动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-高二下学期生物人教版选择性必修33

运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种植之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？去除细胞壁杂种细胞再生

新细胞壁植物细胞融合脱

分化移

栽植物组织培养融合并筛选再

分化1970年人-鼠细胞融合实验灭活的仙台病毒诱导第2章

细胞工程第2节

动物细胞工程二、动物细胞融合与单克隆抗体【本节聚焦】1.什么是动物细胞融合技术？2.单克隆抗体是如何制备的？在临床上有哪些应用？一、动物细胞融合技术阅读P48-49，思考1.动物细胞融合技术的结果是？原理是？诱导方法有？意义是？应用有哪些？2.早期人们用怎样的方法获得抗体？该方法制备的抗体特点有？3.如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？4.结合图2-16，分析单克隆抗体的制备过程是怎样的？要经过几次筛选？一、动物细胞融合技术1.概念：2.结果：3.原理：4.方法：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞就有原来两个或多个细胞的遗传信息。细胞膜具有一定的流动性。物理方法：电融合法等化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：灭活病毒诱导法生物方法：灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。P49思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。一、动物细胞融合技术5.意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。(1)已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。6.应用：人们可以按照预先的设计使不同细胞融合，至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志结果意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性果胶酶和纤维素酶去除细胞壁胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株得到杂交细胞打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能7.动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较(1)生产方法二、单克隆抗体及其应用向动物反复注射某种抗原使动物产生抗体从动物血清中分离所需抗体产量低、纯度低、特异性差1.传统抗体产生（多克隆抗体的产生）(2)缺点某种抗原抗体【拓展1】对于一个抗原的刺激，每个B细胞只能合成并分泌一种识别抗原特定区域（抗原决定簇）的特异性抗体。只含有针对一个抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体（纯度高，特异性强，能准确识别抗原并与之特异性结合）一个抗原可有多个不同的抗原决定簇，因此一个抗原可刺激B细胞产生多种浆细胞，不同的浆细胞可产生针对不同抗原决定簇的多种抗体。这种由同一抗原诱导产生的针对多个抗原决定簇的抗体称为多克隆抗体，即传统抗体（产量低、纯度低、特异性差）克隆B淋巴细胞不具有无限增殖的能力，因此上述方案不可行。如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？一个B淋巴细胞B淋巴细胞群单克隆抗体产生动物体内产生的特异性抗体的种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。思考：如何制备单克隆抗体如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计实验获得了单克隆抗体，因此获得1984年诺贝尔生理学或医学奖。实验：把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。二、单克隆抗体及其应用2.单克隆抗体制备过程二、单克隆抗体及其应用2.单克隆抗体制备过程二、单克隆抗体及其应用2.单克隆抗体制备过程注射特定抗原免疫小鼠培养小鼠骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种细胞多种杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞注射小鼠腹腔内增殖体外培养小鼠腹水细胞培养液单克隆抗体诱导融合筛选1①未融合的、②融合的具有同种核的、③融合的杂交瘤细胞选择培养基筛选2克隆化培养抗体检测既能大量增殖，又能产生抗体分泌的抗体能与特定的抗原结合2.单克隆抗体制备过程二、单克隆抗体及其应用多种细胞筛选1筛选2原因目的方法原理诱导融合后得到多种杂交细胞，未融合的细胞、同种细胞融合后形成的细胞。筛选出杂交瘤细胞特定的选择培养基进行筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长选择培养由于特定抗原刺激产生多种B淋巴细胞，因此经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。筛选出能产生所需抗体（抗体检测呈阳性）的杂交瘤细胞克隆化培养和抗体检测，经多次筛选用96孔板培养和筛选：在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞，进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞抗原与抗体特异性结合1.筛选1特定的选择培养基，如HAT选择培养基含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）单克隆抗体制备中2次筛选的方法(1)细胞中合成DNA的2条途径①D途径：从头合成途径核苷酸某些氨基酸+CO2+叶酸+五碳糖+磷酸DNA合成碱基②S途径：补救合成途径利用非碱基成分合成DNA的过程利用核苷酸降解产物合成DNA的过程碱基+五碳糖+磷酸核苷酸DNA骨髓瘤细胞缺乏途径S相关的酶。【拓展2】(2)HAT选择培养基筛选原理未融合的B淋巴细胞融合的B淋巴细胞未融合的骨髓瘤细胞融合的骨髓瘤细胞杂交瘤细胞只能存活几天，不能无限增殖而死亡骨髓瘤细胞本身缺乏补救途径中相关酶，从头合成途径被氨基蝶呤阻断，无法增殖而死亡。骨髓瘤细胞从B细胞那里获得补救途径中相关的酶，可以利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷经过补救途径合成DNA，从而可以生存并增殖。H次黄嘌呤A氨基蝶呤T胸腺嘧啶核苷D途径：从头合成途径S途径：补救合成途径阻断提供原料杂交瘤细胞悬液96孔细胞培养板(克隆化培养)稀释加到抗体检测选择阳性克隆稀释加到用96孔板培养和筛选

杂交瘤细胞（每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞）2.筛选2---克隆化培养和抗体检测将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释，使分配到96孔板每个孔中的细胞数不超过1，通过培养让它增殖为单克隆。稀释加到克隆化培养放大杂交瘤细胞一般培养4~5d后，如果在倒置显微镜下见到一簇紧密生长的细胞，可认为这是单一克隆。经过一次克隆化培养的细胞不能保证其来自单个细胞，一般经过3~4次培养才可以获得稳定的单克隆。抗体检测选择阳性克隆重复以上操作不断纯化这时候，如果再次检测抗体为阳性，就可以进行大规模生产了。资料1:用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右。单克隆抗体的应用思考·讨论在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。单克隆抗体【思考】正常的性成熟女性每个月都会排卵，最佳受精时间为排卵后24-36小时。在女性的月经周期中，尿液中的促黄体生成素会在排卵前24小时左右出现高峰值。据此可推测，排卵试纸起核心作用的物质是

。抗促黄体生成素单克隆抗体排卵试纸资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。ADC示意图问题：细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害。解决方法：抗体-药物偶联物(ADC)，将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。抗体药物接头ADC的作用机制示意图①ADC②③④溶酶体裂解释放药物⑤细胞凋亡抗体药物接头抗体-药物偶联物抗原ADC被细胞吞噬优点：不损伤正常细胞用药量小毒副作用小肿瘤细胞讨论1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？①抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。②药物发挥治疗效应。如杀伤靶细胞。2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床上各具有什么优势？①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；②生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用,有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。③ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。讨论4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？①治疗方面：用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。②诊断方面：一些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。甲胎蛋白(AFP)是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为

免疫小鼠，制备

，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的

会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在

上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。抗原抗AFP单克隆抗体AFP肿瘤二、单克隆抗体及其应用3.单克隆抗体的优点(1)能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合。(特异性强，灵敏度高）(2)可大量制备。(1)运载药物(2)作诊断试剂(3)治疗疾病如将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合(抗体—药物偶联物)，可选择性杀伤肿瘤细胞。利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。2015年，全球销售额排名前十位的药物中，单克隆抗体药物就有5种。同年，我国的单克隆抗体药物市场规模已达72亿元。4.单克隆抗体的应用排名药物中文名销售额(亿美元)适应症类型1Humria修美乐199.36自身免疫疾病单抗6Herceptin赫赛汀70.32乳腺癌等多种癌症单抗7Avastin安维汀68.98结肠癌等多中癌症单抗8Rituxan美罗华68.01白血病单抗9Opdivo纳武单抗67.35多种肿瘤单抗2018年全球药物销售额排名前1