57　选择性必修3　第九单元　第48讲　微生物的培养技术及应用

第48讲微生物的培养技术及应用1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。考点1微生物的基本培养技术一、培养基的配制1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2．营养组成(1)一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等。(2)需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。微生物对培养基的需求乳酸杆菌添加维生素霉菌一般将培养基调至酸性细菌一般将培养基调至中性或弱碱性厌氧微生物提供无氧的条件3．种类(1)按物理性质分eq\b\lc\[\rc\(\a\vs4\al\co1(液体培养基：工业生产,固体培养基：微生物分离、鉴定、活菌计数))(2)按用途分eq\b\lc\[\rc\(\a\vs4\al\co1(选择培养基：富集、分离出特定的微生物,鉴别培养基：鉴别不同种类的微生物))1．(选择性必修3P10“旁栏思考”)培养基中加入氮源的原因是培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。二、无菌技术1．概念：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。2．关键：防止杂菌污染。3．目的：获得纯净的微生物培养物。4．消毒与灭菌的比较比较项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药物消毒法操作空间、操作者的衣物和手等紫外线消毒法接种室、接种箱或超净工作台灭菌强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子湿热灭菌法培养基、容器等干热灭菌法玻璃器皿、金属用具等灼烧灭菌法接种工具等5．其他操作(1)做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。(2)为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。2．(选择性必修3P10“相关信息”)利用某些微生物可以净化污水、污泥，原因是有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解。6．酵母菌的纯培养3．(选择性必修3P12“探究·实践”)倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)，防止培养基水分过快蒸发。1．在培养细菌时，要将培养基调至中性或弱酸性。(×)提示：在培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性。2．蛋白胨中含有糖、维生素和有机氮等营养物质。(√)3．玻璃器皿、金属用具等可以采用干热灭菌法。(√)4．微生物的纯培养步骤为配制培养基→接种→灭菌→分离和培养等。(×)提示：微生物的纯培养步骤为配制培养基→灭菌→接种→分离和培养等。5．待灭菌后的培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。(√6．酵母菌的纯培养的马铃薯葡萄糖培养基上的葡萄糖也可用蔗糖代替。(√)扩展青霉是腐烂苹果中常见的微生物之一，其次级代谢物棒曲霉素(Pat)是一种具有致突变作用的毒素。为研究腐烂苹果中Pat的分布，研究人员进行了如图所示的实验，其中“病健交界处”为腐烂部位与未腐烂部位的交界处，取样分离的5个部位分别为①号、②号、③号、④号、⑤号。研究人员测定了病斑直径为1、2、3cm的苹果中①～⑤号部位的Pat含量，请推测最可能的结果。病斑越大，相同部位的Pat含量越高；相同病斑情况下，离病斑越远的部位，Pat含量越低。无菌技术1．(2025·广东惠州模拟)微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。下列相关叙述正确的是()A．消毒和灭菌的杀菌程度存在差异B．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利C．微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物D．操作者要对操作的空间、自己的衣服和手进行灭菌A[消毒是用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物，而灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，故消毒和灭菌的杀菌程度存在差异，A正确；培养基中的营养物质浓度过高，微生物会通过渗透作用失水，对微生物的增殖不利，B错误；在微生物培养过程中，由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，C错误；操作者对自己的衣服和手进行的是消毒处理而非灭菌，D错误。]微生物的实验室培养2．(2025·广东汕头模拟)生食海鲜易引发副溶血性弧菌食物中毒。为开发天然抑菌剂，研究者先制备海鲜样液，在某培养基中划线接种得到该菌(图中蓝绿色菌落)。下列叙述正确的是()A．海鲜样液需多次稀释后才能划线接种B．划线接种时接种环使用前须进行消毒C．只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液D．结果显示单菌落太多不能达到纯培养目的C[平板划线接种时不需要稀释，A错误；划线接种时接种环使用前须进行灼烧灭菌，B错误；只有第一次划线前需要蘸取海鲜样液，后面每次划线都是从上一次划线的末端开始的，C正确；出现单菌落即达到了菌种纯化的目的，D错误。]3．下图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是()A．对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌处理B．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置C．步骤②的目的是使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落D．步骤③划线结束后在培养皿盖上做好标注C[对实验操作的空间、操作者的衣着和手需要进行消毒处理，A错误；倒完平板后立即盖上培养皿，冷却凝固后将平板倒过来放置，B错误；步骤②多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落，C正确；图中操作结束后需在培养基皿底标注菌种及接种日期等信息，而不是在皿盖上做标注，D错误。]平板划线操作中几次灼烧接种环的目的项目第一次划线前灼烧每次划线前灼烧划线结束后灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上一次划线的末端杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者考点2微生物的选择培养和计数一、选择培养基二、微生物的选择培养1．土壤取样铲取土样，将样品装入纸袋中。2．等比稀释将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。3．涂布平板4．培养观察(1)待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37(2)在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。1．(选择性必修3P18～19“探究·实践”)统计菌落种类和数目时要每隔24h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定。若培养时间不足或培养时间太长，分别会导致的结果是遗漏菌落的种类和数目、菌落粘连影响计数、培养基表面干燥脱水、微生物衰败，菌落特征不易观察。三、微生物的数量测定1．稀释涂布平板法(1)计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(2)计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。(3)计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，统计结果一般用菌落数表示。2．显微镜直接计数法(1)计数原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。(2)优点：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。2．(选择性必修3P18“相关信息”)血细胞计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；细菌计数板常用于相对较小的细菌等的计数。四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)选择培养基四种常见制备方法或实例①加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)②改变培养基的营养成分③利用培养基“特定化学成分”分离④通过某些“特殊环境”分离(2)两种纯化细菌的方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法纯化原理通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞主要步骤平板划线操作系列稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器平板示意图能否用于计数不能计数可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(×)提示：选择培养基可以筛选分离出某种微生物。2．脲酶催化尿素分解产生NH3。(√)3．对细菌进行计数时，可以用平板划线法。(×)提示：对细菌计数可以采用稀释涂布平板法或显微镜直接计数法。4．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)5．刚果红与纤维素形成红色复合物，可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌。(√)6．用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。(√)某小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容：在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，该实验的自变量为酶的种类。若要排除缓冲液可能具有的降解作用，在C处滴加缓冲液，三处滴加量相同，一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，则说明缓冲液不能降解W；若A处的透明圈直径大于B处，说明酶E降解W的能力大于天然酶；若A处透明圈直径小于B处，说明酶E降解W的能力小于天然酶；若A与B处透明圈直径大小相等，说明酶E降解W的能力与天然酶相当。微生物的选择培养1．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是()A．a点时取样、尿素氮源培养基B．b点时取样、角蛋白氮源培养基C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基D．c点时取样、角蛋白氮源培养基D[研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确，A、B、C错误。]微生物的分离和计数2．(2025·广东江门模拟)植酸酶能催化分解植酸磷，从而提高植物性饲料中磷的利用率。科研人员从土壤中分离出5种能够产生植酸酶的细菌菌株，分别为a、b、c、d和e。植酸磷被分解后培养基上会出现透明圈，分离的操作过程如图所示。下列相关叙述正确的是()A．可用干热灭菌法对土壤样品进行灭菌B．该实验采用了平板划线法进行接种和计数C．e细菌植酸酶的活性比a细菌植酸酶的高D．经过图示的操作，土壤样品被稀释了1×104倍C[干热灭菌法适用于能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿、金属用具等，土壤样品中含有各种微生物和有机物，不能用干热灭菌法进行灭菌，否则会破坏土壤中的微生物和有机物，A错误；平板划线法可以用于分离纯化微生物，但不能用于计数，用于计数的方法通常是稀释涂布平板法，该实验所用的接种方法是稀释涂布平板法，B错误；e细菌形成的透明圈比a细菌形成的透明圈大，说明e细菌分解植酸磷的能力更强，即e细菌植酸酶的活性比a细菌植酸酶的高，C正确；1g土壤添加到99mL无菌水中，稀释了100倍，以后每次稀释10倍，经过3次稀释，土壤样品被稀释了1×105倍，D错误。]3．(2022·广东卷)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学”号考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。回答下列问题：(1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是__________________________________________。(答一点即可)(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是__________________________________________________________________。(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有__________。解析：(1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析题图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。答案：(1)高压蒸汽灭菌平板划线纤维素(2)某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)(3)拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行(4)耐低温课时分层作业(四十八)1．在培养微生物时，确保无菌操作是非常重要的。下列说法正确的是()A．锥形瓶和培养皿等实验用具可进行干热灭菌B．培养基灭菌后调pH，确保微生物正常生长C．培养动物细胞时需添加血清，为保持血清活性不需要灭菌D．接种环和涂布器等可进行灼烧灭菌D[玻璃器皿如培养皿等需要保持干燥的实验用具可进行干热灭菌法进行灭菌，锥形瓶采用湿热灭菌法进行灭菌，A错误；培养基需要先调pH，再灭菌，B错误；培养动物细胞时需添加血清，为保持血清活性需要采用合适的灭菌方法，C错误；接种环和涂布器等接种工具可进行灼烧灭菌，D正确。]2．某研究小组的两位同学为研究手机表面和马桶按钮上的微生物，分别取样并进行了微生物培养实验，其过程和结果如下图所示。下列相关说法正确的是()A．为了防止杂菌污染，在实验前需要对培养皿、试管和菌悬液等进行灭菌B．若甲同学还分别检测了两物体表面的微生物数量，则检测值可能比实际值偏小C．图中的特殊处理是指将无菌棉插入蒸馏水中，多次换水并振荡D．造成甲、乙实验结果不同的原因可能是培养基不同或接种方法不同B[在实验前不能对菌悬液进行灭菌，A错误；甲和乙同学用的都是稀释涂布平板法，当两个或多个菌落长在一起时，只能观察到一个菌落，检测值可能比实际值偏小，B正确；制菌悬液时要用无菌水，C错误；两实验结果截然不同，可能是取样部位或取样时间不同，D错误。]3．热纤梭菌是一种能高效降解纤维素的嗜热厌氧细菌，可分泌一种多酶复合体将纤维素水解为可溶性糖，在农林废弃物的转化利用中具有应用价值。如图是筛选该菌的过程，下列相关叙述错误的是()A．从牛粪堆的深层取样比从表层取样更加合理B．甲、丙都是以纤维素为唯一碳源的选择培养基C．用平板乙统计菌落数可准确反映该菌的真实数量D．丙中纤维素的残留量可反映该菌降解纤维素的能力C[热纤梭菌是一种嗜热厌氧细菌，牛粪堆的深层比表层氧气含量更低，温度更高，更适合热纤梭菌生存，因此从牛粪堆的深层取样比从表层取样更加合理，A正确；图示是筛选能高效降解纤维素的嗜热厌氧细菌，因此甲、丙都是以纤维素为唯一碳源的选择培养基，B正确；据平板乙的菌落分布均匀可知，是利用稀释涂布平板法接种的菌种，由于当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只有一个菌落，因此用该方法统计的菌体数量会比活菌的实际数量少，C错误；热纤梭菌可分泌一种多酶复合体将纤维素水解为可溶性糖，因此丙中纤维素的残留量可反映该菌降解纤维素的能力，D正确。]4．(2025·广东茂名模拟)某科研小组欲分离及培养若干种微生物用来处理剩菜剩饭、骨头、菜根菜叶等湿垃圾。从土壤中筛选淀粉分解菌时，向培养基加碘液染色后，培养基上出现了A、B、C三种菌落，结果如图所示。下列叙述正确的是()A．可选择菌落B中的微生物用来处理菜根菜叶等湿垃圾B．实验结束后，合适的菌株被保存下来，其余的可以直接丢弃C．菌落A的出现说明培养基中混入了淀粉以外的其他碳源D．该实验用到的接种工具为涂布器，接种前应将其浸没在盛有酒精的烧杯中D[淀粉分解菌能将淀粉分解，在培养基上形成透明圈，透明圈直径和菌落直径的比值越大，说明淀粉分解菌分解淀粉的能力越强，菜根菜叶的主要成分不是淀粉，不宜选用淀粉分解菌来处理，A错误；实验结束后，合适的菌株被保存下来，其余的应经过灭菌处理后再丢弃，防止污染环境，B错误；菌落A的出现说明培养基中混入以空气中的二氧化碳为碳源的微生物，C错误；该实验用到的接种工具为涂布器，接种前应将其浸没在盛有酒精的烧杯中，涂布接种时，涂布器应从盛酒精的烧杯中取出，并将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃冷却后再使用，D正确。]5．下图为以苹果皮为材料分离纯化用于果醋制作的菌种，已知所用培养基为“米曲汁乙醇碳酸钙培养基”——米曲汁1000mL、CaCO310gA．图中器具、培养基都可用干热灭菌法灭菌B．②中的纯培养物来自苹果皮上的野生型酵母菌C．①扩大培养基中的菌种浓度约为8.1×109个/mLD．分离、计数的培养基需要用平板划线法且至少制备3个C[干热灭菌法适合用于耐高温和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等，培养基用湿热灭菌法，如高压蒸汽灭菌，A错误；图示过程为以苹果皮为材料分离、纯化用于果醋制作的菌种，②中的纯培养物来自苹果皮上的野生型醋酸菌，B错误；据最后三个培养皿的菌落数为75、80、88可知，其平均数为81，可求出菌种浓度为81÷0.1×107＝8.1×109个/mL，故①扩大培养基中的菌种浓度约为8.1×109个/mL，C正确；分离计数的培养基需要用稀释涂布平板法且至少制备3个，平板划线法只能纯化不能计数，D错误。]6．科研人员采用富集培养的方法从土壤中分离出能降解对羟基苯甲酸的微生物，实验过程如图所示。下列说法正确的是()A．富集培养基以对羟基苯甲酸为唯一碳源，不能进行高压蒸汽灭菌B．取少量样品重复培养的目的是使能降解对羟基苯甲酸的微生物比例增高C．在图中1、2试管中都有微生物生长，说明该富集培养得到了欲分离的微生物D．富集培养后通过平板划线法得到纯培养物B[富集培养基应以对羟基苯甲酸为唯一碳源，培养基要进行高压蒸汽灭菌，A错误；实验中取少量样品进行重复培养，其目的是使能降解对羟基苯甲酸的微生物比例增高，B正确；在图中1、2试管中都有微生物生长，说明通过富集培养分离获得的主要是分解对羟基苯甲酸的微生物，同时还有其他微生物，C错误；图示所采用的是稀释涂布平板法，使聚集在一起的细菌细胞分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便纯化菌种，得到纯培养物，D错误。]7．(2025·广东茂名模拟)科研人员从受四环素(TC)污染的猪场污泥中筛选四环素降解菌株MEH2305，为了进一步确定在TC降解中起主要作用的是MEH2305的细胞内液还是细胞外液，将MEH2305在液体培养基中培养，离心后，从菌悬液中提取细胞外液，然后将离心后的细菌细胞破碎制备细胞内液。将两种样品加入含10mg/LTC的100mL液体培养基中，避光振荡培养，定期测定残余TC的浓度。下列叙述错误的是()A．1～7d时，MEH2305降解组对TC的去除率高于对照组B．液体培养基需先进行高压蒸汽灭菌再调pHC．振荡可使菌体MEH2305与培养液充分接触D．MEH2305细胞内液比细胞外液能更好地降解TC，细胞内液中可能存在修复酶活性的机制B[由题图可知，横坐标是处理时间，1～7d时，MEH2305降解组(包括细胞内液和细胞外液，故应计算两者之和)对TC的去除率高于对照组，A正确；为避免杂菌污染，配制培养基应该先调pH再进行高压蒸汽灭菌，B错误；该培养过程所用培养基是液体培养基，振荡可使菌体MEH2305与培养液充分接触，C正确；据题图可知，与细胞外液相比，细胞内液的TC去除率更高，说明MEH2305细胞内液比细胞外液能更好地降解TC，据此推测细胞内液中可能存在修复酶活性的机制，D正确。]8．暹罗芽孢杆菌有望作为饲料发酵剂和添加剂应用于畜禽生产，以实现绿色健康养殖。(1)大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌(厌氧菌)，能引起家禽和家畜的肠道疾病，常使用氨苄青霉素治疗。为检测暹罗芽孢杆菌代谢物的抑菌能力，实验过程如图1所示。Ⅰ.请完善实验过程：①______；②______(填选项)a．37℃b．37℃c．37℃d．37℃e．上层清液f．下层沉淀Ⅱ.该抑菌实验还需要设计__________________________(填选项)作为对照。实验结果说明暹罗芽孢杆菌对三种病原菌有较好的抑菌活性，且不弱于氨苄青霉素。A．等量无菌水B．等量LB液体培养基C．等量FTG液体培养基D．等量含有氨苄青霉素的无菌水E．等量含有氨苄青霉