检验医学专业实验III重点-临床免疫学检验部分

临床免疫学检验部分

抗血清的制备

【原理】：用抗原刺激机体可以产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得的抗体的的特异性和

效价。在体外有目的的制备抗原，经初次、再次免疫的过程可以获得高质量的抗体。

【注意事项】

①制备佐剂时，一定要顺着同一方向用劲磨。

②检查油包水的方法：培养皿内加水，滴入混匀液，不散开即可.如果第1次检查不合格，第2次检查必须重新倒

水在平业.

③免疫动物皮内注射时，可以在足垫、腋下、背部等处多点注射，总剂量1ml/只。

凝集反应

颗粒性Ag或可溶性Ag(Ab)与载体颗粒结合成的致敏颗粒，与相应Ab(Ag)发生特异性反应.在一定条件下，

形成肉眼可见的凝集现象。

一、直接凝集反应：颗粒性Ag,与相应Ab直接结合。在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象.

(1)玻片法凝集反应：

【原理】：颗粒性Ag(细菌、红细胞等)，与相应Ab直接结合。在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。

【意义】：①定性试验，5r用已知抗体的诊断血清来测未知的抗原。②可用于细菌分型、ABO佥型鉴定等.

【结果观察】：

①对照区不发生凝集，为均匀浑浊的礼状液。

②试脸区，伤寒菌液(Ag)与相应的Ab发生反应，出现肉眼可见的凝集块，为阳性。如与对照相同则为阴性。

(2)试管法凝集反应：

【原理】：用已知细菌作为一定浓度的悬液Ag,与一系列稀释的受检血清混合，经静置保温后现察每管内颗粒性

Ag的凝集程度.

【结果观察】：

①先看好照管，应无凝集现象，轻摇试管，细菌分散均匀，混浊。再从第1管开始看.

②根据凝集度打“+”.

—:管底无沉淀，液体混浊，细菌分散均匀。

++++:管底有沉淀，上液澄清，细菌全部凝集。

+++:管底有沉淀，液体箱混，细菌1/4不凝集。

++:管底有沉淀，液体滉浊，细菌1/2不凝集

+:管底仅少量有沉淀，液体混浊。

效价判断：以出现“++”凝集的最大稀释度，为该血清的凝集效价。

二、间接凝集反应：必须借助颗粒性载体,将可溶性Ag（Ab）致敬载体，成致敏颗粒，再检测标本由相应的Ab（Ag）o

间接凝集反应（胶乳凝集抑制试验）：

【定义】：间接凝集反应：将可溶性Ag挂在一个无关免疫的载体（聚苯乙饰胶乳）上，制备成颗粒Ag,与其相

应的Ab相结合，为间接凝集反应。

以检测尿中HCG为例：

阳性：尿含HCG+抗HCGT+HCG胶乳颗粒T不凝集

阴性：尿不含HCG+抗HCGT+HCG胶乳颗粒T凝集

沉淀反应

【定义】：可溶性Ag+相应AbT形成肉眼可见的沉淀物质（Ag—Ab复合物）

一、对流免疫电泳

【原理】：利用电场的作用加强和加快双向犷散的一种方法。

在pH8。6的碱性缓冲液琼脂中进行电泳，带有较多负电荷的Ag泳向阳极，而Ab球蛋白等电点偏高（约为6--7）,

在pH8。6时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指也场中液体对固体支持物的相对移动）干扰

后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内即可相遇，在孔间两者分子比例合适的地方彩成沉淀线。

【意义】：对流免疫电泳主要用于检测标本中的抗原如AFP、HBsAg等。本法较双向琼脂扩散忖间大为缩短（一

般只需30分钟到1小时），且灵敏度比双扩高约数十倍。

沉淀线的位置与Ag、Ab分子电荷情况有关，也与Ag、Ab比例有关。有沉淀线为阳性，无沉淀线为阴性。

【特点】

优点：操作简便，观察结果快，敏感度比双扩高8-16倍。

缺点：分班率差，当有多种Ag、Ab系统存在时，形成的沉淀线位置易重登，难以分辨，所以用此目的时，不如双

扩。

二、双向琼脂扩散实验

【原理】：定性试验.月务可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，抗原抗体从孔内向四周扩散，在

两者对应比例适宜处形成沉淀线。

【意义】：可用已知抗原（抗体）来检测未知的抗体（抗原），同时检测抗原抗体的纯度。临床上常用来检测甲

胎蛋白［AFP）,作为原发性肝癌等的辅助诊断。

【结果判断】：

①在阳性对照孔与中间的抗体孔之间出现一条或多条白色沉淀线（一对抗原抗体系统即可出现一条沉淀线，如有

多对抗原抗体可出现多条沉淀线）。

②观察标本孔与中间的抗体孔之间有无出现沉淀线，有即为阳性，无即为阴性。

以上两实险的注意事项：

①浇琼脂板时注意动作要迅速，琼脂不要溢出玻片，成品琼脂板平整无气泡，打孔时，不要将琼脂划破；②加样

时，不要溢出孔外；③加样用的枪头不要混用。

三、免疫电泳

【原理】：区带电泳后进行双相琼脂■!广散实脸.

将待测标本置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因分子量及电泳迂移率不同，被分成肉眼不可见的若干区带。

电泳结束后，沿与电泳方向平行的两例开槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散.18—24h后，各区带蛋白与

相应的Ab在相应的位置上形成弧形沉淀线。Ag越多，沉淀线越靠近Ab槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组

分分析，仅为定性实验。

【用途】：定性实脸，主要用于纯化Ag和Ab成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别和鉴定等方面。

注意事项：①开槽处距玻片边缘＞5mm,开孔处〉7。5mm。②槽中加抗血清时，加满即可，切忌溢出。

四、单向琼脂扩散电泳

【原理】：单向琼脂扩散扩实脸是凝胶内免疫沉淀反应定量试脸。一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。定

量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适条件下，形成乳白色的沉淀环.沉

淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。

【意义】：单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定。

以上两实脸的注意事项：

制备抗体掠脂板时，琼脂温度必须严格控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性.

加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致.

ELISA（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay）

该技术基础是抗原或抗体因相化和酶标记的抗体或抗原，因相化和酹标记的抗原抗体仍保持其免疫活性°

在测定聆，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体

起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标

本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物

质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

常用的ELISA的方法有：间接法、夹心法、竞争法

乙肝两对半:

乙型肝炎病毒抗原T人体产生的相应抗体

HBsAgTHBsAb、HBeAgTHBeAb、（HBcAg）THBcAb

大三阳：HBsAg,HBeAg,HBcAb阳性。小三阳：HBsAg,HBeAb,HBcAb阳性。

【实验E的】：定性或定量测定人血清或血浆中乙型肝炎病毒表面抗体（抗HBs）,可用于判断乙型肝炎疫苗接

种效果和乙型肝炎病毒感染的治疗效果和预后情况。

【实险原理】：双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗一HBs（一步法）。

采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP进行孵育，当标本中存在抗一HBs时，该抗体与

包被HBsAg结合并与酶结合物形成HBsAg-抗HBs—HBsAg-HRP复合物。洗去游离反应物，加入显色剂后，将有明

显颜色变化。若标本中无抗-HBs时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化，在一定范围内，颜色的深浅变化

与标本的含量呈正比。

【结果判断】

未加终止液前，阳性孔呈蓝色，阴性礼和空白孔无色，标本孔如呈蓝色即为阳性，颜色深浅与标本中的抗HBs量

呈正比。

加终止液后，蓝色转为黄色，放入酶标仪中检测，使用0D450-492nm波长测定0D值，计算cutoff值，读数需在

终止反应后10分钟内完成.

cutoff值：C0V二阴性对照平均0D值X2。1

标本0口值2c0V为阳性，标本0口值WCOV为阴性。阴性对照0D值低于0。05,作0。05计算，高

于0。05按实际0D值计算。

免疫荧光色素技术

许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化

合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：

①异硫篇酸荧光素（FITC）:为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389。4,最大吸收光波

长为490—495nm,最大发射光波长520-530nm,呈现明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素c其主要优点是：

①人眼对黄绿色较为敏感,②通常切片标本中的绿包荧光少于红色。

②四乙基罗丹明；③四甲基异硫氨酸罗丹明等。

【实脸原理】：利用受光标记第二抗沐检测未知Ag或未知Ab的方法。以检测人血清中抗核抗体（ANA）为例。

小鼠肝细胞作为抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA,就会与细胞核成分发生特异性结合，

再加入荧光素标记的抗人IgG又可与ANA结合，在荧光显微镜下细胞核部位呈现荧光。

以检测血清中ANA（抗核抗体）为例。

鼠肝细胞+ANA（1:5血清），一抗+抗人IgG—FITC,二抗T荧光显微镜下观察T无荧光为阴性，有

荧光为阳性

【实脸结果】

细胞核发黄绿:色荧光为“+”，阳性待检血清作进一步稀释后可测定效价。不发荧光为“一”

根据细胞核着染荧光的图像，可区分为：

①均质性：细胞核呈均匀一致的荧光。

②周边性：核周呈现荧光.

③斑点型（颗粒型）：核内呈现斑点状荧光。

④核仁型：核仁部分呈现荧光。

⑤混合型：两种以上核染色。

【注意事项】：抗原片要新鲜，厚薄一致，要尽量薄。待检血清要新鲜.冲洗时要干净，动作要轻柔。观察结果要

及时，以免荧光漫灭.

补体CH50实验

【实验原理】：补体与抗体（溶血素）致敏的羊红细胞接触后，被激活（C1途径），从而使致敏的SRBC溶解，其溶

血程度与补体量呈正比。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反应，测定溶血程度，以50%溶血时

的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。以50$溶血判断结果比100%溶血灵敏、准确,

溶血素+SRBC,在补体的作用下T溶血

【实脸结果】

①对照管不溶；②目视比较，最接近标准管的一管。

根据U管中加入的血清量，求出总补沐值：补体活性（u/ml）=1/血清量（ml）X稀释倍数（20）

③无法E测的，用722在542nm处读T值也可。

大小吞噬实验

【实脸E的】：体内具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，主要包括血液中的中性粒细胞、单核细胞和组织中的巨

噬细胞。通过测定细胞的吞噬率、吞噬指数可了解吞噬细胞的吞噬功能。

一、小吞噬试脸

【实脸原理】：中性粒细胞具有很强的吞噬杀菌功能，当与颗粒性物质（细菌等）混合孵育一定时间后，颗粒性物

质被吞噬杀灭。根据吞噬率、吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。

【结果观察】：镜下可见RBC被染成红色，其它为蓝色，找到中性在细胞，计算吞噬率及吞噬指数。

吞噬率（阶二200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数/200X100%

吞噬指数二200个中性粒细胞中吞噬的细菌总数/200

二、大吞噬试验

【实聆原理】：血液中的大单核细胞游走至组织中形成巨噬细胞.，有吞嗤颗粒性物质的功能.

【实脸结果】：镜下可见梭形鸡RBC被巨噬细胞吞入胞浆内。

【注意事项】：

①、5%淀粉的作用：注射豚鼠后，诱导血液里的单核细胞进入组织里，变成巨噬细胞。

②、5%鸡RBC:有核，梭形，染色后核为蓝色，周围为红色。

③、巨噬细胞在吞噬后形态会不规则，不易找到；所以可先找到有核的鸡RBC,看是否被其他细胞包裹。如果包

裹物也有核，则为巨噬细胞.

PFC（溶血空斑形成试脸）

【定义】：溶血空斑形成试验是一种沐外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。故又称体外抗体形成细胞测

定技术。

【实脸Z的】：测定抗体生成细胞功能（B细胞产生抗体的能力）。

【实验原理】：将经SRBC免疫过的小鼠脾细胞与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围那些

受到抗体分子致敬的绵羊红细胞溶解。

抗体生成细胞（已致敏）+Ag（SRBC）+补体T溶血

【结果判断】取上清，722上413nm七色，检测上清中SRBC裂解释放的血红蛋白量（以0D值反映补体溶解SRBC

的程度）。

淋巴细胞功能测定系列实验

一、淋巴细胞分离实验

淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细

胞转化试脸及淋巴细胞培养（需无菌操作）。

淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保

持细胞应有活性.

【原理】：分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实脸目的可采用密度梯度离心法、吸附

分离法和其它特殊分离法。本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各

种细胞的密度不同，入红细胞密度为1。093,粒细胞为1.092,淋巴细胞为（1.074±0.001）,利用比重介于某两

类细胞之间的细胞分离液（等渗的果蔗糖一泛影葡胺，FicolI）对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度

梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。

二、E玫瑰花环形成试脸

【原理】：人T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER）,在一定的实险条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）

结合，形成玫瑰花结，称为EJ攵瑰花环试验（erythrocyte—roseetteformationtest）（＞该试验常用于临床检测

人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。

总E花环和活跃花环:

淋巴细胞与SRBC在4“C环境作用2h以上形成花环，代表外周血中T细胞总数占淋巴细胞的百分比，成为总E

花环实验（Et）.

如果两和细胞悬液混合后，不经37℃和4℃作用立即反应仍有部分淋巴细胞形成花环，称为活跃花环（Ea）,代

表对SRBC亲和力高的一个T细胞亚群。

①总花环实脸（Et花环）实验结果

计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计数200个淋巴细胞，计算E花环形成率，正常值为50%—80%。

E花环形成率=形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数（形成花结+未形成花结）X100%

②活跃花环试脸（Ea花环实脸结果）

Ea花环的结果代表T淋巴细胞中一类亚群，计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算E花环形成率,

正常值为20%-30%。

E花环形成率=形成花结的淋巴细胞数/淋巴细胞总数（形成花结+未形成花结）X100%

三、T淋巴细胞转化试脸

【原理】：T淋巴细胞与许多特异或非特异抗原在体外共同培养时，细胞的代谢和形态可以发生一系列的变化：细

胞形态向淋巴母细胞的转化；电荷的改变；细胞内蛋白质和核酸合成的增加。

【结果观察】：

①转化细胞：

淋巴母细胞：体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细网状，核/细胞比例变小。

过渡型淋巴细胞：类似母细胞。

核丝分裂相细胞：核体呈现有丝分裂，胞内可见组织染色体。

②未转化细胞：

成熟小淋巴细胞：体积小，核染色体致密，核/细胞比例大。

细胞类别转化细胞未转化细胞

母细胞过渡型

细胞体积（um）212・2012-166-8

细胞大小增大增大不增大

染色质疏松疏松密集

核仁1«4个有或无无

有丝分裂+或-,■

胞浆增色+++,

着色嗜碱嗜碱天青色

空泡+或•+或・,

伪足