒,5kb,载体含有ori,包装信号,启动子,终止子等以及重组元件,SV40作为辅助病毒与载体共转染COS细胞.改进:SV40膜蛋白的细胞抽提物在细胞外自我组装成假病毒.优点:安全,发展为非病毒系统.包装效率有待提高,短期表达.应用:感染非分裂细胞,例如MDR基因转移造血干细胞(95%)

HBsAg免疫嵌合/杂合病毒(chimericorhybridvector)

1.AV/RV:1997,FengMZ等制备成两种AV/RV病毒,高效感染靶细胞,并且使之成为产病毒细胞体内产生RV.2.AV/AAV:1996,Fisher等将AAV载体插入到AV载体中,AAV-rep通过poly-lysine偶联,实现AV的整合感染.3.HSV/AAV:HSV为主体,AAV的整合4.HSV/EBV:利用EBV延长基因表达病毒联合运用(I)1.MoMLV/SIV:将SIV的env基因表达载体与MoMLV结构基因,载体,共转移293T细胞,制备假病毒,能够特异感染CD4+的淋巴细胞,并且表达目的基因.(GFP,lacZ)应用:HIV基因治疗,淋巴细胞为靶细胞的基因治疗,比lentivirus安全.MoMLV能够与HIV,VSV-G,流感病毒HA融合.

病毒联合运用(II)2.

AV转移RV受体到靶细胞上,再用RV感染,提高基因转移效率3.AV基因转移对肝脏细胞毒性作用基因,刺激肝细胞再生,增强RV的感染效率.4.AV基因转移原癌基因,刺激细胞增殖,RV感染,而后运用Cre/loxP系统去除原癌基因.5.不同种类AV联合运用,肿瘤基因治疗的协同作用;免疫抑制功能腺病毒与其他AV联合运用,降低免疫反应.病毒作为基因转移增强剂1.AV利用AV破坏核内体,逃避溶酶体降解DNA;hexon,fiber,pentonbase相关.因而,AV常与多聚赖氨酸偶联,提高效率1000倍.2.日本流感病毒(HVJ)与DNA混合,基因转移,逃避溶酶体降解,提高效率.3.多瘤病毒VP1包装DNA作为假病毒进入细胞,核仁,防止DNA降解.包装容量<5kb.非病毒基因转移系统1.病毒外壳蛋白包装DNA,形成假病毒.2.导向多肽,抗降解多肽和核定位多肽以及DNA,多聚赖氨酸,脂质体形成多元复合物(纳米颗粒),靶向转染.3.提高整合效率的思考?4.如何联合运用病毒/非病毒系统?基因治疗的“弹药”-----基因

基因治疗如同武器,基因转移方法是枪炮,而治疗所选用的基因就是弹药.基因来源于人类对疾病分子病理的认识,基因功能的研究.如:CFTR基因与CF基因治疗;基因治疗是人类基因组计划研究--功能基因组研究的最大受益者之一.人类基因组计划简介

人类基因组计划(HGP)是由美国科学家提出,1990年美国政府正式启动,总体计划在15年内投资30亿美元,进行人类全基因组30亿碱基对的排序分析.人类基因组计划得到了世界的广泛支持和行动,英国,法国,日本,德国和中国先后加入了人类基因组计划国际合作研究.人类基因组草图完成2000年6月26日,由美英日法德中六国参加的以及美国Celera公司独立开展的人类基因组计划取得重要进展,他们同时宣布绘制了人类基因组31亿碱基对中99%的草图,其中,美国完成54%,我国科技工作者完成了其中１％的测序任务，并按期完成了“工作框架图”。人类基因组草图的完成是人类科学发展史上一个里程碑.2001年2月<<Science>>和<<Nature>>杂志分别公布了人类基因组数据,为人类基因组研究提供了极大的方便.人类基因组研究的伟大意义1.揭开生命的奥秘,生命的本质,生命的起源和进化,生物的生长发育,人类的生老病死,思维的本质等.2.引起一场深远的医学革命,包括预防医学,诊断医学,治疗医学等,从根本上改变传统医学的观念,从治疗医学到预防医学.3.促进生命科学和其它科学的交叉,融合,诞生一批新兴的分支学科,吸引更多的优秀人才加入到生命科学的领域(Bio-X).4.极大推进生物技术的产业化进程,特别是生物医药产业的发展.人类基因组计划----生命解码第一步

人类基因组草图的绘制只是生命揭密的第一步,HGP已经由结构基因组向功能基因组转化.HGP人类基因组草图本身并不代表生物医药本身,而功能基因组的研究将为研究基因功能,生命奥秘,新药筛选,疾病治疗和预防,基因克隆,基因诊断和基因治疗,提高人体健康水平奠定基础.

基因治疗的调控组织特异启动子/增强子:根据要求在特定的细胞和组织中表达,达到治疗效果,降低副作用.如TK肿瘤基因治疗.IGF,MDR反义基因治疗等.可调控的启动子/增强子:根据需要,进行基因表达量的调控,如四环素调控子可以人为调控目的基因的表达,高血压,糖尿病和贫血的基因治疗需要解决调控问题.基因的删除调控:基因转移一定阶段后准确去除,如肝细胞转移原癌基因后删除.基因治疗研究历史回顾60年代Lederberg设想基因治疗遗传病1980年，美国Cline主持了β－地中海贫血的基因治疗,引发社会风波1980-1989年,美国Anderson为首的科学家争取社会和政府的支持理解，FDA和RAC制定了基因治疗审批管理方案1989年美国Rosenberg经FDA批准主持肿瘤患者标志基因转移临床试验.1990年,美国Culver/Blease主持世界首例ADA缺乏症基因治疗临床试验.基因治疗研究现状基因治疗从1989年进入临床试验以来,从相对禁锢到迅速发展,过热泛滥,反思降温,平稳发展,猛烈抨击,捷报频传等阶段,几经波折,充分体现了新生事物发展规律.但是,无论基因治疗发展坎坷如何,科学家坚信,基因治疗是一场医学革命,在21世纪将真正走向临床,为人类造福.

基因治疗临床试验方案国家/洲临床方案治疗患者非洲115美国3102389亚洲937澳大利亚313欧洲97727国际合作6314总计4253476

疾病名称临床方案%治疗患者%

癌症27965245970

传染病337.841212

单基因病55133069.0

基因标记409.42276.5

志愿者20.560.2

其它163.8661.9

总计4253476基因治疗载体临床方案患者数量

反转录病毒1601222反转录病毒细胞21420腺病毒86534腺相关病毒436单纯疱疹病毒10Lipofection69+2+1757+3裸DNA1671电穿孔220Poxvirus25130RNA130我国基因治疗方案基因治疗----单基因病

AATdeficiency;ADA-SCID

Canavandisease;Chronicgranulomatousdisease;CysticfibrosisFamilialhypercholesterolemia;Fanconi'sanemia;Gaucher'sdisease;HemophiliaBHunter'ssyndrome(typeII);Hurlersyndrome(typeI);LeukocyteAdherenceDeficiency;OTCdeficiencyPNP-deficiency,X-linkedSCID临床试验遗传病基因治疗基因治疗理论上是遗传病根治的希望所在,目前遗传病的基因治疗主要采取增加功能基因的策略;即缺少什么补充什么的策略.候选病种取决于功能基因及其生理生化特征,限制不少.遗传病缺陷基因的定点打靶置换取得突破.基因的调控表达治疗和反义治疗也在研究之中.遗传病基因治疗的两重性1.必要性:没有其他办法根治2.安全性:基因整合的遗传毒性;重复治疗的复杂性伴随终生的考验;

发展缓慢!!呼吁:科学价值>商业价值(ADA)社会价值>商业价值;宽松的环境基因治疗----肿瘤(I)Gynecologicaltumors:breast,ovary,cervixNervoussystemtumors:glioblastoma,leptomen-ingealcarcinomatosis,glioma,astrocytoma,neuroblastomaGenito-urinarytumors:prostate,renalcarcinomaSkintumors:melanoma,Gastrointestinaltumors:colon,colorectal,livermetastases,post-hepatitislivercancer,pancreaticcancer

临床试验基因治疗----肿瘤(II)HeadandnecktumorsLungtumors(adenocarcinoma,smallcellcancer,non-smallcellcancer)MesotheliomaHematologicalmalignancies(leukemias,lymphomas,GVHDriskafterABMTinleukemia,multiplemyeloma)

Sarcomas

Germcellcancers临床试验肿瘤基因治疗的策略1.免疫效应细胞(如淋巴细胞)免疫增强2.肿瘤细胞抗原性增强3.抗原提呈-免疫识别系统增强4.肿瘤自杀基因5.抑癌基因6.耐药基因7.反义基因8.血管生长抑制以上策略并不针对特种肿瘤肿瘤基因治疗的评价1.手术为主,早期诊断更为重要2.生物辅助治疗的一种,贵族治疗3.恶性肿瘤的转移和复发是重点4.肿瘤的复杂性---基因治疗的个性化5.肿瘤基因治疗的联合治疗5.潜在商业价值巨大6.风险性:死马当作活马医7.疗效评价的科学性:综合治疗;复杂肿瘤背景;易打擦边球基因治疗--其它疾病临床试验Infectiousdiseases:HIVinfectionOtherdiseases:Amyotrophiclateralsclerosis(ALS)CoronaryarterydiseaseCubitaltunnelsyndromePeripheralarterydiseaseRestenosisRheumatoidarthritisGenemarking:seediseasesabove艾滋病基因治疗(I)AIDS致病机制:

（1）病毒要向淋巴组织及外周血细胞播散；（2）病毒吸附于细胞受体，融合和遗传物质进入细胞；（3）病毒在细胞内复制；（4）CD4细胞功能和数目降低，CD8细胞功能丧失；（5）感染性病毒的释放和病毒感染的细胞数增加；(6）病毒复制的增强导致致病变株的出现；(7）CD4细胞数和功能的进一步降低；(8）艾滋病形成。艾滋病是由HIV引起的一个后天获得性遗传疾病，HIV携带者并不表现出艾滋病的症状，阻断携带向艾滋病发展是基因治疗的优势.艾滋病基因治疗(II)免疫疗法:HIV-env激活CTL.干扰素:IFN-a抑制HIV复制胞内免疫:显性负原理,突变的病毒基因,如VP16,P24,Rev.细胞受体:CCR5作为靶位抗HIV感染治疗病毒抗体:中和病毒及包装,如HIV结构蛋白的基因工程单链抗体.反义策略:潜力很大,包括反义RNA,ODN,反义DNA,核酶,反义诱导等联合治疗:HIV多变,鸡尾酒治疗奏效.心血管基因治疗

19个基因治疗方案,治疗人数超过300多人;临床治愈和缓解达60%,在整个基因治疗中,心血管基因治疗效果最佳.心血管基因治疗的病种以冠心病,心肌梗塞为主;其余依次为再狭窄,肢体缺血,先天性心脏病等.梗塞性血管病采用的基因有:VEGF,FGF,抑癌基因癌基因和细胞周期正调控基因的反义核苷酸;高血压基因治疗采用.基因治疗的基础研究基因治疗的临床试验以外,更多的是各种基因治疗基础研究.基因治疗临床取得成功的源头在基础研究.

1.基因治疗载体研究:理化方法;病毒载体,新型载体,杂合载体;BAC/MAC,载体的靶向性;载体调控表达,载体传送途径.2.基因治疗范围拓宽:功能基因组研究为基因治疗病种的扩大提供了基础;为人类改造自我提供了更多的幻想空间.基因治疗糖尿病全世界糖尿病患者已超过1.2亿，糖尿病已成为仅次于心脑血管疾病和癌症的第三大死亡疾病的“甜蜜杀手”。我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，I型糖尿病患者终身需要使用胰岛素,约有1/2的II型糖尿病患者在发病3-5年后长期依赖胰岛素治疗。胰岛素对于胰岛素抵抗和高胰岛素血症患者也同样有效.胰岛素是治疗糖尿病的唯一直接降血糖药物.胰岛素属于外源性药物——对体内干扰大,半衰期短，容易降解，需要及时补充给药,尤其是正常生理状态的胰岛素需要伴随人体血糖的变化而变化,糖尿病患者随时需要注射胰岛素,一般需要每天注射四次,给患者带来了极大的不便,而且还不能完全避免高血糖引发的并发症,长效胰岛素在某种程度上有所进步,只能在特殊情况下使用,不能减少高血糖对身体的伤害.口服胰岛素,胰岛素喷雾剂,胰岛素泵,胰岛移植,胰腺移植等均存在种种不足……由于胰岛素的表达调控机制复杂,因此,糖尿病基因治疗进展缓慢,只是在最近1-2年得到了迅速发展,目前已经能够在小鼠身上取得成功,完全控制了糖尿病小鼠的高血糖症状.国内糖尿病基因治疗至今只有零星报道,而且治疗效果不甚理想.2000年美国爱尔伯特大学的AnhonyT.Cheung等人制备了K细胞特异表达胰岛素的转基因小鼠。注射β细胞特异毒剂STZ后，对照鼠7-10天内由于糖尿病而死亡，而转基因鼠直到3个月都没出现糖尿或高血糖，体重也没显著变化。

韩国Yonsei大学的LeeHC等人采用LPK启动子调控胰岛素类似物（SIA）表达.SIA通过AAV途径转入STZ诱发糖尿病大鼠或者自身免疫性糖尿病NOD小鼠体内，糖尿病鼠的症状明显好转，血糖浓度得到控制，并且SIA的表达受血糖浓度调控，葡萄糖耐受实验也获得了一致的结果,也没有发现明显的毒副作用.糖尿病基因治疗的热潮将要兴起,2001年美国基因治疗年会已经有20余篇论文摘要.

基因治疗身体创伤

基因治疗将来可能治疗运动员严重受伤的肌肉，骨折的大腿或膝盖。在动物实验中，基因治疗已成功的愈合了骨折的骨骼，而且使受伤的肌肉长得更加强壮。可以用来治疗目前技术无法治愈的严重受伤的关节和骨骼,韧带和肌腱,也有可能治疗如关节炎等关节疾病。这项研究人体实验已经处于早期阶段.转基因细胞移植和肌肉基因转移同样重要基因治疗肥胖

台湾中研院李英惠利用Ｃ／ＥＢＰ基因治疗来防止肥胖。可利用基因取代策略，把体内一个控制脂肪细胞发育因子取代成另一功能相似相互有别的因子,脂肪转变成高代谢活性的能量消耗,不影响人脂肪功能及正常代谢机能。这项基因治疗已在老鼠身上获得良好的效果，经过基因治疗者虽然美食保持苗条体型。该研究可望让人们吃得多、吃得好，不运动也不会增胖。其它治疗肥胖的策略:PCG-1,瘦素基因,能量代谢开关,脂肪吸收基因反义抑制,线粒体解偶联蛋白基因等.基因治疗口腔感染

临床上口腔白色念株菌（简称“白念”）感染日趋常见。且由于耐药性，治疗很困难。由涎腺合成并分泌至人唾液中一种富组多肽具有明显抗真菌功能，且对耐药株有效。“白念”患者的该多肽浓度低下的。AdcMVH3体外实验杀死病菌显著有效.大鼠体内实验表明，经颌下腺富组蛋白基因转移，其合成蛋白多分泌至唾液，从而可用来治疗相关的口腔疾病。基因治疗侏儒症

Kagami证实用涎腺基因治疗其合成蛋白可投递到全身。将AdGH经尾静脉注入侏儒小鼠，血中生长激素升高，恢复到正常范围，侏儒小鼠生长发育明显改善，接近正常小鼠，对照组侏儒小鼠体重仅为治疗组的十分之一。动物实验已见很好的苗头。GH的治疗有无副作用?基因治疗肌肉老化美国宾夕法尼亚州大学成功发明新的基因治疗法，能够防止老鼠的肌肉老化,使肌肉不致因年纪而失去力量和萎缩。人类到了五十岁以後，肌肉的功能会每十年退化10%,IGF-I蛋白质刺激肌肉生长，补充已损坏的肌肉细胞；利用基因治疗，使肌肉继续制造IGF-I蛋白质,实验证实，老鼠经过基因治疗後，肌肉的功能增加百分之27%.研究中的基因治疗用于美容:SOD,EGF,VEGF可望消除疤痕,延缓皮肤衰老；

用于减肥:瘦素基因,能量代谢基因；治疗秃顶、促进毛囊增生;毛囊移植减少排异;“染”发:酪氨酸酶将白发变黑；延缓女性衰老,增加卵泡数、治疗不孕；通过激素调节基因可望实现；研究中的基因治疗治疗肌肉老化；器官移植(骨髓,肝脏和肾脏)治疗糖尿病；难点和兴奋点治疗心梗；促进骨折愈合；促进中风恢复；缓解疼痛；治疗肝硬化；治疗周围神经损伤；治疗肢体缺血；治疗心率失常等。基因治疗与基因兴奋剂基因治疗成功范例(I)

ADA缺乏症基因治疗:ADA缺乏导致严重联合免疫缺乏症,没有免疫能力.1990年9月,一位四岁的ADA缺乏症女孩接受了首例基因治疗,患者注入10亿个遗传修饰的T淋巴细胞,约每月1次,连续1年,ADA水平从1%上升到20%,淋巴细胞数量正常,免疫功能正常,1991年另一位9岁患者基因治疗也取得成功,他们从隔离病房走向了美好生活.美国,意大利,荷兰和日本等国先后开展了该病临床试验.世界首例基因治疗患者基因治疗成功范例(II)血友病B基因治疗:血友病是一种由于人凝血因子缺陷导致的遗传性出血疾病.1991年,复旦大学遗传学研究所采用反转录病毒介导的自体皮肤成纤维细胞对2例血友病B患者进行了世界首次血友病基因治疗临床试验,患者体内凝血因子浓度和活性上升,出血症状减轻,取得了安全有限的结果.1999年美国UP和Avigen公司合作采用AAV途径进行了血友病B基因治疗,患者治疗后出血症状显著改善.基因治疗成功范例(III)AdP53基因治疗肿瘤:P53基因突变与肿瘤发生发展高度相关(>50%),将正常P53基因导入肿瘤细胞,可以诱发肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无害.1995年进入临床试验以来,已经有600多名患者接受治疗,60%患者显示出安全有效,1999年进入临床III期试验,腺病毒P53基因治疗临床方案已经超过8个,而且治疗肿瘤范围扩大到其它肿瘤和转移癌.该方案可望获得世界上第一个基因治疗临床药证.我国该项基因治疗进入临床II期试验.肿瘤特异增殖性病毒治疗肿瘤美国ONXY公司采用E1B和E1A共同缺陷的腺病毒(ONXY-015)与化疗相结合,治疗30例难治性头颈部肿瘤,其中8例完全缓解,总有效率63%,该项研究被认为是第一个在肿瘤内选择性复制并将肿瘤杀灭的良好方案,现在也进入了临床III期试验.目前,科学家期望通过该病毒结合其他治疗基因,提高病毒的肿瘤杀伤活性.基因治疗成功范例(IV)HSV-TK自杀基因治疗:利用肿瘤细胞对HSV-TK基因/GCV的敏感性而自杀,并具备广泛的旁观者效应.这方面的基因治疗脑肿瘤开展较早,先后多种策略进入临床试验,取得了一定的疗效,并进入了临床III期试验.但是,由于RV的转移效率,GCV毒副作用等原因,推广有一定的困难.我国首例肿瘤基因治疗也采用此方法.基因治疗成功范例(IV)心血管基因治疗:VEGF165对于血管的生成具有重要作用,而一些心脑血管疾病由于血管堵塞,狭窄导致,可以采用该策略进行血管再生,旁路再通,使病人免受开刀搭桥之苦.美国已经有19项方案进入临床试验,300多人接受临床试验,60%的患者新血管生长、心肌血流灌注和室壁功能改善，大多数病人的心绞痛减轻。该项研究具有立竿见影的惊人效果,商业价值巨大,被称为21世纪初最激动人心和快速发展的进展之一。我国这方面的研究进入临床试验阶段.

基因治疗的完全成功范例

法国科学家采用反转录病毒途径,以CD34+骨髓造血干细胞为靶细胞,对两例重症联合免疫缺乏症婴儿成功实施转移IL-2受体基因的基因治疗,患儿不再服用任何药物就从隔离病房走向正常生活,机体免疫功能完全恢复,能够抵抗外界的各种病毒,细菌等病原体的感染.科学家称这是基因治疗取得完全成功的第一个报道.

不幸的悲剧!基因治疗一人死亡:1999年10月美国宾州大学JMWilson在开展腺病毒OTC基因治疗肝脏遗传病时,一位亚利桑那州的十八岁的青年Gelsinger接受了高剂量治疗后死亡.

FDA调查:18点问题,知情同意,及时汇报;草率!.FDA终止试验.媒体社会群起攻之;科学家保持沉默,内心呼吁理解.基因治疗前景?基因治疗是不是一场梦?基因治疗莫忘规则!Gelsinger死后:美国专家委员会要求所有的基因治疗负面事件报告给NIH。RAC则要求建立公报基因治疗相关病或死亡的制度。1999年:970例负面报告(85严重)2000年464例负面报告(1-3月)(43严重),除宾大外,佛罗里达州的一例死亡可能是基因治疗所致,计死亡6人。至少另两个基因治疗中心已被关闭).JeremyRifkin呼吁:暂停基治疗。未及时汇报和公布原因:隐私和行业秘密我国的基因治疗研究(I)国家“863”高技术计划自1987年起资助遗传病基因治疗;“八五”“.九五”设重大,重点项目资助,国家自然科学基金也给予了面上及重点资助.中国基因治疗也跟随美国几经波折.1.复旦大学的血友病基因治疗中国第一,世界第二

脑肿瘤基因治疗:国际先进我国的基因治疗研究(II)2.上海肿瘤所---脑肿瘤/肝癌基因治疗HSV-TK脑肿瘤基因治疗临床试验肝癌靶向基因治疗申报临床3.第二军医大学:肿瘤免疫基因治疗细胞因子;DC细胞4.上海第二医科大学基因治疗中心同种异体瘤苗;细胞因子,免疫增强,血管生成及抑制;自杀基因,血友病A我国的基因治疗研究(III)中科院上海生化所:帕金森等神经系统基因治疗,TK,GDNF,脂质体,微囊移植上海儿童医院:地中海贫血反义及药物调控基因治疗北京中国医科院基础所:地中海贫血基因治疗:调控表达;转基因动物北京医科大学:心脑血管基因治疗北京中国预防医科院病毒所:新型病毒载体:AAV大规模扩增系统北京中国医科院肿瘤所:肿瘤基因治疗基因治疗的产业化基因治疗是一个涉及到基础研究与临床应用的跨学科工程。目前，多数临床试验项目都是由多家单位或企业合作进行的。不仅有基础与临床的合作，同时也有科研机构与企业的合作。多数用于临床试验的载体是由基础部门开发，然后由企业进行生产、制备后提供给临床的。从而使得基因治疗越来越接近或符合传统药物的生产制备与应用程序。因此，也更趋于科学与合理基因治疗的产业化世界上几家大的国际性制药公司都早已成立了基因治疗开发部，拆巨资投入基因治疗研究。如，BiogenInc.曾拆资3800万美元投入GenovoInc.,SandozLtd曾拆资2900万美元投入GeneticTherapyInc.进行基因治疗研究。而Ciba-GeigyLtd将21亿资产的49.9％的股份投入ChironCorp，从事基因治疗的开发。还有，像AvigenInc.,CellGenesys,IntroGene,MediGene以及Transgene等公司都是从事基因治疗研究与开发的。基因治疗公司简介AvigenInc.AAVsystemHemophiliaB,A,Gaucher,lungdisease,blooddisease.Parkin-sonsdisease($140millionNASDAQ$35.0)TransgenefivevectorsfourPII,cooperatedwithHGSI,Schering-PloughInc.CTL:AdIL-2,IFN-r,Verocells,Ag:MucIbreastcancer,etc.HPV16,AdCFTR,DMD,cardiovasculardisease,(NASDAQ&NouveauMarche)TranskaryoticTherapiesInc.Non-viralexvivogenetherapyproducts:GA-EPO;hemophilia,GH($400million)基因治疗公司简介IntroGeneadenoviralvectorandstemcells(Crucell)(Eruo50million)GeneTherapySystemsInc.DesignanddevelopsgenetherapyproductsQ-oneBiotechLtd.(UK)viralorplasmidforinvivoorexvivogenetherapyPI/IIVical:NakedDNAcompanyforcancer,DNAvaccinesandDNAproteindelivery.ChironCorp,CellGenesys,MediGene,Geneways,OxfordBioMedicaetc.中国基因治疗产业化我国基因治疗研究一直依赖于国家资助,强度小,缺乏放大转化机制,只停留在跟踪研究水平.上海肿瘤研究所与天津天狮集团(2300万)合作进行脑肿瘤基因治疗临床试验,目前,又获得了香港一公司的巨额投资.北京病毒所获得河南某企业5000万投资,成立本元正阳公司,开发新型病毒载体.上海第二军医大学获得华晨集团投资4000万元开展免疫基因治疗.中国基因治疗的产业化深圳赛百诺公司从海外引进技术,开展腺病毒P53基因治疗进入临床II期试验.上实联合投资海外学者进行腺病毒研究,治疗P53基因缺陷肿瘤,临床申报中.该项目比较有前景,国际上比较看好.第二军医大学东方肝胆医院获得香港一公司投资6000万元,用于鼻咽癌基因治疗临床研究.另外一些腺病毒基因治疗的肿瘤项目也在企业的资助下开展.珠海丽珠集团,华北制药,山东金泰等公司投资北京医科大学开展心脑血管疾病基因治疗.基因治疗面临的问题基因治疗临床试验效果需要进一步确认,无可争议的疗效太少.期望值和现实相差太大.在遗传病基因治疗中忽视科学价值和样板作用

基因转移效率低;基因表达水平低基因表达持续时间短;基因转移缺乏靶向性;基因表达缺乏调控性;基因治疗的操作复杂;基因治疗的安全性(包括免疫)缺乏足够的疾病治疗基因缺乏有效的动物模型.

我国基因治疗存在的问题1.大多重复国外同类实验，.2.缺乏创新性各自为政,规模小,资金投入有限,缺乏中心的辐射作用3.一哄而上,一哄而下,缺乏基因治疗正确认识.4.缺乏孵化和转化机制,更缺乏风险基金.5.基因治疗研究和相关研究如基因组学,病毒学,免疫学,转基因动物,临床医学的结合不够.6.初级人才流失,高级人才匮乏.7.重视商业价值,忽视科学价值和样板作用我国基因治疗在“十五”重点

突出重点,有所为,有所不为,强调原始创新,特别是创新性的平台技术,加强基础研究,避免单纯重复他人的技术.力争在以下几个方面重点突破.(1).基因治疗关键性技术平台(2).重要疾病临床试验.(3).新型核酸药物及疫苗研究基因治疗关键性新型技术平台1.靶向,高效的非病毒载体系统;2.新型病毒载体系统3.细胞选择性复制的病毒系统4.新型表达调控系统,低本底,低毒性,细胞选择高,调控性强.5.基因定点整合于定点纠错.6.治疗基因7.采用细胞工程技术研究特点细胞载体系统.基因治疗研究若干热点造血干细胞(HSC)是最为理想的靶细胞:HSC具有永生性的能力;HSC具有很强的增殖,分化和自我更新的能力(从1到10万);HSC产物直接进入血液;HSC从采集、分离、体外培养、扩增以及移植等技术路线已经成熟。HSC特征及其面临的问题HSC的获取，分离纯化；CD34+/38-;HSC培养和扩增:培养体系；短期培养；间质细胞共培养；探寻细胞分化抑制剂。*反转录病毒(RV)是HSC目前最为理想的基因转移系统。小鼠造血干细胞已经取得20－30％的高效转移；而人HSC基因转移效率低于1％原因：1.细胞表面反转录病毒受体数目差异；其次,5－Fu,Ara-C处理的区别。

提高RV对HSV的基因转移效率策略：刺激HSC增殖；提高RV受体表达；流动转导；纤维连接素(fibronection);GALV的env替换；*腺相关病毒(AAV)因为在遗传病基因治疗中的独特优势而倍受亲睐。AAV基因转移HSC效率较低(复杂的机制,共受体).AAV/SV40杂合病毒提高效率.其它病毒载体:

SV40病毒系统:高效感染HSC,最高达到90%,是其它病毒不能比拟.问题:整合?野毒污染.

慢病毒(lentivirus):艾滋病的元凶-HIVRV的特性+有效转染非分裂细胞;具有T细胞的靶向性;HSC导向外膜蛋白的替换问题:安全性

HSC基因治疗已经进入临床试验,取得成功,前景光明宫内基因治疗近年来发展起来的新型基因治疗策略，是对人类某些特殊疾病现行基因治疗弊端所作的策略和对策上的调整。