PCR扩增技术上海农林20课件

PCR扩增技术上海农林职业技术学院基因工程课件DNA聚合酶DNA聚合酶的种类依赖于DNA的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)DNA聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)耐热DNA聚合酶(Taq

酶)依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶不依赖于DNA的DNA聚合酶:末端转移酶基因工程课件上海农林职业技术学院E.coliDNA聚合酶I（pol

I）

1.E.coli的DNA聚合酶系统PolI

polII

polIII

2.E.colipolI

在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段小片段具5’→3’外切酶活性大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,pol

IK)基因工程课件上海农林职业技术学院5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：3’…CAGGAGTTCGTCA…5’5’…GTCCTOH3’…CAGGAGTTCGTCA…5’5’…GTCCTCAAGCOHDNApolI聚合酶活性5’

3’

外切酶3’-CTGCGA

G

T

A

C3’

5’

外切酶3’-C

T

G

AGTAC基因工程课件上海农林职业技术学院DNaseI1.特点：具内切酶活性，无序列特异型作用于ds-DNA，产生5’-P低聚核苷酸;当酶浓度很低时，ds-DNA分子上形成切口.

2.用途

1)制备DNA探针

2)制备RNA样品时,除去DNA分子

3)基因突变时产生切口基因工程课件上海农林职业技术学院大肠杆菌DNA聚合酶I基本用途5’→3’外切5’→3’聚合制备32P标记的探针基因工程课件上海农林职业技术学院DNA聚合酶I5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’5’G-C-A-T-CA-T-G-G-C-TA-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’DNA聚合酶I4种dNTPppp32dA5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’双链DNA（基因）分子用一条单链作为模板转录并成熟信使RNA分子，以其为模板合成互补的单链DNA，以其为模板组成一个双链cDNA分子cDNA短，比基因少了内含子基因工程课件上海农林职业技术学院依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）cDNA课堂作业：说明DNA和cDNA的主要区别。基因工程课件上海农林职业技术学院依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）基本特性1：以RNA为模板合成DNA逆转录酶3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTTTmRNA3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTTTmRNAcDNA基因工程课件上海农林职业技术学院依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）基本特性1：双向外切DNA/RNA杂合链中的RNA链RNADNA逆转录酶逆转录酶TaqDNA聚合酶

1.特点：

分离自水生栖热菌，最适反应温度75℃对95℃高温具良好稳定性不存在3’→5’外切酶活性

2.用途：PCR

基因工程课件上海农林职业技术学院TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃，为什么在PCR反应过程中将延伸温度设置为72摄氏度呢？PCR扩增技术上海农林职业技术学院PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR法克隆目的基因前提：已知待扩增目的基因两侧序列，根据该序列合成反应必需的双引物。PCR扩增的基本原理基因工程课件上海农林职业技术学院包括三个步骤：

=>DNA模板变性(95℃)=>与DNA引物退火(45℃-55℃)=>引物延伸(72℃)PCR扩增的基本原理基因工程课件上海农林职业技术学院变性退火延伸延伸30-35个循环PCR反应五要素

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶特点1）来自水生栖热菌Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能基因工程课件上海农林职业技术学院请大家画图说明PCR反应的原理基因工程课件上海农林职业技术学院PCR的类型多重PCR定量PCR差异显示PCR锚定PCRRT-PCR-----基因工程课件上海农林职业技术学院多重PCR:是指在一个反应中同时扩增多个序列，能够节省时间和精力。定量PCR：是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行定量。锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴,然后分别用多聚dC和已知的序列引物进行PCR扩增。基本概念基因工程课件上海农林职业技术学院巢式PC