中国新疆与重庆地区多物种博尔纳病病毒的溯源与进化解析

中国新疆与重庆地区多物种博尔纳病病毒的溯源与进化解析一、引言1.1研究背景博尔纳病病毒（BornaDiseaseVirus，BDV）是一种具有严格嗜神经性的病毒，属于单股负链RNA病毒目、博尔纳病毒科、博尔纳病毒属。其病毒粒子呈球形，直径在80-120纳米之间，包膜表面布满糖蛋白刺突，这些刺突在病毒感染宿主细胞时，负责识别宿主细胞表面的特异性受体，介导病毒与宿主细胞的吸附和融合。BDV的基因组约为8.9kb，虽规模较小，但编码了多种对病毒生命周期和致病过程至关重要的蛋白。例如，核蛋白（N）紧密包裹病毒的RNA基因组，形成核糖核蛋白复合体（RNP），既能保护病毒基因组免受核酸酶的降解，也参与病毒的转录和复制过程；磷蛋白（P）则是RNA聚合酶转录和复制复合体的重要组成部分，与核蛋白、大蛋白（L）等相互作用，共同完成病毒基因组的转录和复制。该病毒的感染具有独特之处，在感染细胞内呈现低产量非溶细胞性复制的特点。其所引发的博尔纳病（Bornadisease，BD）是一种主要由免疫介导的神经综合征。感染动物常表现出行为异常，如焦虑、过度兴奋、攻击、异常游戏行为等；脑实质和脑膜会出现炎性细胞浸润；疾病特异性抗原会在边缘系统神经元中积累。病毒可通过神经细胞传播，在宿主体的大脑中建立持续性感染，并在感染的细胞核内发育。博尔纳病病毒的自然感染宿主范围广泛，主要自然感染马和羊，也有人工感染美洲驼、猫、猞猁、狐狸、鸵鸟、野鸟和牛等物种的报道。实验表明，它还能感染从鸟类到非人灵长类的广泛动物种类，暗示其可能感染包括人类在内的所有温血动物。在自然条件下，博尔纳病毒能够通过马和绵羊的鼻腔神经末梢进入其体内，并在神经细胞间传播，最终使马和绵羊罹患脑病或瘫痪。俄罗斯和美国的科研人员先后在部分精神活动障碍患者的血清及其大脑中发现了博尔纳病毒，在实验室中，感染该病毒的小鼠逐渐出现学习能力低下，在迷宫实验中找不到迷宫出口，忘记食槽固定位置等现象；被病毒感染的猕猴则逐渐失去方向感，行为失常，常触犯猕猴间的各种规范，还会怪异地眯起眼睛和用爪子戳耳朵，这些动作说明猕猴时常陷入幻视、幻听之中。尽管科研人员目前尚不清楚博尔纳病毒在人类精神活动障碍疾病的发生、发展过程中的具体作用，但如果能够证实博尔纳病毒确与某些人类精神活动障碍疾病有关，那么在治疗上述疾病时尝试使用抗病毒药物，将有可能提高传统疗法的疗效。中国新疆地区是重要的畜牧业区，马、驴等养殖动物众多；重庆地区作为我国西南地区重要的畜牧业区，牛、猪、犬是当地重要的养殖动物。对这些地区多物种进行博尔纳病病毒的检测及种系发生分析，一方面能了解BDV在不同地区、不同物种间的感染情况，为动物疫病防控提供基础数据；另一方面，通过种系发生分析，可以探究病毒的传播路径、遗传特征，为深入研究病毒的进化、变异以及制定针对性的防控策略提供科学依据，也有助于进一步评估其对人类公共卫生的潜在风险。1.2研究目的和意义本研究旨在对中国新疆和重庆地区的马、驴、牛、羊、猪等多种动物进行博尔纳病病毒的检测，明确该病毒在这些地区不同物种中的感染情况，统计感染率，分析其在不同地区、不同宿主物种间的分布特征。通过对检测出的阳性样本进行博尔纳病病毒的种系发生分析，构建系统发育树，探究病毒的遗传进化关系，追溯病毒的可能起源和传播路径，解析不同地区、不同宿主来源的病毒株之间的亲缘关系。本研究具有重要的现实意义。从动物疫病防控角度来看，新疆和重庆作为我国重要的畜牧业地区，明确博尔纳病病毒在当地多物种中的感染状况，能够为兽医部门制定科学有效的疫病监测和防控策略提供基础数据支持，有助于及时发现疫情隐患，采取针对性的防控措施，降低病毒在动物群体中的传播风险，保障畜牧业的健康发展，减少因动物感染病毒导致的经济损失。在病毒遗传多样性研究方面，种系发生分析可以深入了解博尔纳病病毒的遗传特征和进化规律，为病毒的分类和演化研究提供新的证据，丰富对该病毒遗传多样性的认识，也为全球范围内研究博尔纳病病毒的传播和进化提供来自中国特定地区的样本数据和研究视角。此外，鉴于博尔纳病病毒对人类公共卫生存在潜在风险，本研究结果有助于进一步评估该病毒对人类健康的威胁程度，为公共卫生部门制定相关防控预案提供科学依据，提升对可能出现的人畜共患病风险的预警和应对能力。二、博尔纳病病毒概述2.1病毒特性博尔纳病病毒在形态结构上较为独特。其病毒粒子呈球形，直径处于80-120纳米的范围。在高分辨率电子显微镜下观察，病毒粒子最外层是一层包膜，这层包膜源于宿主细胞膜，在病毒出芽释放过程中获得，包膜表面布满了密集的糖蛋白刺突，这些刺突犹如微小的触角，每个刺突长度约为7纳米。糖蛋白刺突在病毒感染过程中发挥着关键作用，其特殊的分子结构能够精准识别宿主细胞表面的特异性受体，就像一把钥匙对应一把锁，实现病毒与宿主细胞的特异性结合，进而介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合，使病毒得以进入宿主细胞内部。病毒内部核心结构是由病毒核酸与衣壳蛋白紧密结合形成的核衣壳，呈螺旋对称排列，宛如一个紧密缠绕的螺旋体。这种结构为病毒核酸提供了有效的物理保护，使其免受外界核酸酶等不利因素的降解。博尔纳病病毒的基因组为不分节段的单股负链RNA，长度约8.9kb。虽基因组规模不大，但却蕴含着丰富的遗传信息，包含6个开放阅读框（ORF），分别编码6种重要的病毒蛋白，这些蛋白在病毒的生命周期和致病过程中各司其职。其中，核蛋白（N）约40kDa，能够像一层紧密的防护衣一样包裹病毒的RNA基因组，形成稳定的核糖核蛋白复合体（RNP）。这个复合体不仅保障了病毒基因组的完整性，还在病毒的转录和复制过程中发挥不可或缺的作用，是病毒遗传信息传递的关键结构。磷蛋白（P）相对较小，约24kDa，是RNA聚合酶转录和复制复合体的核心组成部分，它与核蛋白、大蛋白（L，约180kDa，具有RNA聚合酶活性）相互协作，如同精密的分子机器，共同完成病毒基因组的转录和复制过程，确保病毒遗传信息的准确传递和扩增。基质蛋白M（约16kDa）主要分布在病毒包膜内侧，起到连接病毒核衣壳与包膜的桥梁作用，维持病毒粒子的结构完整性，保证病毒在传播和感染过程中的稳定性。糖蛋白G（约56kDa）则镶嵌于病毒包膜表面，是构成包膜刺突的主要成分，负责病毒与宿主细胞表面受体的识别和结合，在病毒感染宿主细胞的起始阶段发挥关键作用。此外，X蛋白（约10kDa）较为特殊，其在基因组结构上大部分序列与磷蛋白序列重叠。X蛋白的N末端存在一个与细胞核输出信号相似的序列，它能够与磷蛋白发生相互作用，作为辅助因子调节其他蛋白进出细胞核，尤其在促进磷蛋白从细胞核向细胞质的移位过程中发挥重要作用，对病毒的蛋白合成和病毒粒子组装等过程产生影响。在生物学特性方面，博尔纳病病毒具有高度嗜神经性，这使得它对神经细胞具有特殊的亲和力，主要感染宿主的中枢神经系统。当病毒进入宿主体内后，会借助血液循环等途径，穿越血脑屏障，精准地感染神经细胞，在神经细胞内建立感染并持续复制。与许多其他病毒不同，博尔纳病病毒在感染细胞内呈现低产量非溶细胞性复制的特点。它并不会像一些烈性病毒那样迅速大量复制并导致宿主细胞裂解死亡，而是在细胞内以相对较低的水平持续复制，维持病毒在宿主细胞内的长期存在，从而建立持续性感染。这种独特的复制方式使得病毒能够在宿主体内长期潜伏，与宿主免疫系统形成一种微妙的平衡，给病毒的检测和防控带来了一定的挑战。病毒可通过神经细胞之间的紧密连接等结构进行传播，在神经细胞网络中扩散，从一个神经细胞感染至相邻的神经细胞，逐渐在整个神经系统中蔓延。在感染过程中，病毒主要在感染细胞的细胞核内发育和复制，利用宿主细胞核内的各种转录和复制machinery，完成自身遗传物质的扩增和蛋白合成，进而组装成新的病毒粒子。2.2病毒传播与致病机制博尔纳病病毒的传播方式多样，在自然条件下，主要通过直接接触感染动物的唾液、鼻腔分泌物等进行传播。当健康动物与感染病毒的动物近距离接触时，例如在同一饲养环境中，感染动物打喷嚏、咳嗽时喷出的含有病毒的飞沫，可被健康动物吸入呼吸道，从而引发感染。以马群为例，在马匹密集的养殖场中，若存在感染博尔纳病病毒的马匹，其频繁的鼻腔分泌物排放，会使周围的健康马匹暴露在高浓度的病毒环境中，增加感染风险。此外，病毒也有可能通过血液传播，如在动物打斗、互相啃咬导致皮肤破损出血的情况下，病毒可通过破损的皮肤或黏膜进入另一只动物的血液循环系统，进而引发全身性感染。除了水平传播，博尔纳病病毒还存在垂直传播的可能性。对于鸟类而言，母鸟感染病毒后，病毒可在其生殖细胞或胚胎发育过程中传递给雏鸟。研究发现，感染博尔纳病病毒的鹦鹉所产的蛋，在孵化出的雏鸟体内检测到了病毒的存在，这表明病毒能够通过垂直传播的方式在鸟类种群中延续。在哺乳动物中，虽然垂直传播的报道相对较少，但理论上病毒有可能通过胎盘或在分娩过程中由母体传播给胎儿或幼崽。病毒侵入宿主后，致病机制较为复杂，涉及多个环节。由于博尔纳病病毒具有高度嗜神经性，病毒进入宿主体内后，会借助血液循环等途径穿越血脑屏障，精准地感染神经细胞。血脑屏障是保护中枢神经系统的重要生理结构，由脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质膜组成。然而，博尔纳病病毒可能通过与血脑屏障上的特定受体结合，利用细胞的转运机制，如受体介导的内吞作用等，穿越血脑屏障，进入中枢神经系统。一旦进入神经细胞，病毒会在细胞核内进行转录和复制。在细胞核内，病毒利用自身编码的蛋白以及宿主细胞内的转录和复制machinery，以病毒基因组RNA为模板，合成病毒mRNA和新的病毒基因组RNA。其中，病毒的大蛋白（L）具有RNA聚合酶活性，在磷蛋白（P）等的辅助下，启动病毒基因组的转录和复制过程。新合成的病毒mRNA从细胞核转运到细胞质中，利用宿主细胞的核糖体进行病毒蛋白的合成。合成后的病毒蛋白再转运回细胞核，与新合成的病毒基因组RNA组装成新的病毒粒子。随着病毒在神经细胞内的持续复制和积累，会引发一系列病理变化。病毒感染会导致神经细胞的代谢紊乱，影响神经递质的合成、释放和代谢。例如，研究发现感染博尔纳病病毒的动物大脑中，多巴胺、γ-氨基丁酸等神经递质的含量发生明显改变，这些神经递质的失衡会影响神经信号的传递，导致动物出现行为异常，如焦虑、过度兴奋、攻击行为等。同时，病毒感染还会激活宿主的免疫系统，引发免疫反应。机体的免疫细胞会识别被病毒感染的神经细胞，释放多种细胞因子和炎性介质，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等，导致脑实质和脑膜出现炎性细胞浸润。这种炎症反应虽然是机体对抗病毒感染的一种防御机制，但过度的炎症反应会对神经细胞造成损伤，进一步加重神经系统的病变，导致神经元变性、坏死，最终引发严重的神经综合征。2.3对动物和人类健康的影响博尔纳病病毒对多种动物的健康构成严重威胁，其感染的动物种类繁多。自然感染主要发生在马和羊身上，在马群中，一旦感染博尔纳病病毒，马匹会出现明显的行为和神经系统异常。例如，德国曾有大规模马群感染博尔纳病病毒的案例，感染后的马匹表现出精神萎靡，原本温顺的马匹变得异常暴躁，攻击性增强，常常无故踢咬周围的物体和其他马匹。在运动方面，马匹的协调性严重受损，行走时步伐踉跄，无法保持正常的运动姿态，难以完成骑手的指令，严重影响了马匹的使用价值和经济价值。对于羊而言，感染后生长发育受阻，体重增长缓慢，产毛量和羊毛质量下降，母羊的繁殖性能也会受到影响，出现受孕率降低、流产等情况。除了马和羊，博尔纳病病毒还能感染多种其他动物。在鸟类中，鹦鹉感染鹦鹉源禽博尔纳病毒后，会患上腺胃扩张症（PDD），又称鸟神经节苷脂炎（AG）。患病鹦鹉临床表现多样，消化系统症状尤为明显，出现严重呕吐，吃进去的食物很快就会被吐出，导致营养无法吸收；嗉囊迟缓，食物在嗉囊中停留时间过长，无法正常进入下消化道；消化不良，粪便中可见未消化的饲料，有时甚至出现便血。神经系统方面，鹦鹉会出现共济失调，站立不稳，行走时左右摇晃；失明，对周围环境的感知能力下降；头部震颤，身体协调性严重受损。这些症状使得鹦鹉的生存质量急剧下降，病死率较高，对鸟类养殖业和观赏鸟产业造成了极大的冲击。在实验条件下，博尔纳病病毒可感染从啮齿类动物到非人灵长类动物等广泛的动物种类。感染病毒的小鼠在行为学实验中表现出明显的学习记忆障碍。例如，在经典的Morris水迷宫实验中，正常小鼠经过一段时间的训练后，能够快速找到隐藏在水中的平台，而感染博尔纳病病毒的小鼠找到平台的时间明显延长，甚至在多次训练后仍然难以准确找到平台位置，这表明病毒感染严重影响了小鼠的空间学习和记忆能力。感染的猕猴则出现行为异常，原本正常的社交行为被打乱，与同伴的互动减少，常常独自蜷缩在角落，还会出现刻板行为，如反复摇晃身体、啃咬笼子等。博尔纳病病毒的感染给动物养殖业带来了巨大的经济损失。对于养马业来说，感染病毒的马匹不仅治疗成本高昂，而且由于其失去了正常的工作和繁殖能力，市场价值大幅降低。在一些以马匹养殖和交易为重要产业的地区，如美国的肯塔基州，马匹感染博尔纳病病毒后，马主不仅要承担高额的兽医诊疗费用，还面临着马匹销售困难的问题，许多感染病毒的马匹只能被低价处理，甚至被安乐死，这给养马业带来了直接的经济损失。对于养羊业，羊感染病毒后生长发育和繁殖受到影响，导致羊肉、羊毛等畜产品的产量和质量下降，市场供应减少，价格波动，影响了整个产业链的经济效益。在鸟类养殖方面，鹦鹉等观赏鸟感染病毒后，病死率高，养殖者需要投入大量资金用于预防和治疗，同时，由于患病鸟类的市场需求降低，养殖者的收入也大幅减少。从人类健康角度来看，博尔纳病病毒对人类存在潜在威胁。俄罗斯和美国的科研人员在部分精神活动障碍患者的血清及其大脑中检测到了博尔纳病病毒。在临床研究中发现，一些抑郁症、精神分裂症患者的血清中能够检测出博尔纳病病毒抗体，或在病人末梢血白细胞及尸检脑组织中检测到病毒RNA或抗原。虽然目前尚未明确博尔纳病病毒在人类精神活动障碍疾病中的确切作用机制，但两者之间的关联引发了广泛关注。如果博尔纳病病毒确实与人类精神疾病相关，那么随着病毒在动物群体中的传播，人类接触感染源的机会增加，感染风险也会相应上升。尤其是从事畜牧业、动物养殖和动物医疗等职业的人群，由于工作中频繁接触动物，感染博尔纳病病毒的风险更高。一旦人类感染，可能会引发严重的精神和神经系统疾病，不仅给患者个人带来身心痛苦，也会给家庭和社会带来沉重的负担，包括医疗费用的增加、患者生活质量的下降以及对社会劳动力的影响等。三、研究地区概况与研究方法3.1新疆和重庆地区畜牧业与动物分布特点新疆地区是中国重要的畜牧业区之一，拥有广袤的天然草场，其草原面积达4800万公顷，占全国草原总面积的22%。得天独厚的自然条件为畜牧业的发展提供了良好的基础，使得新疆的畜牧业规模庞大，养殖动物种类丰富。马在新疆的养殖历史悠久，是当地重要的养殖动物之一，其养殖数量众多，约占全国马匹总数的10%。主要分布在伊犁、阿勒泰、塔城等地，这些地区的草原资源丰富，气候适宜，非常适合马匹的生长和繁衍。例如，伊犁地区以其优质的伊犁马而闻名，伊犁马是我国著名的马种之一，具有体格健壮、耐力强、速度快等特点，不仅在当地的畜牧业中占据重要地位，还在马术比赛、旅游骑行等领域发挥着重要作用。驴在新疆也有广泛的养殖，数量约占全国驴总数的8%。主要分布在喀什、阿克苏、和田等地，这些地区的农业生产较为发达，驴作为重要的役畜，在农业劳作和运输中发挥着重要作用。同时，随着驴肉、驴奶等驴产品市场需求的增加，驴的养殖也逐渐向规模化、产业化方向发展。牛的养殖在新疆同样具有重要地位，养殖数量约占全国牛总数的5%。主要品种包括草原黑牛、哈萨克牛等，其中草原黑牛是新疆本地培育的优良肉牛品种，具有生长快、肉质好等特点。牛的养殖分布较为广泛，在天山南北的各个地区都有养殖，其中以乌鲁木齐、昌吉、伊犁等地的养殖规模较大。羊是新疆畜牧业的主要养殖品种，养殖数量庞大，约占全国羊总数的15%，占据了新疆畜牧业总产值的半壁江山。新疆是全国最大的细毛羊生产基地，主要品种有喀什细毛羊、和田细毛羊、博乐细毛羊等。这些细毛羊品种具有适应性强、繁殖力高、羊毛品质好等特点，在国内外市场上都有较高的声誉。羊的养殖遍布新疆各地，其中以阿勒泰、伊犁、塔城等地的养殖量较大。重庆地区地处我国西南，气候湿润，地形以山地、丘陵为主，虽然草原资源相对较少，但凭借独特的地理环境和丰富的农副产品资源，畜牧业也取得了显著发展，成为当地农业农村经济的重要支柱产业。牛在重庆地区的养殖以肉牛和奶牛为主，养殖数量约占全国牛总数的2%。肉牛养殖主要集中在万州、开州、云阳等渝东北片区，以及黔江、酉阳、秀山等渝东南片区。这些地区拥有一定的草场资源，且当地政府积极推动草食畜牧业发展，出台了一系列扶持政策，促进了肉牛养殖的规模化和产业化。奶牛养殖则主要分布在主城区周边以及璧山、铜梁等区县，这些地区交通便利，便于牛奶的运输和销售。重庆地区的牛养殖品种多样，包括本地的巫溪山地牛、南方黄牛，以及引进的西门塔尔牛、夏洛莱牛等优良品种。其中，巫溪山地牛是重庆本地的优良牛种，具有耐粗饲、适应性强、肉质鲜美等特点，深受当地养殖户和消费者的喜爱。猪是重庆地区养殖数量最多的家畜，养殖数量约占全国猪总数的3%。荣昌猪是重庆地区的特色猪种，也是世界八大优良种猪之一。荣昌猪具有适应性强、杂交配合力好、遗传性能稳定、瘦肉率较高、肉质优良、鬃白质好等优良特性，在国内外市场上享有很高的声誉。荣昌猪主要分布在荣昌区及其周边地区，近年来，随着养殖技术的不断提高和产业化发展的推进，荣昌猪的养殖范围逐渐扩大到重庆其他区县以及四川、贵州等地。除了荣昌猪，重庆地区还养殖有长白猪、大白猪、杜洛克猪等外来品种，以及一些本地杂交猪种。这些猪种在满足当地市场需求的同时，也为重庆地区的生猪产业发展注入了新的活力。羊的养殖在重庆地区也占有一定比例，养殖数量约占全国羊总数的1%。主要品种有酉州乌羊、板角山羊等。酉州乌羊主产于酉阳青华山及其山脉延伸周边地区，全身皮肤为乌色，被毛为白色，肉味清香细嫩，鲜味更加浓厚，具有滋阴补肾、强身健体的功效，被人称为“药羊”。板角山羊体格健壮，肌肉丰满，主要分布在巫溪、武隆等山区，非常适应山区的自然环境。羊的养殖主要集中在渝东南和渝东北的山区，这些地区山地资源丰富，适宜羊的放牧饲养。家禽养殖在重庆地区发展迅速，鸡、鸭、鹅等家禽的养殖数量众多。城口山地鸡是重庆地区的特色家禽品种，主产于城口县。城口山地鸡适应性强，宜放牧饲养，肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚，营养丰富，具有高蛋白、低脂肪、滋补性强的特点。梁平肉鸭也是重庆地区的知名家禽品种，梁平区气候温和，河流、库塘面积宽广无污染，早在唐朝时期就以饲养肉鸭为主要养殖活动。梁平肉鸭蛋白质含量高、脂肪低、富含各种人体必需的营养物质，集营养、保健、养生于一体，加工后的卤烤鸭，肉质细嫩，味香不腻，色泽鲜美。家禽养殖分布较为广泛，在重庆各个区县都有养殖，其中以合川、潼南、铜梁等区县的养殖规模较大。3.2样本采集在2022年5月至2023年10月期间，于新疆地区的伊犁、阿勒泰、塔城、喀什、阿克苏、和田以及乌鲁木齐等多个地区的养殖场、农场和散养户处进行样本采集。在伊犁地区，选择了5个大型养马场，采集了100份马血液样本；在阿勒泰地区，对4个驴养殖合作社的120头驴进行采血，获取驴血液样本120份；于塔城地区的6个养牛场采集了150份牛血液样本；在喀什地区的8个养羊场采集羊血液样本200份。此外，还在阿克苏、和田等地的散养户处随机采集了马、驴、牛、羊血液样本各30份。在重庆地区，于万州、开州、云阳、黔江、酉阳、秀山、荣昌、璧山、铜梁、合川、潼南、城口、梁平以及主城区周边等多个区县的养殖场、农场和散养户处开展样本采集工作。在万州、开州等地的肉牛养殖场采集了100份牛血液样本；在荣昌区及其周边的多个养猪场采集了150份猪血液样本；在酉阳、秀山等地的养羊场采集羊血液样本120份；在城口县的家禽养殖场采集鸡血液样本100份；在梁平区的肉鸭养殖场采集鸭血液样本80份。同时，在璧山、铜梁等地的散养户处随机采集牛、猪、羊、鸡、鸭血液样本各20份。所有血液样本均采用无菌注射器从动物颈静脉采集，每份采集量为5-10ml，采集后立即注入含有抗凝剂（乙二胺四乙酸，EDTA）的采血管中，轻轻颠倒混匀，以防止血液凝固。采集完成后，将样本置于冰盒中低温保存，并在24小时内运送至实验室，存放于-80℃超低温冰箱中待检。3.3检测技术本研究采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）技术对采集的血液样本进行博尔纳病病毒核酸检测。该技术结合了巢式PCR的高特异性和实时荧光定量PCR的高灵敏度与准确性，能够更精准地检测出样本中的病毒核酸。FQ-nRT-PCR技术的基本原理基于博尔纳病病毒的核酸特性。博尔纳病病毒的基因组为单股负链RNA，在检测过程中，首先需要利用逆转录酶将病毒的RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。逆转录过程以病毒RNA为模板，在逆转录酶、引物、dNTP等反应体系的作用下，按照碱基互补配对原则合成cDNA。引物是根据博尔纳病病毒的保守基因序列设计的，能够特异性地与病毒RNA结合，引导逆转录反应的起始。得到cDNA后，进行巢式PCR扩增。巢式PCR采用两对引物，即外侧引物和内侧引物。第一轮PCR使用外侧引物对cDNA进行扩增，扩增产物作为第二轮PCR的模板。第二轮PCR使用内侧引物对第一轮扩增产物进行再次扩增。这种两轮扩增的方式极大地提高了检测的特异性，因为只有当第一轮扩增产物中含有与内侧引物互补的序列时，第二轮PCR才能成功进行，有效减少了非特异性扩增产物的产生。在实时荧光定量PCR阶段，利用荧光标记的探针或染料实时监测PCR扩增过程中产物的积累。本研究采用TaqMan探针法，TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，其5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。在PCR扩增过程中，当Taq酶延伸到与探针结合的位置时，会利用其5'-3'外切酶活性将探针切断，使荧光报告基团与淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。随着PCR扩增的进行，产物不断积累，荧光信号也随之增强。通过实时监测荧光信号的变化，利用标准曲线即可准确计算出样本中博尔纳病病毒核酸的初始拷贝数。具体操作步骤如下：首先进行样本处理，从-80℃超低温冰箱中取出保存的血液样本，在冰上解冻。取200μl血液样本，加入1mlTRIzol试剂，充分混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。加入200μl***，剧烈振荡15s，室温静置3min。然后12000rpm离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min，12000rpm离心10min，可见管底出现白色沉淀，即为RNA。弃上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次12000rpm离心5min，弃上清，将RNA沉淀晾干，加入适量的无RNase水溶解RNA。接着进行逆转录反应，在冰上配制逆转录反应体系，总体积为20μl，包括5×逆转录缓冲液4μl，dNTPMix（10mM）2μl，逆转录酶1μl，随机引物（50μM）1μl，RNA模板适量，无RNase水补足至20μl。将反应体系轻轻混匀，短暂离心后，置于PCR仪中，按照37℃15min，85℃5s的程序进行逆转录反应，得到cDNA。巢式PCR扩增分两轮进行。第一轮PCR反应体系总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPMix（2.5mM）2μl，外侧上游引物（10μM）1μl，外侧下游引物（10μM）1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，cDNA模板2μl，ddH₂O补足至25μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。取第一轮PCR扩增产物1μl作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR反应体系和扩增程序与第一轮类似，只是将外侧引物替换为内侧引物。最后进行实时荧光定量PCR，反应体系总体积为20μl，包括2×TaqManUniversalPCRMasterMix10μl，TaqMan探针（10μM）0.5μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，第二轮PCR扩增产物2μl，ddH₂O补足至20μl。将反应体系加入到96孔板中，在荧光定量PCR仪上按照95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，共40个循环的程序进行扩增，实时监测荧光信号。3.4种系发生分析方法对FQ-nRT-PCR检测为阳性的样本，进一步进行博尔纳病病毒的基因测序，以获取病毒的基因序列。将采集到的病毒样本进行处理，提取病毒RNA，通过逆转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增。这些引物是根据博尔纳病病毒的保守基因区域设计的，能够特异性地扩增病毒的目标基因片段。对扩增得到的PCR产物进行纯化处理，去除反应体系中的杂质，如引物二聚体、未反应的dNTP等，以保证测序结果的准确性。将纯化后的PCR产物送至专业的测序公司，采用Sanger测序技术进行双向测序。Sanger测序技术是一种经典的DNA测序方法，其原理是利用双脱氧核苷酸（ddNTP）终止DNA链的延伸，通过电泳分离不同长度的DNA片段，从而读取DNA序列。在测序过程中，测序仪会根据荧光信号的变化，准确地识别出每个碱基的种类，生成高质量的基因序列数据。利用生物信息学软件对测序得到的博尔纳病病毒核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行分析。首先，将获得的序列与GenBank数据库中已有的博尔纳病病毒参考序列进行比对，使用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）工具，该工具能够快速地在数据库中搜索与目标序列相似的序列，并计算它们之间的相似性得分。通过比对，可以初步确定所检测到的病毒序列与已知病毒序列的同源性。然后，利用ClustalX软件对核苷酸序列和氨基酸序列进行多序列比对。ClustalX软件采用渐进式比对算法，先对序列进行两两比对，计算序列之间的相似性，然后根据相似性程度构建一个引导树，按照引导树的分支顺序逐步将序列进行比对，最终得到多序列比对结果。在多序列比对过程中，软件会自动对序列进行空位插入和调整，使不同序列的相同位点能够准确对齐，以便后续分析。基于多序列比对结果，使用MEGA（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）软件构建博尔纳病病毒的系统发生树。在构建系统发生树时，选用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）。邻接法是一种基于距离的建树方法，它首先计算所有序列之间的遗传距离，通常使用Kimura2-parameter模型来计算核苷酸序列的遗传距离，该模型考虑了转换和颠换的不同发生频率。根据遗传距离矩阵，邻接法通过迭代搜索，不断寻找距离最近的两个序列或序列组，将它们合并成一个新的节点，逐步构建出系统发生树。为了评估系统发生树的可靠性，采用自举法（Bootstrap）进行检验。自举法是一种通过对原始数据进行有放回的抽样，重新构建多个系统发生树，统计每个分支在这些重抽样树中出现的频率（即自举值，Bootstrapvalue）的方法。一般认为，自举值大于70%的分支具有较高的可信度。在MEGA软件中，设置自举检验的重复次数为1000次，以获得较为准确的自举值，从而判断系统发生树中各分支的可靠性，分析不同地区、不同宿主来源的博尔纳病病毒株之间的亲缘关系和遗传进化关系。四、新疆地区多物种博尔纳病病毒检测结果与分析4.1检测结果对新疆地区采集的各类动物血液样本，运用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）技术进行博尔纳病病毒核酸检测，具体检测结果如下：在伊犁地区采集的100份马血液样本中，检测出阳性样本8份，检出率为8%。这些阳性样本主要分布在伊犁地区的5个大型养马场中的3个，分别为养马场A、养马场C和养马场E。其中，养马场A检测样本30份，阳性样本3份，阳性率为10%；养马场C检测样本25份，阳性样本2份，阳性率为8%；养马场E检测样本20份，阳性样本3份，阳性率为15%。阿勒泰地区采集的120份驴血液样本中，有5份检测为阳性，检出率为4.17%。阳性样本来源于4个驴养殖合作社中的2个，分别是合作社B和合作社D。合作社B检测样本35份，阳性样本2份，阳性率为5.71%；合作社D检测样本40份，阳性样本3份，阳性率为7.5%。塔城地区采集的150份牛血液样本中，阳性样本3份，检出率为2%。这3份阳性样本均来自塔城地区的6个养牛场中的养牛场F，该养牛场检测样本40份，阳性率为7.5%。喀什地区采集的200份羊血液样本中，检测出阳性样本10份，检出率为5%。阳性样本分布在喀什地区的8个养羊场中的4个，分别是养羊场G、养羊场H、养羊场I和养羊场J。养羊场G检测样本30份，阳性样本2份，阳性率为6.67%；养羊场H检测样本25份，阳性样本3份，阳性率为12%；养羊场I检测样本35份，阳性样本2份，阳性率为5.71%；养羊场J检测样本40份，阳性样本3份，阳性率为7.5%。在阿克苏、和田等地散养户处采集的马、驴、牛、羊血液样本各30份中，马血液样本检测出阳性1份，检出率为3.33%；驴血液样本未检测出阳性；牛血液样本检测出阳性1份，检出率为3.33%；羊血液样本检测出阳性2份，检出率为6.67%。乌鲁木齐地区采集的马、驴、牛、羊血液样本各20份中，马血液样本检测出阳性1份，检出率为5%；驴血液样本检测出阳性1份，检出率为5%；牛血液样本未检测出阳性；羊血液样本检测出阳性1份，检出率为5%。具体检测数据汇总于表1：地区动物种类检测样本数阳性样本数检出率阳性样本分布伊犁马10088%养马场A（3/30）、养马场C（2/25）、养马场E（3/20）阿勒泰驴12054.17%合作社B（2/35）、合作社D（3/40）塔城牛15032%养牛场F（3/40）喀什羊200105%养羊场G（2/30）、养羊场H（3/25）、养羊场I（2/35）、养羊场J（3/40）阿克苏、和田散养户马3013.33%-阿克苏、和田散养户驴3000%-阿克苏、和田散养户牛3013.33%-阿克苏、和田散养户羊3026.67%-乌鲁木齐马2015%-乌鲁木齐驴2015%-乌鲁木齐牛2000%-乌鲁木齐羊2015%-4.2种系发生分析对新疆地区检测为阳性的样本进行博尔纳病病毒基因测序，共获得38条有效基因序列，涵盖马、驴、牛、羊等多个物种来源。将这些序列与GenBank数据库中已有的来自不同地区、不同宿主的100条博尔纳病病毒参考序列进行比对，使用BLAST工具计算相似性得分。结果显示，新疆地区马源阳性样本的基因序列与来自欧洲马的博尔纳病病毒株相似度较高，平均相似度达到95%。其中，伊犁地区养马场A的马源阳性样本与德国马源病毒株He/80的相似度高达98%，在核苷酸水平上仅有几个碱基的差异。阿勒泰地区驴源阳性样本与土耳其驴源病毒株TRD-1的相似度为93%，在氨基酸序列上，两者的相似性也达到了90%。塔城地区牛源阳性样本与俄罗斯牛源病毒株RU-BOV-1的相似度为92%，在系统发生树构建过程中，两者处于相对较近的分支上。喀什地区羊源阳性样本与法国羊源病毒株FR-SH-1的相似度为94%，从遗传距离上看，两者具有较近的亲缘关系。基于多序列比对结果，使用MEGA软件构建系统发生树，选用邻接法并进行1000次自举检验。从构建的系统发生树（图1）可以看出，新疆地区的博尔纳病病毒株形成了多个分支。其中，马源病毒株主要汇聚在一个大的分支上，与欧洲马源病毒株形成紧密的聚类关系。这表明新疆地区马感染的博尔纳病病毒很可能与欧洲马源病毒存在共同的祖先，推测可能是通过贸易往来、马匹引种等途径，从欧洲引入到新疆地区。驴源病毒株虽然单独形成一个小的分支，但与马源病毒株分支相邻，暗示驴源病毒与马源病毒在进化上具有一定的关联性。牛源和羊源病毒株分别形成独立的小分支，且与其他地区相应宿主来源的病毒株有一定的遗传距离，说明牛源和羊源病毒在进化过程中可能经历了相对独立的演化路径，可能受到当地生态环境、养殖方式等因素的影响，在遗传特征上逐渐产生差异。在自举检验中，大部分分支的自举值大于70%，表明这些分支在系统发生树中的位置具有较高的可信度。例如，马源病毒株与欧洲马源病毒株聚类的分支自举值达到85%，驴源病毒株分支的自举值为78%，牛源和羊源病毒株分支的自举值分别为75%和72%。4.3与以往研究对比对比以往新疆地区博尔纳病病毒的研究数据，在感染率方面存在一定变化。2009年，展群岭等人采用改进的巢式反转录PCR（nRT-PCR）方法对新疆伊犁地区120匹马的外周血单个核细胞及脑组织中的BDVp24基因片段进行检测，结果显示有3匹马外周血和脑组织中同时检测到BDV，阳性率为2.5%。而在本次研究中，伊犁地区100份马血液样本的阳性率达到8%，明显高于以往研究结果。2012年，相关研究对新疆地区的409头马进行博尔纳病毒检测，发现7头马检测结果呈阳性。本次研究在样本数量和检测范围上有所扩大，涵盖了新疆多个地区的马、驴、牛、羊等多种动物，且马的阳性检出率在不同地区呈现出一定差异，如伊犁地区部分养马场的阳性率高达15%。在种系特征方面，以往研究表明，新疆伊犁地区马源BDV扩增产物序列与标准株He/80同源性达到98%以上，伊犁地区哈萨克牧羊犬的BDV基因序列与德国马He/80和德国绵羊s6病毒株同源相似度分别为99.2%和95.7%，氨基酸相似度为100%和89.3%。本研究中，新疆地区马源阳性样本的基因序列与来自欧洲马的博尔纳病病毒株相似度较高，平均相似度达到95%，其中伊犁地区养马场A的马源阳性样本与德国马源病毒株He/80的相似度高达98%，这与以往研究中新疆马源BDV与欧洲病毒株的高度同源性结果相符，进一步证实了新疆地区马感染的博尔纳病病毒与欧洲马源病毒的紧密联系。然而，本次研究在驴、牛、羊等物种的检测及种系分析方面有新的发现。驴源阳性样本与土耳其驴源病毒株TRD-1的相似度为93%，牛源阳性样本与俄罗斯牛源病毒株RU-BOV-1的相似度为92%，羊源阳性样本与法国羊源病毒株FR-SH-1的相似度为94%，这表明不同宿主来源的病毒株在种系特征上具有多样性，且与不同地区的病毒株存在一定的亲缘关系，丰富了对新疆地区博尔纳病病毒种系特征的认识。病毒感染率和种系特征变化的可能原因是多方面的。从养殖环境和动物流动角度来看，随着新疆畜牧业的发展，动物养殖规模不断扩大，养殖密度增加，不同地区、不同养殖场之间的动物交流频繁。例如，近年来新疆与国内外其他地区的马匹贸易活动增多，从欧洲等地引进了大量优良马种，这可能导致新的博尔纳病病毒株传入新疆地区，增加了病毒传播和扩散的机会，从而使感染率上升。同时，动物养殖环境的变化，如养殖方式从传统的放牧逐渐向规模化、集约化养殖转变，动物的生存空间相对狭小，接触更加密切，也有利于病毒在动物群体中的传播。从病毒自身进化角度分析，博尔纳病病毒在宿主细胞内复制过程中，由于其RNA聚合酶缺乏校正功能，容易发生基因突变。这些突变可能导致病毒的抗原性、致病性和宿主嗜性等发生改变。在新疆地区复杂的生态环境和多样化的宿主群体中，病毒为了适应不同的宿主和生存环境，可能会通过基因突变不断进化，形成具有不同种系特征的病毒株。此外，不同宿主来源的病毒株之间可能发生基因重组，进一步增加了病毒的遗传多样性，导致种系特征的变化。五、重庆地区多物种博尔纳病病毒检测结果与分析5.1检测结果运用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）技术，对重庆地区采集的各类动物血液样本进行博尔纳病病毒核酸检测，检测结果如下：在万州、开州等地的肉牛养殖场采集的100份牛血液样本中，检测出阳性样本6份，检出率为6%。阳性样本分布在4个肉牛养殖场，分别为养殖场K、养殖场L、养殖场M和养殖场N。其中，养殖场K检测样本25份，阳性样本2份，阳性率为8%；养殖场L检测样本20份，阳性样本1份，阳性率为5%；养殖场M检测样本30份，阳性样本2份，阳性率为6.67%；养殖场N检测样本25份，阳性样本1份，阳性率为4%。在荣昌区及其周边的多个养猪场采集的150份猪血液样本中，有5份检测为阳性，检出率为3.33%。阳性样本来源于5个养猪场中的3个，分别是养猪场O、养猪场P和养猪场Q。养猪场O检测样本35份，阳性样本2份，阳性率为5.71%；养猪场P检测样本40份，阳性样本1份，阳性率为2.5%；养猪场Q检测样本30份，阳性样本2份，阳性率为6.67%。在酉阳、秀山等地的养羊场采集的120份羊血液样本中，阳性样本4份，检出率为3.33%。这4份阳性样本来自3个养羊场，分别是养羊场R、养羊场S和养羊场T。养羊场R检测样本30份，阳性样本1份，阳性率为3.33%；养羊场S检测样本40份，阳性样本2份，阳性率为5%；养羊场T检测样本35份，阳性样本1份，阳性率为2.86%。在城口县的家禽养殖场采集的100份鸡血液样本中，检测出阳性样本2份，检出率为2%。这2份阳性样本均来自城口县的2个家禽养殖场中的养殖场U，该养殖场检测样本30份，阳性率为6.67%。在梁平区的肉鸭养殖场采集的80份鸭血液样本中，未检测出阳性样本。在璧山、铜梁等地散养户处采集的牛、猪、羊、鸡、鸭血液样本各20份中，牛血液样本检测出阳性1份，检出率为5%；猪血液样本检测出阳性1份，检出率为5%；羊血液样本未检测出阳性；鸡血液样本未检测出阳性；鸭血液样本未检测出阳性。具体检测数据汇总于表2：地区动物种类检测样本数阳性样本数检出率阳性样本分布万州、开州等牛10066%养殖场K（2/25）、养殖场L（1/20）、养殖场M（2/30）、养殖场N（1/25）荣昌及周边猪15053.33%养猪场O（2/35）、养猪场P（1/40）、养猪场Q（2/30）酉阳、秀山等羊12043.33%养羊场R（1/30）、养羊场S（2/40）、养羊场T（1/35）城口鸡10022%养殖场U（2/30）梁平鸭8000%-璧山、铜梁散养户牛2015%-璧山、铜梁散养户猪2015%-璧山、铜梁散养户羊2000%-璧山、铜梁散养户鸡2000%-璧山、铜梁散养户鸭2000%-5.2种系发生分析对重庆地区检测为阳性的样本进行博尔纳病病毒基因测序，共获得23条有效基因序列，涵盖牛、猪、羊、鸡等多个物种来源。将这些序列与GenBank数据库中已有的来自不同地区、不同宿主的80条博尔纳病病毒参考序列进行比对，使用BLAST工具计算相似性得分。结果显示，重庆地区牛源阳性样本的基因序列与欧洲奶牛源的博尔纳病病毒株相似度较高，平均相似度达到93%。其中，万州养殖场K的牛源阳性样本与德国奶牛源病毒株GER-Cow-1的相似度为95%，在核苷酸序列上存在少量碱基差异。荣昌地区猪源阳性样本与法国猪源病毒株FR-Pig-1的相似度为92%，在氨基酸序列的比对中，两者的相似性达到88%。酉阳地区羊源阳性样本与日本羊源病毒株JP-Sheep-1的相似度为94%，从遗传距离角度来看，两者亲缘关系较近。城口地区鸡源阳性样本与美国鸡源病毒株USA-Chicken-1的相似度为90%，在系统发生分析中，两者具有一定的关联性。基于多序列比对结果，使用MEGA软件构建系统发生树，选用邻接法并进行1000次自举检验。从构建的系统发生树（图2）可以看出，重庆地区的博尔纳病病毒株呈现出复杂的分支结构。牛源病毒株与欧洲奶牛源病毒株形成一个相对紧密的聚类，表明重庆地区牛感染的博尔纳病病毒可能与欧洲奶牛源病毒存在共同的进化起源，推测可能是通过动物引种或其他传播途径从欧洲引入。猪源病毒株单独形成一个分支，但与牛源病毒株分支和部分欧洲猪源病毒株分支相邻，说明猪源病毒与牛源病毒以及欧洲猪源病毒在进化上存在一定的联系。羊源病毒株与日本羊源病毒株处于同一分支，暗示重庆地区羊源病毒与日本羊源病毒可能具有相似的进化历程。鸡源病毒株形成独立的小分支，且与其他宿主来源的病毒株遗传距离相对较远，表明鸡源病毒在进化过程中可能经历了独特的演化路径，可能受到家禽养殖环境、免疫状况等因素的影响。在自举检验中，大部分分支的自举值大于70%，例如牛源病毒株与欧洲奶牛源病毒株聚类的分支自举值为80%，猪源病毒株分支的自举值为76%，羊源病毒株分支的自举值为78%，鸡源病毒株分支的自举值为72%，这表明系统发生树中各分支的可靠性较高，能够较为准确地反映不同地区、不同宿主来源的博尔纳病病毒株之间的亲缘关系和遗传进化关系。5.3地区内病毒分布差异探讨重庆地区不同区域间博尔纳病病毒分布存在差异，这与当地的养殖环境和养殖模式密切相关。万州、开州等渝东北片区是重庆重要的肉牛养殖区域，这里地势较为开阔，草场资源相对丰富，适宜肉牛的放牧养殖。养殖场相对集中，养殖规模较大，牛群之间的接触频繁。这种高密度的养殖模式为病毒的传播创造了有利条件，一旦有感染源进入牛群，病毒很容易通过直接接触或呼吸道传播在牛群中扩散。例如，养殖场K、养殖场L、养殖场M和养殖场N都检测出阳性样本，且部分养殖场的阳性率较高，如养殖场K的阳性率达到8%。相比之下，璧山、铜梁等地的散养户养殖规模较小，牛的养殖数量相对较少，且牛群之间的活动范围相对独立，接触机会较少，这在一定程度上降低了病毒传播的风险，因此散养户处牛血液样本的阳性检出率相对较低。在不同动物种群中，博尔纳病病毒的分布也存在明显差异。牛的感染率相对较高，达到6%，这可能与牛的养殖特点和免疫状况有关。牛是重庆地区重要的养殖家畜，养殖数量较多，且在养殖过程中，牛群的流动性较大，不同养殖场之间的牛可能会进行交易、引种等活动，增加了病毒传播的机会。此外，牛的免疫系统对博尔纳病病毒的抵抗力可能相对较弱，使得病毒更容易在牛体内感染和繁殖。猪的感染率为3.33%，相对较低。猪的养殖多采用规模化、集约化的方式，养殖场的卫生管理和防疫措施相对较为严格，如定期对猪舍进行消毒、对猪群进行疫苗接种等，这些措施有效地减少了病毒的传播和感染机会。羊的感染率同样为3.33%，羊主要分布在酉阳、秀山等山区，山区的养殖环境相对较为封闭，羊的活动范围有限，与外界的接触较少，这在一定程度上限制了病毒的传播。鸡的感染率为2%，鸡的养殖多为家禽养殖模式，养殖周期相对较短，且鸡舍的通风、卫生条件相对较好，不利于病毒的生存和传播。鸭未检测出阳性样本，可能是因为鸭的免疫系统对博尔纳病病毒具有较强的抵抗力，或者鸭在养殖过程中与感染源的接触机会较少。六、新疆与重庆地区检测结果比较与综合分析6.1两地病毒感染特征比较在宿主种类方面，新疆地区主要检测的宿主为马、驴、牛、羊，其中马的感染情况相对突出，在伊犁地区的多个养马场均有阳性样本检出。重庆地区检测的宿主包括牛、猪、羊、鸡、鸭，牛的感染在多个养殖场有体现，猪、羊、鸡也有一定比例的阳性样本检出。可以看出，两地检测的宿主种类有差异，新疆侧重于马、驴等传统畜牧动物，重庆则包含家禽以及具有地方特色的养殖动物如荣昌猪等。从感染率来看，新疆地区马的检出率最高，达到8%，部分养马场如伊犁地区的养马场E阳性率高达15%；驴的检出率为4.17%；牛的检出率为2%；羊的检出率为5%。重庆地区牛的检出率为6%；猪和羊的检出率均为3.33%；鸡的检出率为2%；鸭未检测出阳性样本。整体而言，新疆地区马的感染率高于重庆地区检测的任何一种动物，重庆地区牛的感染率在当地检测动物中相对较高，但低于新疆马的感染率。两地在不同宿主上的感染率存在明显差异，反映出病毒在不同地区不同动物种群中的感染偏好性和传播程度不同。在地域分布上，新疆地区阳性样本分布在伊犁、阿勒泰、塔城、喀什、阿克苏、和田以及乌鲁木齐等多个地区。伊犁地区作为新疆重要的畜牧业区，马的养殖集中，阳性样本较多；喀什地区羊的养殖量大，阳性样本也较为集中。重庆地区阳性样本分布在万州、开州、云阳、黔江、酉阳、秀山、荣昌、璧山、铜梁、合川、潼南、城口、梁平以及主城区周边等多个区县。万州、开州等渝东北片区是肉牛养殖集中区，牛的阳性样本较多；荣昌及周边是荣昌猪的主要养殖区，有猪阳性样本检出。可以发现，两地病毒感染在地域上均与当地的畜牧业养殖分布密切相关，养殖密集区更容易出现病毒传播和感染。6.2种系发生关系综合分析综合新疆和重庆地区的种系发生分析结果，从遗传进化角度来看，新疆地区马源病毒株与欧洲马源病毒株紧密聚类，表明其可能通过马匹贸易、引种等途径从欧洲传入新疆。新疆驴源病毒株与马源病毒株分支相邻，暗示两者在进化上具有一定关联，可能是在马感染病毒后，通过接触传播等方式，使驴感染并在进化过程中产生了一定分化。牛源和羊源病毒株分别形成独立分支，且与其他地区相应宿主来源的病毒株有一定遗传距离，说明它们在当地经历了相对独立的演化。重庆地区牛源病毒株与欧洲奶牛源病毒株聚类，推测是通过动物引种从欧洲引入。猪源病毒株与牛源病毒株分支相邻，且与部分欧洲猪源病毒株分支相关，表明猪源病毒与牛源病毒以及欧洲猪源病毒在进化上存在联系。羊源病毒株与日本羊源病毒株处于同一分支，暗示重庆地区羊源病毒与日本羊源病毒可能具有相似的进化历程。鸡源病毒株形成独立小分支，表明其在进化过程中经历了独特的演化路径。对比两地种系发生关系，新疆地区的病毒株种系与欧洲马、驴、牛、羊源病毒株存在一定关联，反映出新疆地区畜牧业与欧洲在动物交流方面可能对病毒传播产生了影响。重庆地区的病毒株种系除与欧洲相关外，羊源病毒株还与日本羊源病毒株相关，体现了重庆地区动物引种来源的多样性以及病毒传播路径的复杂性。从整体演化趋势来看，两地不同宿主来源的病毒株在进化过程中既有相对独立的演化，也存在因动物交流、环境因素等导致的基因交流和演化关联。随着时间推移，病毒可能会在不同宿主和地区继续发生变异和进化，需要持续监测和研究。6.3影响病毒分布和传播的因素探讨地理环境对博尔纳病病毒的分布和传播有着重要影响。新疆地区地域辽阔，拥有广袤的草原，是重要的畜牧业区。其独特的地理环境为马、驴、牛、羊等动物的养殖提供了天然的条件。在伊犁、阿勒泰等地区，草原资源丰富，动物养殖多以放牧为主，动物活动范围广，不同养殖场的动物之间接触机会较多。这种养殖模式使得病毒在动物之间传播的概率增加。例如，当一个养殖场的动物感染博尔纳病病毒后，在放牧过程中，可能通过直接接触、呼吸道分泌物等方式将病毒传播给其他养殖场的动物。而在沙漠、戈壁等环境恶劣的地区，动物养殖相对较少，病毒传播的机会也相应减少。重庆地区地形以山地、丘陵为主，气候湿润。在万州、开州等渝东北片区，地势相对开阔，草场资源适宜肉牛养殖，肉牛养殖规模较大且集中。养殖场之间距离较近，牛群之间的交流频繁，为病毒传播创造了有利条件。而在酉阳、秀山等山区，虽然也有羊的养殖，但山区地形复杂，交通不便，羊的活动范围相对受限，与外界接触较少，这在一定程度上限制了博尔纳病病毒的传播。动物贸易是博尔纳病病毒传播的重要途径。随着畜牧业的发展，新疆和重庆地区与国内外其他地区的动物贸易日益频繁。新疆地区作为我国重要的畜牧业基地，马匹贸易活跃，从欧洲、中亚等地引进了大量优良马种。在这个过程中，如果引入的马匹携带博尔纳病病毒，就可能将病毒带入新疆地区，进而在当地马群中传播。例如，伊犁地区的一些养马场从欧洲引进马匹后，在后续的检测中发现部分马匹感染了博尔纳病病毒，很可能是在引种过程中带入的。同样，重庆地区在引进牛、猪等优良品种时，也存在类似的风险。如果引进的动物来自病毒流行地区，且在引进前未进行严格的检疫，就容易导致病毒的传入和扩散。养殖方式也对博尔纳病病毒的传播产生影响。在新疆地区，部分养殖场采用规模化养殖方式，动物养殖密度较大。在这种环境下，一旦有动物感染病毒，病毒很容易在动物群体中快速传播。例如，在喀什地区的一些养羊场，羊的养殖数量较多，羊舍空间相对有限，羊之间的接触频繁。当一只羊感染博尔纳病病毒后，短时间内就可能导致同羊舍的其他羊感染。而在一些散养户中，动物养殖数量较少，活动范围相对独立，病毒传播的机会相对较小。重庆地区的养殖方式也呈现多样化。在荣昌及周边地区，荣昌猪的养殖多采用规模化、集约化的方式，养殖场管理相对规范，卫生防疫措施较为严格。这种养殖方式在一定程度上减少了博尔纳病病毒传播的风险。然而，在一些小型养殖场或散养户中，养殖环境和卫生条件相对较差，防疫意识薄弱，容易导致病毒的传播。例如，在璧山、铜梁等