项目四发酵工艺及控制何敏77课件

项目四发酵工艺及控制Email:heminteacher@163.com主讲教师何敏广东科贸职业学院生物技术系项目四发酵工艺及控制任务1.工业发酵的主要类型及代谢特征任务2.发酵工艺参数及监测方法任务3.发酵过程操作与工艺控制任务4.染菌及防治

任务1.工业发酵的主要类型

及代谢特征一、微生物的代谢产物类型二、工业发酵的主要类型三、发酵过程的代谢变化规律一、微生物的代谢产物类型（一）初级代谢产物定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的。一、微生物的代谢产物类型（二）次级代谢产物定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。举例：抗生物、毒素、激素、色素、维生素等。特征：不同的微生物次级代谢产物不同（种的特异性）;次级代谢产物是微生物生长到一定阶段才合成的。热原质(pyrogen)：或称致热原。是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热反应物质。产生热原质的细菌大多是革兰阴性菌，热原质即其细胞壁的脂多糖。毒素与侵袭性酶：细菌产生外毒素和内毒素两类毒素。外毒素(exotoxin)是多数革兰阳性菌和少数革兰阴性菌在生长繁殖过程中释放到菌体外的蛋白质；内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌的脂多糖。色素：细菌的色素有两类——水溶性色素，能弥散到培养基或周围组织。脂溶性色素，不溶于水，只存在与菌体，是菌落显色而培养基颜色不变。抗生素：某些微生物代谢过程中产生的一类能抑制或杀死某些其他微生物或肿瘤细胞的物质。细菌素：某些菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质。维生素：细菌能合成某些维生素除供自身需要外，还能分泌到周围环境中。【附】次级代谢产物次级代谢与初级代谢的关系关系密切，初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，比如糖降解过程中的乙酰-CoA是合成四环素、红霉素的前体；一般菌体的次级代谢在对数生长后期或稳定期间进行，受环境条件的影响；

次级代谢产物在微生物生命活动过程中的产生极其微量，它们没有一般性的生理功能，也不是生物体生长繁殖的必需物质，但对其它生物体往往具有不同的生理活性作用前体：某些能够直接结合到产物分子中，而自身结构并未发生显著变化的小分子物质问题：比较初级代谢产物和次级代谢产物初级代谢产物次级代谢产物生长繁殖是否必须生产阶段是否有菌种的特异性种类是否对数生长期对数生长后期或稳定期无有氨基酸、核苷酸、多糖、脂类抗生物、毒素、激素、色素二、发酵类型（一）按培养基的状态可分为2种类型：固体发酵(浅层发酵、深层固体发酵）液体发酵（表面发酵、深层发酵）固体发酵：将纯种微生物接种、培养在固体培养基上优点：设备简单，能耗低，原料粗放，不易污染，产物回收所耗溶剂和所生废水均少。缺点：设备占地面积多，劳动强度大，传质和传热困难，副产物多，培养过程中进行检测困难。

液体发酵

液体发酵是将发酵原料制成液体培养基，接种微生物，通过其代谢活动使发酵原料转化成发酵产品。有表面发酵和深层发酵两种形式深层发酵：是菌体或菌丝体均匀分散在液体培养基中，通过向培养液强制通气或不通气以及搅拌进行产物合成。优点：设备占地面积少，生产规模大；发酵速度快，生产效率高；生产机械化，易于自动控制，劳动生产率高；发酵设备密闭，传热传质良好，生产便于管理；副产物少，有利于产品提取，所得产品质量高。缺点：是设备条件要求较高。（二）按操作方式不同可分为3种类型（1）分批发酵(Batchfermentation)指在一个密闭系统内一次性投入有限数量营养物进行发酵的方法。

Fin=Fout=0（无培养基进出）（2）补料分批发酵(Fed-batchfermentation)在分批发酵中间歇地或连续地补加（流加）新鲜培养基的方法。

Fin

≠0；Fout＝0或Fout

≠0（3）连续发酵(Continuousfermentation)以一定的速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基，同时以相同速度将含有微生物和产物的培养液从发酵罐内放出，Fin=Fout＞0（培养基有进有出）三、发酵过程的代谢变化规律代谢变化：反映在发酵过程中，菌体的生长、发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。代谢曲线：把菌体的生长、发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者随时间变化的过程绘制成图，就成为代谢曲线。3种发酵类型的代谢曲线三种操作方式下的代谢特征（一）分批发酵

1、分批发酵的定义在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖

2、分批发酵的特点微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。

3、分批发酵的优缺点优点：①操作简单；②操作引起染菌的概率低；③不会产生菌种老化和变异等问题缺点：非生产时间较长、设备利用率低。4、分批发酵的生长曲线五个生长阶段延迟期：细胞浓度无明显变化对数期：细胞浓度随时间呈指数生长减速期：细胞的生长速率开始减缓静止期：细胞浓度不再增加，为最大值衰亡期：细胞开始死亡，细胞生长速率为负值细胞生长时间细胞浓度对数值单细胞微生物的生长曲线分批发酵生长曲线各期比较延滞期对数期稳定期衰亡期此期特点细胞浓度无明显变化细胞浓度随时间呈指数生长生物量基本不变，形成芽孢细胞开始死亡发酵意义缩短延滞期尽可能使比生长速率接近其最大值合成和分泌次级代谢产物及时放罐处理5.分批发酵的类型

(按照产物生成与菌体生长是否同步)

(按照产物生成与基质消耗是否同步)Ⅰ型：生长偶联产物生成——菌体生长、碳源利用和产物形成几乎在相同时间出现高峰。产物形成直接与碳源利用有关。Ⅱ型：生长与产物生成部分偶联——在生长开始后并无产物生成，在生长继续进行到某一阶段才有产物生成。产物形成间接与碳源利用有关。Ⅲ型：非生长偶联产物生成——在生长停止后才有产物生成。产物形成与碳源利用无准量关系。分批发酵中菌体生长和产物形成的关系P88偶联型（Ⅰ型）半偶联型（Ⅱ型）非偶联型（III型）α－与生长关联的产物生成系数（kg/kg）β－非生长关联的比生成速率（kg/kg.h）α﹥0;β＝0α﹥0;β﹥0α＝0;β﹥0例如：生长关联型——葡萄糖异构酶的发酵细胞生长与产物形成偶联关系乳酸发酵、土霉素、谷氨酸、柠檬酸发酵分批发酵中产物形成和基质消耗的关系P88α－与生长关联的产物生成系数（kg/kg）β－非生长关联的比生成速率（kg/kg.h）α﹥0;β＝0α﹥0;β﹥0α＝0;β﹥0产物生成与基质消耗直接有关

产物生成与基质消耗间接有关

产物生成与基质消耗无关

研究生长关联型的意义从上述分批发酵类型分析：如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长稳定期，以提高产量从自然界分离的菌种产品基因工程诱变育种细胞工程生产用菌种扩大培养原料微生物菌体代谢产物分离提纯发酵罐发酵条件控制接种培养基配置灭菌6.典型分批发酵的工艺流程(复习)无菌空气7.主发酵罐的发酵阶段及状态典型的分批发酵中，主发酵罐的发酵分4个阶段：

①初始阶段②发酵前期③发酵中期④发酵后期细胞生长时间细胞浓度对数值分批发酵小结1、分批发酵的定义2、分批发酵的特点3、分批发酵的优缺点4、分批发酵的生长曲线（单细胞）5、各期特点及工业发酵上意义6、分批发酵的类型（I型、II型、III型）7、典型分批发酵的工艺流程8、主发酵罐的发酵阶段及状态填空1.微生物发酵过程分为三种类型，其中（

）产物的生成直接与基质（糖类）的消耗有关A、类型Ⅰ

B类型Ⅱ

C类型Ⅲ

DA+B+C2.根据细胞生长与产物形成是否偶联分为三种类型，其中混合型（

）。A、α>0，β＝0

B、α＝0，β>0

C、α>0，β>0

D、α＜0，β＜0AC判断题1.酒精发酵产物的生成直接与基质（糖类）的消耗有关。（）2、柠檬酸发酵产物的生成间接与基质（糖类）的消耗有关。（）3、青霉素、链霉素等抗生素发酵产物的生成显然与基质（糖类）的消耗无关。（）4、谷氨酸发酵产物的生成直接与基质（糖类）的消耗有关。（

）5、酒精发酵产物的生成间接与基质（糖类）的消耗有关。（

）6、柠檬酸、谷氨酸发酵产物的生成显然与基质（糖类）的消耗无关。（

）√×√√××填出？处相应的内容？产品基因工程？细胞工程？？原料？代谢产物？发酵罐发酵条件控制接种培养基配置灭菌无菌空气？从自然界分离的菌种诱变育种生产菌种扩大培养分离提纯微生物菌体（二）连续发酵：Fin

＝Fout

﹥01、定义：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。2、优缺点优点：①能维持低基质浓度；

②可以提高设备利用率和单位时间的产量；

③便于自动控制。缺点：①菌种发生变异的可能性较大；

②要求严格的无菌条件。例：具有反馈的单级连续培养系统3、适宜条件：●适宜于培养生长较快的微生物（即μm大），如果μm过小，则不宜采用连续培养。●操作复杂，易染杂菌，主要用于研究方面。4、连续发酵的类型（1）恒化培养使培养基中限制性基质的浓度保持恒定（2）恒浊培养使培养基中菌体的浓度保持恒定盛无菌培养基的容器控制流速阀培养室流出物无菌空气空气控制阀问题1、恒化培养中的微生物是否经历“4个阶段”？答：不经过“四个阶段”，菌群基本是在对数生长期旺盛生长，产量很大。2、恒浊器与恒化器比较，哪种更难控制？答：一般来说，恒浊器较难控制，目前，大多数研究者都是利用恒化器进行连续培养的研究。（三）补料分批发酵(半连续发酵、流加法)1、定义：在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。

Fin

≠0；Fout＝0或Fout

≠02、优缺点优点：①使发酵系统中维持很低的基质浓度；

②可以解除营养物抑制、产物反馈抑制等作用；

③有利于前体的补充;

④不会产生菌种老化和变异等问题。缺点：①存在一定的非生产时间；

②与分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险

3、补料分批发酵的类型：单一补料分批发酵：

Fin≠0；Fout＝0反复补料分批发酵：

Fin≠0；Fout≠0单一型Fin≠0Fout＝0反复型Fin≠0Fout≠0小结：三种发酵方式之比较分批发酵连续发酵补料分批发酵代谢曲线特点封闭系统，操作简单，运用广泛开放系统，操作复杂，易染菌，研究领域兼有二者之优点，有2种类型，运用广泛定义Fin

＝Fout

＝0Fin

≠0；Fout＝0或Fout

≠0Fin

＝Fout

﹥0选择题1细菌群体从开始生长到死亡的动态变化，可以分为四个主要时期。生产上，人们总结出一种连续培养的方法，可以大大提高代谢产物的产量，这种连续培养的方法可以延长的时期是（）

A．调整期 B．对数期

C．稳定期 D．衰亡期C选择题2工业生产用的菌种应选取微生物生长的时期及能大量产生抗生素的时期分别是（）①调整期②对数期③稳定期④衰亡期

A．②③B．①③

C．①③D．②④A选择题3下列对连续培养优点的叙述中，不正确的是（）A.能及时补充微生物所需的营养物质，提高产量B.有利于微生物尽快将代谢产物释放到培养基中C.能消除不利于微生物生长的某些环境因素D.提高了设备的利用率B思考题1．在分批发酵中，按细胞生长和产物生成的关系可分为哪几种类型？举例说明。2．何为补料分批发酵？有何优点？该法主要适用在哪些场合？3．什么叫连续培养？有何缺点？适于培养哪类微生物？4．什么叫发酵周期？分批发酵的生长曲线在工业发酵上有何指导意义？5.绘出典型分批发酵的工艺流程并简要说明之任务2发酵工艺参数及监测方法一、控制参数的目的、研究方法和层次二、发酵控制参数的分类三、发酵过程主要分析的项目一、控制参数的目的、研究方法和层次控制目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，得到最大的比生产速率和最大的生产率控制难点：过程的不确定性和参数的非线性原因：●微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行●发酵过程受到多因素又相互交叉的影响，如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。糖代谢产生的中间产物——前体合成菌体副产物产物合成合成一、控制参数的目的、研究方法和层次

研究方法：单因子实验数理统计学方法研究层次：初级层次的研究：在摇瓶规模进行试验。代谢及工程参数层次研究：在小型反应器规模进行试验。生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。往复式摇床小型反应器大型发酵罐二、发酵控制参数的分类（一）发酵过程的中间分析——生产控制的眼睛微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化代谢参数（状态参数）：能反映发酵过程中微生物的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等。（二）代谢参数的分类

1.按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、搅拌功率、压力、空气流量、粘度、浊度、料液流量化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、溶解氧浓度、pH、产物浓度、排气氧（二氧化碳）浓度、排气二氧化碳浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等（二）代谢参数的分类

2.按检测手段分可分二类：直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KL·a（溶氧系数）等

直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；优点：即时、省力，便于计算机控制困难：传感器①经受高温灭菌②使用性能③气泡干扰④灭菌死角⑤成本昂贵，质量不理想离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。传感器的特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌(密封性好)传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号(响应快、灵敏)传感器性能稳定，受气泡影响小pH计DO计传感器（电极或探头）：在线检测专用的、放入发酵系统内的探测仪器，能将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。三、发酵过程主要监测分析的参数菌体浓度和菌形态：直接反映菌生长的情况基质浓度：微生物生长代谢的物质基础溶氧浓度：需氧微生物生长代谢的必要条件pH：与微生物的生命活动密切相关温度：主要影响酶的反应速率和蛋白质性质CO2：细胞代谢的重要指标泡沫：对发酵产生不利影响任务3.发酵过程操作与工艺控制一、菌体浓度和菌体形态1.菌体浓度影响：①直接影响产物的产率，例如Ⅲ型②影响菌体摄氧率——临界菌体浓度P93菌体摄氧速率＝环境供氧速率时的菌体浓度菌体浓度受种子质量、种龄、接种量等因素的影响菌体形态：在反映菌体生长正常与否，在不同发酵时期形态有较大差异2.监测：取样测干重、测光密度、镜检等3.控制：改变培养基浓度，中间补料发酵液供氧速率、摄氧速率与菌体浓度间关系速度菌体浓度临界菌体浓度摄氧速度供氧速度起始培养时菌丝体培养18小时后的菌丝体图示丝状真菌的沉淀生长请设计监测发酵中菌体浓度的方法取样液（）ml；方法1——比浊法测OD值（细菌悬浮液）方法2——称重法离心（单细胞微生物）

过滤（丝状微生物）方法3——血球计数法；（个体较大的单细胞微生物）作图：横坐标？纵坐标？

100比浊法（测OD值）721型分光光度计练习：721型分光光度计的使用方法二、基质浓度（糖含量、氨基氮和氨氮、磷含量等）1.影响：①菌体生长：基质浓度上限（P94图）②产物形成：基质浓度过大，不利于产物形成。一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。③发酵液特性：黏度（从而影响传氧速率）2.监测：取样测定（糖含量、氨基氮和氨氮、磷含量等），如还原糖的斐林试剂法测定3.控制：中间补料（限制性基质）问题：什么是比生长速率？（g/g·h）【附】糖含量（发酵液中残糖含量）微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗

反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快。通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。

总糖：发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖

还原糖：含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖，常用斐林试剂法测定。请设计发酵液中还原糖的测定取样液（）ml；样液处理离心（单细胞微生物）

过滤（丝状微生物）取上清液或滤液，适当稀释或不稀释，用斐林试剂法进行滴定。作图：横坐标？纵坐标？

100练习：斐林试剂法进行滴定。三、溶氧浓度与通气搅拌（一）溶氧浓度的影响：1.影响微生物生长：针对需氧微生物微生物的吸氧量：呼吸强度和耗氧速率呼吸强度Qo2

：单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，亦称氧的比消耗速率，单位(mmolO2/g干菌体·h)

耗氧速率r

：单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，单位(mmolO2/L·h)呼吸强度Qo2与耗氧速率r的关系：呼吸强度Qo2

：单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，耗氧速率r：单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，

r—微生物耗氧速率(mmolO2/L·h)QO2—菌体呼吸强度(

mmolO2/g干菌体·h)

X—发酵液中菌体浓度（g/L）临界氧浓度(C临界):各种微生物对发酵液中溶氧浓度的最低要求。当C溶氧﹤C临界时，C溶氧——生长限制因子C溶氧C临界Qo2菌体的新陈代谢与有氧呼吸有关，只有将发酵液中溶解氧浓度始终维持在各时期的最佳浓度或临界浓度以上，才能使生长或产物生成速率最大。2、影响的产物合成：C溶氧过低——代谢异常，产量降低C溶氧过高——代谢异常，菌体提前自溶影响合成方向：如谷氨酸发酵例如：供氧对谷氨酸发酵的影响供氧不足供氧适中供氧过量谷氨酸产生菌

乳酸谷氨酸α-酮戊二酸谷氨酸发酵赖氨酸发酵亮氨酸发酵供氧充足产量最大产量最大合成抑制供氧不足合成抑制影响不大产量最大（二）溶氧浓度的控制——供、耗两方面P96

1.从供氧方面控制：调节通风与搅拌问题：在深层培养中进行通气供氧时，氧气如何从气泡传递至细胞内？是否需要克服一系列阻力？2.从耗氧方面控制：限制基础培养基的浓度

使发酵器内的菌体浓度维持于适当水平；并以补料方式供给某些营养成分而控制菌体生长率和呼吸率，从而控制其对氧的需求量（见P97）氧的传递速率1.从供氧方面控制：氧的传递液膜液膜细胞气泡气液界面固液界面O2分子液相主体供氧耗氧细胞膜阻力：由于氧是难溶于水的气体，所以主要阻力来自于从气液界面传递到液膜的传递阻力；动力：气相与细胞内的氧分压之差或浓度差。供氧方面的阻力需氧方面的阻力C*——溶氧浓度CL氧的饱和浓度在单位体积培养液中，氧的传递速率为：OTR——单位体积培养液的传氧速率（mmolO2/m3·h）α——比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积

m2/m3）

KL——氧传递系数

(m/s)

KL·α——溶氧系数

(h-1)CL——发酵液中的溶氧浓度（mmol/m3）

C*——在罐内氧分压下培养基中氧的饱和浓度（mmol/m3）

问题1：如何才能提高供氧能力OTR？答：①提高氧传递的推动力ΔC

②液相体积氧传递系数KLα

问题2：提高方法有哪些？答：①改变与ΔC（ΔC=C*-

CL）有关的一些因素：如：提升罐压、提高通入空气中氧的浓度等，但是，此法有限，为什么？结论：在优化了的工艺条件下，ΔC已很难改变

②改变与KLα有关的一些因素：如：增加搅拌、通气、降低发酵液的粘度等。注意；在增加通风量的同时，需要增加搅拌的转速和功率，为什么？问题问题1：搅拌速度是否越大越好？答：否，因为过度强烈的搅拌使产生的剪切作用过大，对细胞的损伤增加。尤其对丝状菌的损伤更大,且浪费能源。问题2：挡板的作用是什么？答：流体受挡板阻碍，形成向上、向下两部分，垂直方向流动，防止中央下陷产生旋涡，增强上下两组浆叶浆液体的循环，从而延长气泡运动路径和停留时间，∴可以提高ORT值传感器—DO计复膜氧电极基础电极：pH电极和溶氧电极复合电极:将两支电极都装在一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，工业上在线检测大都使用这种电极。它结构紧凑，便于安装.P98pH计DO计（三）监测：在线检测溶解氧监测的意义——发酵异常的指标P97溶解氧异常↓，可能——请分析为什么？

①污染好气性杂菌；②菌体代谢异常；③设备故障；溶解氧异常↑，可能——请分析为什么？

污染烈性噬菌体耗氧供氧供氧不变【小结】溶氧浓度与通气搅拌影响控制监测微生物生长：呼吸强度Qo2耗氧速率rC临界：对氧浓度的最低要求从供氧方面控制：调节通风与搅拌提高ΔC；提高KLα；通气、搅拌、挡板其他影响因素；传感器—DO计(P98图)复膜氧电极在线监测产物的合成：影响产量（代谢）影响合成方向从耗氧方面控制：限制基础培养基的浓度发酵异常的指标：溶解氧异常↑或↓选择题1.发酵中出现溶氧异常下降，可能有下列哪些原因引起？A、污染好气性杂菌

B、菌体代谢发生异常现象

C、某些设备或工艺控制发生故障或变化

D、A+B+C2.发酵中出现溶氧异常升高，不可能有下列哪些原因引起？A、污染好气性杂菌

B、菌体代谢发生异常现象

C、某些设备或工艺控制发生故障或变化

D、污染烈性噬菌体判断题：污染烈性噬菌体会引起溶氧异常下降。（）答案D答案A×3、在发酵中有关氧的利用正确的是（

）A、微生物可直接利用空气中的氧

B、微生物只能利用发酵液中溶解氧

C、温度升高，发酵液中溶解氧增多

D、需向发酵液中连续补充空气并不断地搅拌答案B四、pH值对发酵的影响及控制pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否，还能推断出正在发生的“故事”。（一）影响：P991.影响酶的活性：当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻，从而影响菌体生长和产物合成。如：酵母pH＝4.5～5.0时主要产物是酒精，pH＝8.0时产物有酒精、醋酸、甘油等2、引起微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，影响新陈代谢的进行3、影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用4、影响代谢方向：如：谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺由于pH对菌体的生长和产物的合成能产生这些明显的影响，所以在发酵中pH为关键因素之一（二）发酵过程中pH的变化规律1.生长阶段：pH↑或↓2.生成阶段：pH趋于稳定3.自溶阶段：pH↑引起pH下降的因素？（1）碳源过量，导致有机酸大量积累；（2）消泡油添加过量（3）生理酸性物质的存在引起pH上升的因素？（1）氮源过多，导致氨基氮大量释放（2）中间补料，碱性物质（氨水等）添加过多（3）生理碱性物质的存在0123pH【回顾】生理酸性物质：无机氮源酸性物质，pH↓菌体代谢如：(NH4)2SO4＋H2SO4如：NaNO3作为氮源被利用生理碱性物质：无机氮源碱性物质，pH↑菌体代谢＋4H2＋NaOH＋2H2O作为氮源被利用2NH3NH3所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH（三）最适pH的确定和监测生长最适pH≠产物合成最适pH，所以应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。此外，最适pH还与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。一般根据实验结果确定。监测：在位灭菌的复合pH电极进行在线监测

P102（四）pH的调控关于pH值的几个概念：消前pH：培养基配制完时测定的消后pH：灭菌冷却后测定的（↓0.5～0.8）起始pH：接种前测定的（消后再调节的pH）

pH的调控1.调节基础培养基的配方：基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.8；（灭菌后pH↓0.5～0.8）2.发酵的不同阶段控制不同的pH值：

3.添加缓冲剂：如CaC03缓冲液，制成缓冲能力强、pH值改变不大的培养基。4.直接加酸加碱：当补料与调pH发生矛盾时当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4氨基酸发酵：用氨水流加法和尿素流加法调节pH5.补料控制pH值（补加碳源或氮源）：在补料与调pH没有矛盾时采用，即可补充营养，又增加培养基的浓度和减少阻遏作用。【青霉素发酵的补料工艺】P101以pH为依据，采用控制葡萄糖的补加速率来控制pH，可以满足菌体代谢需要，提高产量。生理酸碱物质【小结】pH值对发酵的影响及控制影响控制监测酶的活性;细胞膜所带电荷;培养基某些成分;代谢方向;配料时加入缓冲物质;通过补料调节;加酸碱调pH（当补料与调pH发生矛盾）传感器—pH计(P102图)复合电极在位灭菌发酵过程中pH的变化规律及原因发酵不同阶段采取不同的pH值在线监测选择题1、在发酵过程中添加CaCO3能起到（）作用A、消泡B、缓冲C、碳源D、微量元素2、常用的生理酸性物质（）不仅可以调节发酵液pH值，还可以补充氮源。A、NaOHB、氨水C、（NH4）2SO4D、尿素3、常用的生理碱性物质（）不仅可以调节发酵液pH值，还可以补充氮源。A、NaOHB、氨水C、尿素D、B+C4、发酵过程中，不会直接引起pH变化的是（

）A、营养物质的消耗

B、微生物呼出的CO２

C、微生物细胞数目的增加

D、次级代谢产物的积累答案B答案C答案D答案C5、引起发酵液中pH值下降的因素有：（）A、培养基中碳、氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放。B、生理碱性物质存在。C、中间补料中氨水或尿素等的碱性物质的加入过多。D、生理酸性物质的存在。判断题1、pH值不同往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。（）2、同一菌种，生长最适pH值只能与产物合成的最适pH值是一致的。（）答案D√×（一）温度对发酵的影响1.微生物生长：通过影响各种酶的反应速率和蛋白质性质从而影响微生物生长2.产物合成：影响产物合成速度；影响产物合成方向；例如，四环素发酵3.影响发酵液的物理性质：黏度、氧溶解度、氧传递速率等金色链霉菌金霉素四环素四环素和金霉素低于30℃35℃30～35℃五、温度对发酵的影响及控制P102（二）影响发酵温度的因素（1）产热因素：生物热和搅拌热。（2）散热因素：蒸发热和辐射热。发酵热：发酵过程中释放出来的净热量

Q发酵=Q生物+Q搅拌－Q蒸发－Q辐射生物热Q生物：生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2，NH3时释放出的大量能量。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。（二）影响发酵温度的因素搅拌热Q搅拌：在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用公式计算蒸发热Q蒸发：通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，一般可以忽略不计。辐射热Q辐射：发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5％。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵过程中生物热的产生的特点——强烈的时间性、呼吸量强弱与生物量的大小有关在发酵初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。在对数生长期，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。在发酵后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。问题1；如果培养前期温度上升缓慢，说明什么？说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。问题2；如果发酵前期温度上升剧烈，说明什么？说明有可能染菌。（三）温度的监测与控制1.监测：温度计在线监测2.最适温度的确定在发酵过程中，最适发酵温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长和发酵产物的生成。最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。最适发酵温度的选择：在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。温度的选择要参考其它发酵条件。温度的选择还应考虑培养基成分和浓度3.控制：人工或自动控制发酵罐上的控温装置夹套（5M3以下）盘管（蛇管）

（5M3以上）、列管等。【小结】温度对发酵的影响及控制影响控制监测微生物生长;产物合成;培养基物理性质;人工或自动控制发酵罐上的换热装置夹套蛇管列管传感器—温度计发酵过程中温度的变化规律——初期平稳生长期温度快速↑后期逐渐↓Q发酵=Q生物+Q搅拌－Q蒸发－Q辐射在线监测选择题1、在菌体生长和发酵产物生成过程中，温度的变化为（）A、先高后低B、先低后高C、一直不变D、一直升高2、生产菌在生长繁殖过程中产生的热能，叫做（）A、辐射热B、蒸发热C、搅拌热D、生物热3、生物热的大小与菌体的呼吸强度有对应关系，呼吸强度愈大，所产生的生物热（）。A、愈小B不变C愈大D无规律判断题1、微生物其最适生长温度与最适发酵温度是一致的。（

）2、最适发酵温度是既适合菌体的生长、又适合代谢产物合成的温度。（）3、发酵热是引起发酵过程温度变化的主要原因。（）

答案A答案D答案C×

√√六、CO2对发酵的影响及控制P104CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的基质。它是细胞代谢的重要指标。在发酵过程中，CO2有可能对发酵有促进作用，也有可能有抑制作用。（一）CO2对发酵的影响－－双重作用1.影响微生物生长生长因子：如牛链球菌发酵生产多糖，最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。抑制因子：当排气中CO2的浓度高于4%时，微生物的糖代谢和呼吸速率下降。例如，发酵液中CO2的浓度达到1.6×10-2mol，就会严重抑制酵母的生长；2.影响产物的合成：也表现为双重作用——抑制或促进3.影响发酵液的酸碱平衡：

如何影响？（二）CO2的控制：调节通风和搅拌CO2在发酵液中的浓度变化不像溶解氧那样有一定的规律。它的大小受到许多因素的影响，如细胞的呼吸强度、发酵液的流变学特性、通气搅拌程度、罐压大小、设备规模等七、泡沫的影响及控制（一）泡沫的性质泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连通。液膜的稳定性越高，则泡沫越多、越持久。（二）泡沫产生的原因由外界引进的气流被机械地分散形成(通风.搅拌)发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）（三）泡沫对发酵的不利影响降低生产能力（装料系数）；引起原料浪费（逃液）；影响菌体的呼吸（通气搅拌↓）；增加了染菌的机会（逃液）；导致产物的损失（逃液）；消泡剂会给后提取工序带来困难。二、泡沫的消除方法(一)调整培养基的成分、改变工艺等，有限。(二)采用消泡方法：物理消泡和化学消泡1.物理消泡﹠原理：靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收.﹠方法：罐内消沫法；罐外消沫法﹠优点：不需要引进外界物质、节省原材料、