生物化学实验：实验九 Western-Blot鉴定目的蛋白

实验九

WesternBlot鉴定目的蛋白实验原理SDS转膜结合一抗和二抗显色蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bmSDS实验原理170kd130kd95kd72kd55kd43kd34kd26kd17kd10kd预染karkerWesternBlottingWesternBlotting显色原理二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物。样品和抗体大肠杆菌可溶蛋白（含GST-纤维素酶融合蛋白）一抗鼠抗GST抗体二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体实验步骤SDS（每班做4版胶，用2个电泳槽）1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。3、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间。4、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。5、倒出水并用滤纸吸干，配好浓缩胶（10ml），轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。

※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。12%分离胶试剂名称12%分离胶ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速剂）10uL10%APS（催化剂，最后加）75uL总体积7.5mL试剂名称5%ddH2O1.7mL30%Acr-Bis（29:1）0.43mL1MTris-HCl（pH6.8）0.31mL10%SDS25uLTEMED（加速剂）10uL10%AP（催化剂，最后加）25uL总体积2.5mL5%浓缩胶6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。7、点样（待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点30ul样品，每板胶点5ul预染Marker（预染Marker是有颜色的，可以作为电泳和转膜的指示）。

加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，电泳2h。9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束10、撬开玻璃板，根据预染Marker和溴酚蓝的位置切去浓缩胶和多余的分离胶，（不要染色）SDS1、用尺量出胶的长度和宽度

2、用裁纸刀裁出12张与胶大小一样的滤纸和1张同样大小硝酸纤维素膜（NC膜）。

3、加10mL转膜缓冲液到培养皿中，将凝胶、NC膜、滤纸浸泡约5min。

4、将凝胶、NC膜、滤纸按照图示安装好。

5、20V电转移20-30分钟Westernblotting

转膜

（操作过程带手套）

5、取出NC膜，放在一个干净的容器内，加入10mL封闭液，平缓摇动30min。（封闭膜上非特异结合位点）6、回收封闭液，用10mLTTBS洗膜5min，重复3次。（洗去过量的奶粉）7、加入一抗溶液（10mL），摇动30min。（与抗原结合）8、回收一抗溶液，10mLTTBS洗膜5min，重复3次。（一抗可以重复使用）9．加入二抗溶液（10mL），摇动30min。（与一抗结合）10、回收二抗溶液，10mLTTBS洗膜5min，重复3次。（二抗可重复使用）杂交

一抗和二抗溶液必须回收！！显色

11、倒掉TTBS，加入显色液，摇动显色3-5min。12、倒掉显色液，用蒸馏水漂洗3-5min，晾干。预染Marker实验材料和试剂SDS试剂1、30%丙烯酰胺

29g丙烯酰胺，1gN，N’-亚甲基双丙烯酰胺，溶于60ml去离子水中，搅拌加热溶解后，补水至终体积为100mL。用滤纸过滤后避光4℃保存。2、10%AP（过硫酸铵）

0.1gAP，溶于1mL蒸馏水。存放一周以后会失效。3、10%SDS5gSDS，加水50mL。

4、1.5mol/LTris(pH8.8)18.15gTris

溶于80mL去离子水中，调pH至8.8，定容至100mL。5、1.5mol/LTris(pH6.8)18.15gTris

碱溶于80mL去离子水中，调pH至6.8，定容至100mL。6、5×SDSloadingbuffer1mol/LTris-HCl(pH6.8)12.5mLSDS5g

溴酚蓝0.25g

甘油25mLH2O12.5Ml

使用前按上述配方配50mL

的总量，使用时分装小管，每1mLbuffer加50uL巯基乙醇。SDS试剂WesternBlotting试剂1、转膜缓冲液

Tris3.0g

甘氨酸14.4g3.7%SDS10mL

甲醇200mL

加水至1L。2、10×TBS缓冲液

Tris12.1g

NaCl87.7g

溶于800mL单蒸水，调pH至8.0，加水至1L。3、TTBS缓冲液

100mL1×TBS缓冲液中加入50uLTween20。4、封闭液

5g脱脂奶粉溶于100mLTTBS中。5、DAB/NiCl

显色液

100mmol/lTris-HCl，pH7.510mLDAB储存液（40mg/ml）200uL

NiCl溶液（80mg/ml）50uL30%H2O230uLWesternBlotting