药学系倪敏53课件

2025/7/11生物药物分离纯化技术

药学系倪敏2025/7/12实验四

离子交换色谱法分离氨基酸2025/7/13一.实验目的1.学习采用离子交换色谱分离氨基酸的基本原理和方法。2.掌握离子交换色谱法的基本操作技术，包括树脂的装柱、加样、洗脱、检查等。2025/7/14二.实验原理色谱分离技术是利用不同组分在两相中的物理化学性质（吸附力、分子大小、分子亲和力、分配系数等）的不同，通过两相不断的相对运动，使各组分以不同的速率移动而将各组分分离的技术，是一类相关分离方法的总称。2025/7/15离子交换层析：分辨率高；工作容量大；容易操作。已成为分离纯化蛋白质、多肽、核酸以及大部分发酵产物的重要方法，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析。2025/7/16我国是氨基酸生产和消费大国，无论是在工业总产量还是年产值，都居于世界前列。氨基酸产品在我国国民经济发展中扮演着重要角色。观看视频1：离子交换的工作原理2025/7/17二.实验原理1.离子交换色谱离子交换色谱：分离过程是基于离子交换的原理而进行的。基于带相反电荷的分子的相互吸引，也就是异种电荷相互吸引、同种电荷相互排斥。2025/7/18按照带电荷的正负，离子交换层析一般可分为两种类型；一种是阳离子交换树脂，填料上结合有带负电荷的的基团，可以与溶液中带正电荷的样品结合；另一种是阴离子交换色谱，填料上结合带正电荷的基团，可以与溶液中带负电荷的样品结合。2025/7/19阳离子交换柱填料2025/7/1102.氨基酸的理化性质离子交换色谱是利用样品的带电性质进行的分离。氨基酸是一种兼性离子，在溶液中既可以带正电荷，又可以带负电荷。2025/7/111氨基酸包含一个氨基，可以作为氢离子的受体，这时氨基酸成为阳离子。氨基酸又带有一个羧基，可以作为氢离子的供体，这时氨基酸成为阴离子。等电点的概念，也就是氨基酸所带净电荷为0的状态。在pH小于等电点时，氨基酸带正电荷；当pH大于等电点时，氨基酸带负电荷。提问：一蛋白质水解产物在pH6用阳离子交换柱层析时，第一个被洗脱下来的氨基酸为？

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应该是哪个？怎么看这种问题啊？

2025/7/1133.如何利用离子交换色谱分离两种不同的氨基酸“同种电荷相斥、异种电荷相吸”，不同的氨基酸具有不同的等电点，它们在溶液中可能携带相反电荷。将溶液调到一特定pH值，让一种氨基酸携带正电荷，使之与离子交换柱结合；同时，让另一种氨基酸携带负电荷，使之保留在溶液中。2025/7/114分离天冬氨酸与赖氨酸的实验：由于天冬氨酸的等电点为2.97，赖氨酸的等电点是9.74。存在三种情况1）pH<2.97,天冬氨酸和赖氨酸都带正电荷2）2.97<pH<9.74，天冬氨酸带负电荷，赖氨酸带正电荷3）pH>9.74，天冬氨酸和赖氨酸都带负电荷2025/7/115本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸AsppI=2.97）和碱性氨基酸(赖氨酸LyspI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，由于pH低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子，吸附在树脂上；又由于pH高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在pH12条件下，因pH高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。实验方案2025/7/116提问：如果采用阴离子交换树脂，实验方案又有什么变化呢？2025/7/117提问：如果采用阴离子交换树脂，实验方案又有什么变化呢？存在三种情况，又如何选择呢？1）pH<2.97,天冬氨酸和赖氨酸都带正电荷2）2.97<pH<9.74，天冬氨酸带负电荷，赖氨酸带正电荷3）pH>9.74，天冬氨酸和赖氨酸都带负电荷2025/7/1184.茚三酮反应机理

在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。该反应颜色产物在570nm处有最大吸收峰。2025/7/119三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：层析柱（20cmX1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管、玻璃棒、烧杯2025/7/120梯度混合器2025/7/121三、实验仪器、材料和试剂2.材料A．735型阳离子交换树脂B．混合氢基酸样品溶液：谷氨酸、脯氨酸均配制成2mg／mL的溶液。将上述谷氨酸、脯氨酸溶液按1：1的比例混合E．洗脱液：0.01M盐酸F．茚三酮显色剂2025/7/122四、实验基本步骤1.平衡向层析柱加入纯化水（大约1L），直到流出液的pH至中性为止，用pH试纸检查。（洗柱速度可以快）2.上样降低液面至填料表面上方1厘米左右，加入200毫升氨基酸混合样品。（速度稍慢）：大约上样150毫升的时候，进行检测，看看有没有氨基酸，是不是饱和。调节速度，不要太快，若有饱和显色反应，停止进样。2025/7/123四、实验基本步骤3.洗脱先向层析柱加入纯化水，直至茚三酮显色阴性。再用0.01M的酸洗。4.洗脱液收集酸洗100毫升，开始调节低速，1滴/秒，大约3毫升/分，每隔15min停止，进行茚三酮检测。开始显色，谷氨酸（蓝色）记录此时的体积，每隔15min停止，进行茚三酮检测。蓝色消失（记录体积），脯氨酸（黄色）记录此时的体积，黄色消失（记录体积）。2025/7/124四、实验基本步骤5.绘制洗脱曲线6.再生色谱柱用蒸馏水洗至流出液为中性2025/7/125观看学生实验视频：离子交换色谱分离氨基酸提问：实验中注意事项2025/7/126五、注意事项1.柱子不能干。始终保持柱面上方有液体。2025/7/127五、注意事项2.加样2025/7/128五、注意事项3.液体流速与柱面上方液面高度有关，液面越高，流速越快。可以适当增高液面，加大流速，对结果没有影响，可以节省时间。4.实验时，建议大家分工合作，一组进行分离实验，一组进行后面的检测实验。