DNA片段的PCR扩增教案

通过“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”实验培养学生科学思维和探究能力一、使用教材及内容分析浙江科学技术出版社高中《生物学选修1生物技术实践》第四部分实验13《DNA片段的PCR扩增》，适用于高二年级。2017版《高中生物学课程标准》中，要求学生“阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤”。建议开展“利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定”的实验活动。本实验有助于学生理解PCR反应的原理，掌握PCR和琼脂糖凝胶电泳技术，认同现代生物技术的应用价值，培养学生运用数学方法探究生物学问题的能力，提高核心素养，因而是十分重要的内容。基于北京四中高中部的分子生物学实验室，拥有PCR仪、凝胶电泳成像等先进教学设备；且本校的学生学习能力较强、求知欲高,对现代生物学技术非常感兴趣，会以积极认真的态度参与实验过程。因此，我校开设本实验多年。二、实验器材PCR仪、琼脂糖凝胶电泳设备（含梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪电源）、微量移液器及枪头、微量离心管、培养皿、三角瓶、封口膜、橡皮筋、冰盒、记号笔、三脚架、微波炉或水浴锅（枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌）。材料：食用高活性干酵母（酿酒酵母）。PCR相关试剂（以下溶液在-20℃条件下冷冻保存，课前放于冰盒内或冰块上）市售10×扩增缓冲液(含Mg2+)、市售10mmol/L4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、市售2U/μLTaqDNA聚合酶、10μmol/L引物A溶液：序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、10μmol/L引物B溶液：序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’、无菌水。电泳相关试剂Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液：取20mL市售50×电泳缓冲液,加蒸馏水980mL、市售6×上样缓冲液（loadingbuffer）、市售DNA标准溶液（Marker）。染色相关试剂0.1%亚甲基蓝溶液（称取0.1g亚甲基蓝溶于100mL蒸馏水中，避免接触皮肤和眼睛,避光保存）、75%乙醇、藏于4℃冰箱的蒸馏水。或使用0.002%亚甲基蓝溶液（将2mL的0.1%亚甲基蓝溶液加入10mL电泳缓冲液中,再加88mL蒸馏水，避光保存）。其他资料准备：教师进行预实验，录制示范操作的特写视频并拍摄实验操作和结果的照片，编写并印发实验讲义。三、实验改进要点本实验选用的实验材料是市售的λ噬菌体DNA或大肠杆菌，前者较为昂贵，后者需进行培养。该实验流程约为3课时，其中的电泳和染色需安排2节课连堂，教师调课有困难。此外，课本对实验数据的处理没有具体要求，通过实验培养学生科学思维的预期目标也难以实现。针对以上问题，笔者在近年来的教学实践中逐步对该实验进行了些许探索：以易于取得和培养的酵母菌为实验材料，对其部分rDNA片段进行PCR扩增和凝胶电泳。缩短电泳及染色的时间，提供替换的染色方法，不仅能够节约1课时，还能获得理想的实验效果。进一步运用数学方法分析实验结果中蕴含的信息，实施STEM教学。将原本的验证性实验转化为探究性实验，从而培养学生的科学思维，达到预期教学效益。具体改进如下：表1实验改进前后对比表课本中实验操作尝试性实验探索PCR扩增λ噬菌体DNA片段或大肠杆菌的16SrDNA片段改进1:PCR扩增酵母细胞的核糖体DNA部分片段①以酵母菌为实验材料②采用新引物，扩增核糖体DNA部分片段③设计PCR反应体系④摸索PCR反应条件凝胶电泳电泳40min改进2:缩短凝胶电泳时间电泳25min染色①用10mL0.1%亚甲基蓝液覆盖凝胶表面15~20min；②加入5mL70%乙醇脱色1~2min；③加入冷水，几分钟后看到条带。改进3:优化染色方案方案1：①加入0.1%亚甲基蓝溶液没过凝胶约5mm，染色8min；②加入75%乙醇没过凝胶约5mm，脱色1~1.5min；③加入冷蒸馏水脱色方案2：倒入0.002%亚甲基蓝溶液没过凝胶约5mm，4℃冷藏过夜。实验结果观察DNA条带的位置和宽度改进4：运用数学方法深入分析实验结果中蕴含的信息①用直尺测量并记录每个DNA条带迁移距离②借助半对数坐标纸探究DNA片段长度与迁移距离的关系，估计PCR产物大小③使用条带更多的Marker验证上述实验结果④运用Excel绘制半对数曲线图精确计算PCR产物大小并验证DNA片段长度与迁移距离的关系以上4项创新在教学过程中的具体应用，以★在后文标出。四、实验原理聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction），简称为PCR技术，是一种体外扩增特定基因或DNA序列的技术，经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤，可获得大量的目的基因或DNA片段，广泛应用于医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程，是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。本实验以琼脂糖凝胶为介质进行电泳。核酸是带有负电的生物大分子，在电场作用下会向正电极迁移。在电场强度一定时，核酸分子越大迁移速率越慢。DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。亚甲基蓝（又名“亚甲蓝”）可以将无色的DNA染成蓝色，且基本无毒。通过使用亚甲基蓝对琼脂糖凝胶进行染色，再用75%的乙醇和蒸馏水进行脱色，就可以观察到琼脂糖凝胶中DNA条带的具体位置。五、实验教学目标（一）知识与技能：简述PCR反应、凝胶电泳鉴定的原理与应用。尝试独立完成运用PCR技术扩增DNA片段并用琼脂糖凝胶电泳进行检测的基本操作。（二）过程与方法：运用已学的生物学知识，结合科学史材料，推理PCR实验原理；独立操作实验并运用绘图、建模、软件分析等数学方法深入分析实验结果，培养学生的科学思维和探究能力。（三）情感、态度、价值观：认同由揭示科学概念到技术应用，是很多科学家艰苦努力工作的结果；认同现代生物技术的应用价值。六、实验教学内容本实验的教学内容主要包括实验原理的解析、实验操作的组织和实验结果分析。实验原理主要包括PCR反应原理、电泳和染色原理。实验操作涵盖了PCR扩增（实验材料的准备、配制反应体系、PCR扩增）、电泳（制备凝胶、制备样品、加样、跑电泳）、染色（亚甲基蓝染色、脱色）的操作。实验分析包括实验现象的观察与交流，运用数学方法深入分析实验结果中蕴含的信息（测量DNA条带迁移距离，绘图探究DNA片段长度与迁移距离的关系并据此推测PCR产物长度，使用不同Marker相互验证，运用Excel绘图精确计算并验证）。从而将STEM（科学、技术、工程和数学）教育与学科教学融合，引导学生解决来自社会、生产和生活的生物学问题。七、实验教学过程本实验安排２课时，非连堂。第1课时，课前指导学生课前准备实验材料，课上解析实验原理，组织PCR实验操作。第2课时，课前指导学生制备凝胶，课上组织凝胶电泳和染色的操作，在等待的时间穿插进行实验结果观察和分析的教学。图1教学流程图（图中斜体字代表实验创新的地方）（一）解析实验原理1.引导学生类比分析PCR反应原理，并介绍其应用聚合酶链反应(PCR)概念教学过程设计和教学模式选择的思路大体如下：图2PCR概念的教学过程和模式图解组织的学生活动如下：①展示犯罪现场的图片，一把匕首上的血迹中DNA含量很少，不够进行检验。引导学生思考如何获得大量的DNA样品呢？导入核心概念：体外DNA复制——PCR。②教师出示体内DNA复制的图片，促使学生在回忆细胞内DNA复制条件的基础上，类比推断体外DNA复制所需的条件——模板、原料、能量、酶和引物等，进而教师加以认定并以表格形式落实板书如下（括号中的内容在后续的课堂教学中逐步进行完善）表2体内复制与体外复制条件对比表体内DNA复制体外DNA复制模板DNA分子√原料dNTP√酶解旋酶×聚合酶√（Taq酶）连接酶×引发酶×引物RNA引物√（DNA引物）③引导学生从科技史料中体验PCR技术发展过程。⑴1957年科恩伯格因发现并提取大肠杆菌DNA聚合酶（最适温度为37℃）时，曾探讨用此酶在体外进行DNA复制的可能性，因此获1959年诺贝尔医学或生理学奖。⑵1968年科拉纳因破译遗传密码而获诺贝尔生理学和医学奖，期间引导学生体外合成短链DNA（引物）技术，1971年其实验室研究员提出PCR技术的基本原理。④简略介绍穆利斯的生平。展示让穆利斯得到灵感的夜间高速公路的照片，并描述当时情景：1983年的一个夜晚，穆利斯开车回家，加州公路上两排路灯和相对行使的车辆让他感到似曾相识。然后，启发学生结合DNA复制方式与公路上下车道上车辆相对行驶的情景进行联想：⑴两排路灯犹如DNA的双链；⑵反向行驶车辆像是DNA聚合酶，面对面地合成着单链DNA；⑶公路两端在绿灯处起步的两辆车恰似两个引物。在学生联想和小组讨论的基础上，教师绘制板图向学生介绍穆利斯最初的PCR设想，以及简要介绍兰德尔•才木，亨利•••厄利克，史蒂文•沙夫等人为PCR技术日趋成熟的贡献。⑤先引导学生思考：高温使DNA双链分开时，会破坏那种生物大分子？带领学生分析出：从大肠杆菌中提取的DNA聚合酶在高温下易失活，使得DNA每次复制都需要加入新酶。结果不仅操作复杂，而且价格非常昂贵。然后，教师展示黄石热泉生态系统图并讲述Taq酶发现史：⑴1969年美国微生物学家托马斯•布洛克就在黄石公园发现了生长于70-75℃的水生嗜热菌。⑵1976，华裔女科学家钱嘉韵从ThermusAquaticus成功分离出嗜热DNA聚合酶。这种酶被命名为TaqDNA聚合酶,最适温度为72℃。⑶1985年成功纯化后，开始应用于PCR。因其耐热性强，特异性高，扩增片段长，使得PCR技术具有真正的实践意义，标志着PCR技术的成功。⑥启发学生根据PCR技术史话，猜想PCR反应过程的大体步骤，设定每步反应的温度。播放《PCR原理》录像，或者教师可结合向学生阐述PCR技术原理的基本要点。最后，师生共同以板书形式概括PCR技术原理。⑦教师介绍PCR在法医、亲子鉴定、分析远古DNA、医疗上的应用。使学生理解PCR定向扩增功能，为进一步学习“基因工程”获取目的基因打下基础，同时促使学生认同生物科学技术的价值。⑧引导学生简略回顾PCR技术原理，思考并讨论：1993年，穆利斯因发明PCR独享诺贝尔化学奖。PCR的原理很简单，为什么穆利斯之前的科学家都没有尝试呢？从PCR概念生成到技术应用，仅穆利斯一个人就能完成么？教师提供科学史资料并组织学生讨论，学生通过讨论达成共识：认同勇于思考、大胆尝试对科学研究的重要意义；科学概念的提出到实际技术的应用，是很多科学家艰苦努力工作的结果；科学技术的发展能够极大地推动社会的生产力。2.讲解凝胶电泳及染色观察原理教师结合模式图，说明电泳的定义、琼脂糖凝胶电泳的化学成分及其作用、和加样孔等基本概念。引导学生思考：什么样的DNA分子在凝胶中迁移得快？从而归纳总结出电泳的原理。并介绍凝胶电泳是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。然后，以Marker2000和Marker5000为例，讲解DNA标准溶液（marker）的作用，为后续教学过程中使用这两种marker进行探究埋下伏笔。然后，向学生阐明亚甲基蓝的染色原理以及优点：无毒、结果肉眼可见、染色结果稳定。Trans2000Trans5000图3电泳原理示意图图4Marker电泳结果照片(二)组织实验操作1.PCR扩增①学生课前准备实验材料。学生课前制备酵母细胞悬液，课上结合教师拍摄的示范视频讲解操作要点：称取0.1g干酵母粉，放于盛有100mL无菌水的三角瓶中，盖上封口膜用皮筋绑好，摇匀后在温暖环境下活化2小时即可。②制备PCR反应体系并扩增。每4位学生1组，共用1个冰盒，制备1个PCR反应体系。在微量离心管上做好标记后，离心后放入PCR仪进行扩增。教师提示学生以下操作要点：使用微量移液器将PCR反应体系（见表3）各成分加入到0.2mL已灭菌的微量离心管中。注意，不可加入过多酵母，否则细胞壁会影响PCR效果；且酵母细胞悬液需摇匀后再吸取。反复吹吸使反应液混合均匀，以3000转/min的转速离心30s,使反应液集中于微量离心管的底部。将微量离心管放入PCR仪中，设置反应条件如图5。扩增后的PCR产物可贮存于-20℃冰箱中。表3改进后的PCR反应体系配方图5改进后的PCR反应条件流程图★改进1：PCR扩增酵母细胞的核糖体DNA（rDNA）部分片段。将实验材料改为超市购买的食用高活性干酵母（酿酒酵母）。相较于噬菌体或大肠杆菌，酵母菌不仅更加便宜、安全、实验准备过程也更加简单。酵母细胞中编码核糖体18SrRNA、5.8SrRNA、25SrRNA的3个DNA序列，中间相隔2个内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer），简称ITS。成熟的核糖体RNA中不包括ITS序列，因此自然选择压力较小，能容忍更多变异。本实验使用真菌通用ITS引物（ITS1引物和ITS4引物）扩增5.8SrDNA及其两端的2个ITS的全部序列，以及相邻的18SrDNA和25SrDNA的部分序列，总长度为841bp。选择这段DNA进行教学是因为PCR扩增ITS序列，可以鉴定病原真菌，筛选酿酒的酵母菌株，还可以通过测序和比对不同物种的序列建立进化树，体现了PCR技术在医疗、工业和进化研究上的应用价值。ITS序列拷贝数高，长度多在1000bp以内，容易被PCR扩增出来。此外，笔者根据教学实际，经过多次尝试，设计了适于教学的PCR反应体系和条件。图6核糖体DNA部分片段示意图2.电泳①学生课前制备凝胶。指导学生课前制备凝胶，课上学生结合教师拍摄的制备凝胶的示范视频讲解操作要点：称取琼脂糖0.25g加到盛有25mL电泳缓冲液的三角瓶中。盖上封口膜并用橡皮筋绑住；用微波炉加热1min，使琼脂糖熔化呈透明；倒入胶盒。注意避免产生气泡。待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将其从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极。向电泳槽中加入电泳缓冲液，并没过凝胶。②加样。教师展示加样模式图和特写照片说明加样孔位置，结合示范录像讲解制备样品和加样的操作要点：用微量移液器向50μLPCR产物中加入10μL6×上样缓冲液，并反复吹吸混合均匀，再吸取10μL样品混合液缓慢加到加样孔内。注意，每加样1次需更换1个枪头。尽量避免使用最外侧的加样孔，其染色效果有时不理想。教师在示范操作，在每块凝胶上加样10μLDNAmarker。学生4人1组制备样品，每个样品混合液可供6人加样，每人至少独立完成加样1次。全班学生分为2大组，同时在2块凝胶上依次加样。③跑电泳。教师边操作，边向学生讲解：盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪电源的电压设置成80V，电泳25min。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。★改进2:缩短凝胶电泳时间。教材上是80V电压下电泳40分钟，现压缩到25分钟亦可看到PCR产物和Marker的条带。3.染色教师结合染色示范录像的播放，讲解染色要点。学生分2组，对2块凝胶进行染色。★改进3:优化染色方案。教材中的3步染色法，操作时间较长。笔者通过反复地实践过程，提出两种可行的染色方案，既确保实验效果理想，又顺应教师的排课不同需求。染色方案1：压缩并改进3步染色法：将染色时间从“15～20min”压缩为“8min”，将“染液覆盖凝胶”改为“没过凝胶约5mm”。从而，1课时完成电泳和染色，比原有方案减少了1课时，同时染色结果十分清晰。具体方法是：⑴将凝胶放入培养皿里，倒入0.1%亚甲基蓝溶液没过凝胶约5mm，染色8min。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。染色后回收染液，染液需避光保存。⑵倒入75%乙醇没过凝胶约5mm，不断晃动培养皿1～1.5min。再倒去乙醇。⑶加入冷的蒸馏水进行脱色，当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。此过程中可更换被染蓝的蒸馏水。此外，凝胶在蒸馏水中不宜浸泡过久，否则条带颜色变淡直至无色。染色方案2：将染色步骤简化为1步，染色效果仍很好。教师可利用剩余时间讲解观察实验现象的时间和方法，由于亚甲基蓝的染色效果较为稳定，可组织学生利用次日的课余时间观察实验结果。具体方法是：向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002%亚甲基蓝溶液，并没过凝胶约5mm。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。第二天观察经过染色处理的凝胶板，看到清晰的蓝色区带后，倒去染液，终止染色。A.使用Marker2000B.使用Marker5000图7改进后染色结果照片图8改进前染色结果照片（三）引导观察并分析实验结果为了有效利用课堂时间，教师利用等待电泳和染色的时间引导学生推测实验结果，然后出示2块课前准备的预实验凝胶，验证学生的推测。然后，将学生分为2组，分别观察并分析这2块使用不同Marker的凝胶，获得的结论可互为验证。学生课下再运用课上习得的分析方法分析自己的实验结果。1.观察DNA条带的位置和宽度教师结合示范照片，讲解观察的要点：学生观察凝胶板上呈现的DNA时，可先在桌上铺1张白纸，在光下手持盛有凝胶的培养皿距白纸5cm以上，找到较为清晰的区带。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察和手机拍照。在观察的同时，可在实验报告单上绘制草图，标出DNA蓝色区带的数目和位置。图9手持培养皿进行观察图10将凝胶放在玻璃板上观察使用Marker2000使用Marker5000图11教师预实验结果局部照片本实验中，染色凝胶板上呈现的清晰蓝色条带，即为DNA所在位置。PCR产物的长度介于800～1000bp之间。2.实验结果分析（★改进4：运用数学方法分析实验结果中蕴含的数据）在实验教学活动中，引导学生通过分析实验数据得出结论，是进行科学思维训练的最好方式。但以往教学过程中，仅提示学生通过对比Marker条带估出PCR产物的大致长度，却忽略了3个问题：PCR产物条带位于2条Marker条带之间，应该如何科学地估值？估测PCR产物长度只用到了Marker的1个或2个条带，丢弃了Marker其它条带中所蕴含的宝贵信息，应如何科学地分析实验数据？DNA片段长度的对数与迁移距离呈反比，应如何处理与对数相关的实验数据？在学科教研活动中老师们普遍认为，这节实验课获得的数据是培养学生理性思维的极好素材。理性思维是基于论证和逻辑推理的思维过程和方式，引导学生解决以上问题的过程就是对学生进行逻辑思维训练的过程，因此笔者在本实验活动中又进行了如下尝试：①用直尺测量凝胶电泳后不同DNA片段迁移距离（图12），即凝胶板上每条DNA条带中央与加样孔之间的距离，记录于表4。Marker2000Marker5000图12测量DNA条带的迁移距离照片②借助半对数坐标纸分析对数数据。如图13所示，迁移距离所在的x轴是分度均匀的普通坐标轴；DNA片段长度所在的Y轴是分度不均匀的对数坐标轴，在此轴上某点与0点的实际距离为该点对应数（即DNA片段长度）的对数值，但是在该点标出的值是DNA片段长度原数值。实际应用时，往往根据需要使用半对数坐标纸的一部分，如下图纵轴的起点就是100而不是0。将Marker2000清晰的4个条带的数据标到图上，可见所有的点在一条直线上。从而推断“DNA片段长度的对数与迁移距离呈反比”，绘制趋势线（直线）作为标准曲线。据此标准曲线和PCR产物条带的迁移距离，可据图推断出PCR产物的大小约为840bp。本次估值建立在Marker全部条带信息的基础上，更为科学。半对数曲线图的绘制易于教师展开教学；学生也习得了处理对数的简便方法，绘图和分析图表的能力得到了提升；数据的获取和分析更为深入。③使用条带更多的Marker5000验证上述实验结果的正确性。将Marker5000的8个条带的数据标记在半对数坐标纸上，8个点也位于一条直线上，其趋势线与Marker2000很接近，且基本平行。根据Marker5000实验结果中PCR产物的迁移距离和趋势线，推断出PCR产物大小也约为840bp，从而证明之前实验分析方法和结论的正确性。为了更好地比较两条趋势线，本文中使用Marker2000的凝胶实际电泳时间为23.5min，比另一组短1.5min，从而避免两条线过于重合导致绘图、分析的困难。④运用E