第五章色谱分离技术44课件

第五章色谱分离技术学习目标掌握各种色谱分离（吸附、分配、离子交换、凝胶、亲和）的分离机理熟悉色谱分离的基本操作及特点理解色谱分离中常见参数的含义，了解色谱图的基本知识第一节色谱分离理论基础

色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。

色带以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。1941

Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952

James和Martin发展了气相色谱；1956

VanDeemter提出速率理论；1967

Kirkland等研制高效液相色谱法；

80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。一、色谱分离的概念及分离依据色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。它利用被分离的各种物质在互不相溶的两相中分配系数等的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。1、概念

在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱

。82、分离依据色谱分离是依据混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子形状及大小、分子的荷电性、溶解度及亲和力等）的差异，通过物质在两相间反复多次的平衡过程，使各组分在两相中的移动速率或分布程度不同，表现为各组分的流出次序不同，而使各组分分离。

在

定稳定压下，色谱过程达平衡时，某种组分在固定相S和流动相m中含量（浓度）的比值为平衡系数KK—平衡系数(分配系数、吸附系数、选择性系数等）cS—固定相中的浓度cm—流动相中的浓度平衡系数K与被分离物质本身的性质；固定相和流动相的性质；色谱柱的操作温度等有关各组分K值相差越大，色谱分离效果越理想二、色谱分离的分类根据分离时一次进样量的多少，色谱分离的规模可分为色谱分析规模(小于10mg)、半制备(10~50mg)、制备规模(0.1~10g)和工业生产规模(>10g)。色谱分离的规模小，但产值高。1、根据进样量多少分昆明冶金高等专科学校生物化工教研室

超临界流体色谱—流动相是在接近它的临界温度和压力下工作的液体气相色谱—以气体作流动相液相色谱—以液体作流动相2、根据流动相的相态不同分昆明冶金高等专科学校生物化工教研室3、根据固定相的附着方式分—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱

—液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)—固定相装在圆柱管中—柱色谱昆明冶金高等专科学校生物化工教研室吸附色谱法分配色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法亲和色谱法4、根据分离机理不同分低压色谱：操作压力<0.5MPa中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa高压色谱：操作压力4.0～40MPa5、根据操作压力的不同分前沿分析法（迎头法）置换展开法（顶替法）洗脱展开法（洗脱分析法）6、根据操作方法的不同分三、色谱分离的过程和色谱图1、色谱分离过程加样，洗脱剂冲洗各组分与固定相无作用力——与洗脱剂一起流动，得不到分离各组分与固定相有一定作用力——移动速率低于流动相各组分与固定相的作用力大小不同——移动速率不同，作用力大，移动慢，各组分得到分离19

色谱柱检测器色谱图

组分在色谱柱内运动溶质浓度分布柱内：谱带柱后：色谱峰色谱仪图1色谱过程图2色谱图2、色谱图

试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图。常用术语：（1）基线在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。（2）色谱峰当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。（3）峰高色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离，用h表示。（4）峰面积峰与峰底之间的面积，用A表示。（5）保留值试样中各组分在色谱柱中停留时间值或将组分带出色谱柱所需流动相的体积值。①保留时间从进样至被测组分出现浓度最大值时所需时间tR。②保留体积从进样至被测组分出现浓度最大值时流动相通过的体积VR。③死时间不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时所需的时间tM。④死体积不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时流动相通过的体积VM。（6）分离度相邻两组分间峰顶间距离除以此两峰底宽的平均值，衡量色谱分离条件优劣的参数。分离条件的选择主要是提高“难分离物质对”的分离度当两峰高相差不大,且峰型接近时，认为W1=W2=W当R=1时，分离程度达到94%当R=1.5时，分离程度达到100%26（7）柱效率塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则H=L/n式中n为理论塔板数理论塔板数可根据色谱图上所测得的保留时间（tR）和峰宽（W）或半峰宽（Wh/2）按下式计算：或27有效塔板数（neff）：用有效塔板数（neff）来评价柱的效能比较符合实际28（8）色谱流出曲线的意义色谱峰数等于样品中单组分的最少个数；色谱保留值是定性分析的依据；色谱峰高和面积是定量分析的依据；色谱保留值或区域宽度是色谱柱分离效能的评价指标；色谱峰间距是固定相或流动相选择是否合适的判定依据。29四、阻滞因数或比移值Rf在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速率与流动相的移动速率之比，称为阻滞因数或比移值Rf。30五、塔板理论

1941年，Martin和Synge阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；与精馏相似，色谱分离也是一个分配平衡过程。31它把色谱柱看成一个分馏塔，分馏塔是分离沸点不同的混合物的一种装置，一般有十几层塔片。在塔的底层加热，利用各组分的挥发性不同，在塔片上经过多次气液平衡，最终低沸点组分在塔顶的流出液中含量高，而高沸点组分在塔底层含量高。塔板理论，是人为的认为在色谱柱中存在着塔片。在每个塔片高度的间隔内，样品混合物的各组分，在流动相与固定相达到分配平衡。而后各组分被流动相携带转移至另一层塔片，再达分配平衡。32经多次转移平衡，各组分按分配系数大小的顺序，依次流出色谱柱（分配系数小的先出柱）。由于一根色谱柱的塔片数比精馏塔多得多（103－104片），因此，只要分配系数间存在微小的差别，则可获得很好的分离。33塔板理论基本假设固定相，流动相，H,vm，v3l

色谱柱由一系列塔板组成l

塔板内，组分在两相间迅速达到平衡（理想色谱）l

组分的分配系数不随它的浓度变化而变化（线性分布等温线）l

组分的轴向扩散为零l

流动相的流动是跳跃过程34

0加样

0平衡流动0101再平衡流动012

塔板理论示意图

35由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达成“平衡”所需的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡”次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。塔板理论回答了影响色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操作条件的影响。36第二节各种色谱分离的基本原理1、吸附色谱

利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法。

两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。a：吸附剂m：流动相Xm：流动相中的组分分子Xa：固定相中组分的分子Ym：流动相分子Ya：固定相中溶剂分子吸附过程是试样中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程38固定相固定相是表面具有许多吸附中心的吸附剂，常用吸附剂硅胶表面的硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱使用一般硅胶，高效液相色谱常用球形或无定形全多孔硅胶和堆积硅珠。（1）对吸附剂的要求①有大的表面积和足够的吸附能力②对不同的化学成分有不同的吸附力，能较好地把

混合物分开39③在所用的溶剂及流动相中不溶解④与流动相、溶剂及样品中各成分不起化学反应⑤颗粒均匀，操作过程中不会碎裂（2）对吸附剂的要求①有机类：淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纤维素等无机类：氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、硅藻

土等40（1）要求①应使用较纯试剂，含杂质会影响洗脱能力②与样品或吸附剂不发生化学反应流动相能溶解样品中各组分，且各被分离组分有不同

的K值④粘度小，易流动41洗脱顺序流动相的洗脱能力主要由其极性决定，极性强的流动相分子占据极性中心的能力强，洗脱能力就强。流动相的选择要依据样品的极性、吸附剂的活性而定。吸附弱的组分先被洗脱，吸附强的组分后被洗脱。吸附的强弱与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型）有关。42一般规律①非极性化合物，吸附弱基本母核相同，分子中取代基的极性越强，或极性基团越多，分子极性越强（但要考虑其他因素的影响），吸附能力越强。分子中双键数越多，则吸附力越强④能形成分子内氢键的化合物，其吸附能力降低432、分配色谱

将液体均匀的涂渍在惰性物质（载体）表面上作为固定相，利用被分离组分在固定相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差别而被分离。分离机制

利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离。44要求固定相机械吸附在惰性载体上的液体，常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂。载体惰性物质，无吸附性、性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应的常用的有吸水硅胶、纤维素、多孔硅藻土等。流动相必须与固定相不互溶，石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷及苯等。45洗脱顺序正相色谱固定相极性大于流动相极性，主要分离极性样品，极性弱的组分先被洗脱，极性强的组分后被洗脱。反相色谱固定相极性小于流动相极性，主要分离非极性样品和中等极性样品，极性强的组分先出柱，极性弱的组分后后出柱。463、离子交换色谱要求固定相离子交换树脂被分离组分离子型的有机物或无机物流动相水为溶剂的缓冲溶液分离机制

依据被测组分与离子交换剂交换能力不同而实现分离。47固定相固定相是离子交换剂——常见的是离子交换树脂，是具有网状立体结构高分子的聚合物。如苯乙烯和二乙烯苯聚合，其中二乙烯苯是交联剂。流动相水、缓冲溶液、或加入少量的乙醇、四氢呋喃、乙腈等有机溶剂，提高选择性。48洗脱顺序交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。强离子交换树脂的交换容量不随流动相的pH变化，调节pH值的主要作用是控制弱电解质离解。494、凝胶色谱要求固定相多孔性凝胶有机溶剂——凝胶渗透色谱流动相水——凝胶过滤色谱分离机制

利用被测组分分子大小不同，在固定相上选择性渗透实现分离。50固定相主要是多孔凝胶，主要性能参数是：平均孔径：凝胶孔径大小排斥极限：不能渗透进入凝胶的任何孔隙的某分子量（KP=0）分子量范围：排斥极限（KP=0）与全渗透点（KP=1）之间的分子量范围选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围51流动相要选对样品的溶解好，又能润湿凝胶。粘度要低的溶剂，否则会限制分子扩散而影响分离效果。一般水溶性试样选水溶液，非水溶性试样选四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。52基本原理大分子物质在凝胶颗粒间隙中运动小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。535、亲和色谱生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲和色谱。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。54在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。55亲和色谱法的基本过程是：（1）配基固相化将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱。（2）亲和吸附将含有纯化对象有的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。（3）解吸附用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。第三节色谱分离操作过程57一、纸色谱分离1、概念纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不同物质在两相中的分配比不同而进行分离的一种微量分离方法。载体层析纸（滤纸）流动相有机溶剂（展开剂）固定相滤纸上的吸湿水分58分离示意图上行法原点展开后斑点溶剂前沿b592、纸色谱法的基本操作（1）纸的准备一般纸色谱法使用的滤纸应具备以下条件：滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质滤纸被溶剂浸润时，不应有机械折痕或损伤，即

应有一定的强度Rf相差小的选慢速滤纸、Rf相差大的选快速滤纸，一般选中速滤纸60滤纸对溶剂的渗透速度应适当，渗透速度太快时

易引起斑点拖尾，影响分离效果，速度太慢时，

耗费时间太长纸质应均一，否则会影响实验结果的重复性

黏度小的展开剂（石油醚等）选慢速滤纸黏度的展开剂（正丁醇等）选快速滤纸61①滤纸的预处理以0.1-0.4mol/LHCl或2mol/LHAc浸泡数小时，除去无机杂质后，取出用蒸馏水洗净，再将滤纸放在丙酮（1:1）中浸泡一周时间，除去有机杂质，再取出风干备用。②滤纸的剪裁将滤纸裁剪成条形时，应顺着纤维排列的方向。在裁剪滤纸时，要把周边裁剪整齐，不能留毛边。还要注意防止手垢和汗渍污染滤纸。62（2）样品处理用于色谱分析的样品，要求初步提纯，如氨基酸的测定，不能含大量盐类、蛋白质，否则互相干扰，分离不清。固体样品应尽可能避免用水作溶剂，因水作溶剂斑点易扩散，一般选用乙醇、丙酮、氯仿等作溶剂，最好是选用与展开剂极性相近的溶剂。63（3）点样先用铅笔在距纸条一端2-3cm划一条直线（起始线），并在线上隔一定距离划一“×”表示点样位置点样工具：微量注射器，毛细管（φ=0.5mm）点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“×”号接触，使点样的斑点直径为0.2-0.5cm，每次点样2-20μL于滤纸上，以冷风吹干64点样65（4）展开纸色谱必须在密闭的层析缸中展开。在层析缸中加入适量的展开剂，将点好样的滤纸放入缸中。展开剂水平面应在点样纸以下，据不允许浸泡样品线。展开剂的选择欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性；展开剂与欲分离物间应无化学反应；欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度影响；欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到66按展开方法，纸色谱分为上行法、下行法、水平法上行：慢（常用）下行：快（适用于比移值小的溶质）67展开操作将滤纸浸于层析缸中的展开剂中，使展开剂通过滤纸的毛细作用上升（或下降），实现试样的分离展开时必须在密闭的容器中进行展开剂不得浸泡到点样线展开次数一元展开二元展开（双向展开）多段展开68双向纸色谱法例：氨基酸混合液点在15*15cm滤纸边2cm处，风干，展开剂用CH3OH-H2O-吡啶（20:5:1），当溶剂移动至14cm处，取出风干。（第一次展开）将滤纸折成筒状，使斑点处于下方，再用叔丁醇-甲基乙基酮-H2O-二乙胺（10:10：5：1）展开至14cm，取出风干。（第二次展开）显色：茚三酮-4-乙-2-甲氮苯-并HAc第一次展开第二次展开69纸色谱斑点拖尾现象有以下几种情况：点样量过多，样品量超过了点样处滤纸所荷载的

溶剂能够溶解的能力某些物质可以形成多个电离形式，且各自有不同

的Rf值，因而在纸上造成连续拖曳，这种情况可

使用碱性或酸性的展开系统，抑制其电离即可消除。70被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+、等

杂质形式络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。

某些物质在展开过程中会逐渐分解，如肾上腺素

和某些含硫氨基酸等，可将它们转变成稳定的物

质再作展开来克服

当被分离的物质能溶于显色剂中时，如显色剂用

量过多，可使斑点模糊或拖长。

71（5）显色及定位有色物质，展开后即可直接观察各个色斑紫外光照下产生荧光，观察荧光（例如生物碱）喷以试剂使斑点显色（显色剂，碘蒸汽熏或氨水熏等）72二、柱色谱分离1、概念利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同或其他亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附和分配等作用，从而将组分分开。73洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱74色谱柱通常用玻璃柱。工业上大型色谱柱可以用金属制造。柱的入口端应该有进料分步器，使进入柱内的流动相分布均匀。有时也可在色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片或保持一段缓冲液层。柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板或玻璃细孔板支持固定相，最简单的也可以用铺有滤布的橡皮塞。2、色谱柱的的分离与操作（1）色谱柱的选择75设计柱长时需考虑下列几点：

柱越长，长度和内径比越大，就越难得到均匀的填装。大多数色谱柱的长度25cm左右。柱的最小长度取决于所要达到的分离程度较大的柱直径需要较长的色谱柱。76（2）装柱①干法装柱在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层5mm厚的干净砂粒，或放置大小合适的玻璃砂芯。打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶端平面，关紧下口活塞。77②湿法装柱先在吸附剂中加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，再把放好棉花、沙子或合适大小的玻璃砂芯的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌入柱子。注意整个操作要慢，不要将气泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。78①湿法上样把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。（3）上样79②干法上样可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。80在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出。若用50g吸附剂，一般每份洗脱液量常为50mL。现多采用薄层色谱或纸色谱定性检查各流分中的化学成分组成。含单一色点的部分用合适的溶剂析晶；仍为混合物的部分进一步寻找分离方法再进行分离。（4）洗脱81注意：整个操作过程必须注意不使吸附柱表面的溶液流干。应控制洗脱液的流速。应尽量在短时间内完成一个柱层析的分离。82洗脱操作的方式可分为：前沿分析法（迎头法）：将混合物溶液连续通过色谱柱，只有吸附力量最弱的组分最先自柱中流出，其他各组分不能达到分离。流出曲线如图该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。83洗脱展开法（洗脱分析法）：工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图AB

这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。84置换展开法（顶替法）：将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。