挑战杯决赛研究报告-杨文

研究报告葡萄糖与氟虫腈偶合物的构建及其导向性杨文刘秀殷文雅戴坤洪李玲玲陈玲指导老师徐汉虹教授华南农业大学资源环境学院，广州，510642 摘要：本项目设计合成了葡萄糖与杀虫剂氟虫腈偶合的4个偶合物。生物活性测定结果表明，其中偶合物1、偶合物2和偶合物3对亚洲玉米螟有良好活性，对白纹伊蚊的活性降低了20至180倍。导向性检测结果显示偶合物2和偶合物3均具有双向输导性，其中偶合物2主要向顶部幼嫩部分输导，而偶合物3主要向根部输导；偶合物4则仅向下输导到根部。关键词：农药葡萄糖偶合氟虫腈SynthesisoftheConjugatesofGlucoseandFipronilandtheTransportationoftheConjugatesinTobaccoYangWenLiuXiuYinWenyaDaiKunhongLiLinglingChenLingSupervisorProfessorXuHanhongResourceandEnvironmentCollege,SouthChinaAgricultureUniversityGuangZhou，510642 Abstract：Fourconjugatesofglucoseandfipronilweresynthesizedinthisresearch.AndtheywereevaluatedbyOstriniafurnacalis(Guenee)andAedesalbopictus.TheresultshowedthatthreeofthesehaverelativehighactivitytoO.furnacalis(Guene),andis20to180timesloweractivitytoA.albopictuthanfipronil.Referringtothetransportation,Twoofthesecantransportupanddownintobacco,onemainlyaccumulatedintheshootapicalmeristems,andtheothermainlyaccumulatedintheroot.Andanotheronecanonlyaccumulatedinroot.Key：pesticideglucosecouplingfipronil从20世纪50年代开始,人们使用大量有机合成农药，农药在施药过程中的浪费极为严重，在施药过程中，人们一般都努力使药剂覆盖整个害虫栖境，由于雾滴飘移和其它环境因素的影响，到达生物靶体的农药量极低。以植物体为间接靶体，农药的有效沉积率为2040%，损失浪费的农药约6080%；以蚊子为靶体，农药的有效利用率为1/3000；以农业害虫为靶体，有效利用率为1/1041/107。没有到达靶体的农药带来了环境污染、对非靶标生物的直接毒害以及严重的“3R”问题残留(Residue)、抗性(Resistance)及害虫再猖獗(Resurgence)等诸多弊端。近年来，随着IPM理论和可持续发展战略的实施和发展以及人类对环境和食品卫生要求的提高，世界农业正向持续农业、生态农业、环保农业、无公害农业发展。在这种形势下，目前新农药的研发首先应考虑其对环境的安全性和应用安全性[1]。降低农药残留及提高农药应用安全性的重要手段之一是减少农药的用量。怎样减少农药用量并保持或提高防效一直是农药研究者研究探索的目标。基于此，根据印楝素具有向云杉生长点运输并积累的现象，并结合许多有害生物在植物的特定部位为害的现象、农药在植物体内输导性研究进展和靶向医药的研究，徐汉虹教授于2001年提出了导向农药的构想。所谓导向农药就是指农药有效活性成分与导向载体偶联后能在植物体内向病虫害为害部位或为害造成的伤口定向累积的农药。也就是说，有害生物在什么地方为害，农药就向什么地方累积（徐汉虹，2001）[2]。导向农药有望人为改变农药在植物体内传导方向，使农药向特定部位积累，提高农药靶向性，减少用药量，降低使用成本，大大缓解农药残留问题。同时，还有望使高毒农药低毒化，提高农药使用安全性，降低制剂对人畜的毒性，减少对环境的污染。在该思路的指导下，本实验室选用各种氨基酸作为导向载体，合成出了系列氨基酸与农药的偶合物，取得的相关研究结果证实了导向农药研究的构想是可行的[36]。糖是生物体内的能量储藏物质和结构物质，可以在生物体内运输。近年来，已经有大量研究证实了植物内源糖在植物细胞间以及从源到库的长距离运输是由糖转运蛋白介导的。主要是单糖转运蛋白和二糖转运蛋白，前者可以运输各种单糖，后者主要运输植物光合作用的同化终产物蔗糖，这些内源糖优先供应幼嫩的茎、叶等生长中心，而这些部位正是病虫害集中为害的部位，也是除草剂首要攻击靶点。随着分子生物学技术的进步,许多植物糖转运蛋白(包括单糖转运蛋白和蔗糖转运蛋白)的cDNA已被克隆，至今为止，仅在拟南芥中发现了至少69个糖转运蛋白，其中至少26个为单糖转运蛋白；1989年，第一个编码植物单糖转运蛋白cDNA(HUP1)从低等单细胞的小球藻(Chlorellakessleri)中克隆出来；以后又从小球藻(HUP2)、烟草(MST1)、蓖麻(HEX3)、拟南芥(STP2、STP3、STP4)中相继克隆出单糖转运蛋白，它们转运的糖类可以是葡萄糖、果糖、半乳糖等；但有些转运蛋白具有一定的底物专一性,如HUP2是一个半乳糖H+共转运蛋白；同时单糖转运蛋白的基因表达具有组织特异性。2007年12月，美国Cornell大学AshleeMcCaskill和RobertTurgeon在美国《国家科学院院刊》发表论文验证了植物中产生的糖从合成部位(糖源)向其它部位(如花、果实、嫩叶等糖库)长距离转运积累的原理[716]。植物还可以吸收外源糖。藤井、Saftner、刘奎彬、马文荷和安志信等的研究表明植物可以吸收外源糖，并且吸收进入体内后较多的向植物的果实，幼嫩的茎、叶等生长比较旺盛的库性器官转运[1719]。同时糖具有特殊的生物学功能，如细胞识别、运动，抗微生物粘附等[2023]。糖基化修饰化合物具有特殊的性质如亲脂性、电负性或空间立体位阻得到改善，从而改善药代动力学性质，增强生物活性；大多数水溶性增大，具有良好的内吸性，易于被生物体接受、吸收，由此可大大提高生物利用度；稳定性增强；对某些类型细胞可进行特异性结合，提高对作用受体亚型的选择性而形成选择毒性；其转运得到细胞表面丰富的糖结合受体的协助[2427]。因而利用糖对已商品化的一些农药进行结构修饰，有望改善这些农药的内吸性、生物利用度、稳定性，选择毒性以及在植物体内的输导性。已经有相关的糖基修饰农药分子的研究[2831]，而本研究基于糖的生物学功能，以及糖可以在植物体内通过转运蛋白介导运输的特点，以糖为导向载体，将其与农药活性成分拼接，以期研制出能经植物韧皮部输导并向害物嗜食部位定向传导积累的糖基导向农药，其目标是提高农药在植物体内的导向性而提高防治效果，降低农药对非靶标生物的毒性、降低农药对环境的影响和提高农药的应用安全性。“点击”学是由Sharpless于2001年提出,点击反应一般是融合(fusion)过程(没有副产物)或缩合过程(产生的副产物为水)；很多“点击”反应不受水的负面影响,水的存在反而常常起到加速反应的作用。通过“点击”化学可以进行荧光标记。由于这些特性，“点击“化学起了化学家以及生物学家广泛的重视,并得以蓬勃的发展。将其应用与糖的研究已有报道[3240]。本研究利用“点击”化学及相关合成方法，选用叠氮葡萄糖与氟虫腈的炔丙基衍生物进行偶合，合成了4个含有三唑基、糖分子和药物分子的偶合物，研究了其导向性、对亚洲玉米螟及白纹伊蚊的活性。氟虫腈化学结构式氟虫腈化学结构式1材料与方法1.1实验材料氟虫腈原药和五乙酰基葡萄糖均为国产，其他用试剂原料均为市售。1.2偶合反应方法[31,32]1.2.1氟虫腈于室温下将氟虫腈溶于DMF中，然后加入K2CO3，充分搅拌后加入炔丙基氯，升温至50℃反应，经TLC监测反应完毕后降至室温，向反应体系中加入水，用二氯甲烷萃取和饱和食盐水洗涤后干燥，经浓缩用石油醚和乙酸乙酯硅胶柱层析得端炔化氟虫腈。1.2.2将叠氮糖和端炔化氟虫腈先后加入二甲基亚砜（DMSO）和H2O或叔丁醇（tBuOH）和H2O的混合溶剂中，然后加入维生素C钠盐和CuSO4·5H2O，于室温或40℃反应，TLC监测反应完毕后用二氯甲烷萃取和饱和食盐水洗涤后干燥，经浓缩用石油醚和乙酸乙酯硅胶柱析得偶合物1和化合物31.2将上述合成出来的乙酰基葡萄糖偶合物1和3悬浮或溶于甲醇中，搅拌20min后加入甲醇钠的甲醇溶液（0.5M），经TLC监测反应完毕后加入AmberliteIR120阳离子树脂调pH值至中性，过滤，滤液经浓缩和柱层析得产物偶合物2和偶合物4偶合物1偶合物偶合物1偶合物2偶合物偶合物3偶合物41.3毒力测定方法[41]1.3.1对亚洲玉米螟（Ostriniafurnacalis(Guenee)）以丙酮或甲醇为溶剂，将合成的化合物稀释成5个浓度系列，设置3个重复，每个重复10只供试试虫，用饲料伴毒法处理试虫。设溶剂为空白对照，氟虫腈原药为标准对照。处理后24小时检查结果，计算死亡率和校正死亡率，并以药剂浓度对数值与校正死亡率的机率值解毒力回归方程，计算相关系数和致死中浓度。1.3.2对白纹伊蚊（将合成出的化合物加到含有丙酮和0.1%吐温80的脱氯自来水中配制成系列浓度梯度的药液(注：丙酮/水的体积比控制在2%以下)，分别取各浓度的药液150ml均分于三只100ml烧杯中,然后分别向每只烧杯中加入白纹伊蚊四龄幼虫20只；另设含有丙酮和0.1%吐温80的脱氯自来水作为空白对照，以氟虫腈原药相同处理方法为标准对照，处理后12h检查结果，计算死亡率和校正死亡率，并以药剂浓度对数值与校正死亡率的机率值解毒力回归方程，计算相关系数和致死中浓度。1.4偶合物在烟草上的导向性检测[42]涂叶法施药：用0.1%吐温80的水溶液配制偶合物成0.55mmol/l的药液，采用涂叶法处理16～18叶期烟草叶片,各处理设3个重复，每一烟草植株为一重复。以未施药为空白对照，氟虫腈为标准对照。处理后48h分别取植株顶端幼嫩部位、根部、涂药叶等不同部位的样品各10g保存备用，运用液相色谱法测定偶合物在不同部位的含量。样品制备：将10g样品用研钵研碎后，置于100ml甲醇中过夜提取后抽滤，用30ml甲醇分次清洗残渣，收集合并滤液过无水硫酸钠柱，然后减压浓缩近干用甲醇定容至10ml。样品净化：自制1g/5mlC18固相萃取小柱，依次用5ml正己烷、甲醇、水预淋洗。然后取2ml上述甲醇样品装于柱上，并用1ml甲醇淋洗，收集后2ml洗脱液用于检测。高效液相色谱检测条件：Agilent1100高效液相色谱，紫外检测器，Agilent（250mm×4.6mm，5µm）C18反相色谱柱。进样量10µl，柱温30℃，流动相为不同体积比的乙腈和水，偶合物1和3为65：35，2和4为40：60，氟虫腈为58.5：41.5，流速1ml/min，检测波长偶合物1和3为210nm，2和4为207nm，氟虫腈为210nm。线性相关性测定：将药剂用甲醇配制成浓度为4、2、1、0.25mg/l药液，分别进样，重复3次，以峰面积对进样质量浓度做标准曲线，建立线性方程。添加回收率试验：准确添加4个偶合物和氟虫腈标准溶液于空白烟草样品中设3个添加浓度分别为5、0.5、0.1mg/kg，每个浓度设3个重复，按上述方法处理并测定，计算添加回收率。2结果与分析2．1毒力测定结果偶合物对亚洲玉米螟(O.furnacalis)的毒力见表2.1，对白纹伊蚊(A.albopictus)的毒力见表2.2。表2.1化合物对亚洲玉米螟(O.furnacalis)的毒力化合物毒力回归方程LC50(mg/L)相关系数化合物1Y=319+1.63x12.760.9971化合物2Y=2.37+1.94x22.900.9958化合物3Y=1.90+1.98x36.750.9972化合物4氟虫腈Y=4.08+1.85x3.150.9987表2.2化合物对白纹伊蚊(A.albopictus)的毒力化合物毒力回归方程LC50(mg/L)相关系数化合物1Y=3.66+1.56x7.510.9971化合物2Y=3.85+1.31x7.230.9956化合物3Y=1.88+1.80x53.460.9928化合物4氟虫腈Y=5.85+1.76x0.330.9996从以上两个表中可以看出，氟虫腈偶联葡萄糖以后，仅偶合物4对亚洲玉米螟和白纹伊蚊不具明显活性，而偶合物1、2和3对亚洲玉米螟具有良好活性，相比氟虫腈下降不大，但偶合物1、2，3对白纹伊蚊的活性比氟虫腈分别降低了20至180倍。2.2偶合物在烟草内的导向性检测结果2.2.14个偶合物及氟虫腈线性范围根据线性相关试验测定结果，求得药剂峰面积y对进样质量浓度x的线性回归方程及相关系数见表2.3，各相关系数（r）均在0.99以上，表明在40.25mg/l浓度范围内，对应峰面积呈良好线性关系。表2.34个偶合物及氟虫腈线性回归方程浓度（mg/l）线性回归方程相关系数（r）偶合物1y=20.19x0.9999偶合物2y=40.2x+0.0680.99969偶合物3y=64.178x5.110.9969偶合物4y=24.501x+4.39210.9999氟虫腈y=50.15x0.03830.99992.2.2检测方法的准确度和精密度4个偶合物及氟虫腈的添加回收率见表2.4，由表2.4可知4个偶合物和氟虫腈的平均回收率范围分别为81.693.2%、87.599.8%、81.392.2%、85.595.6%、83.195.7%，相应的变异系数分别在1.26.8%、1.36.1%、3.27.6%、4.76.1%、2.35.4%之间，以2倍基线噪音作为最小检出限（LOD）分别为0.2、0.1、0.1、0.2、0.1ng。相应的HPLC图谱见图15，由此可知该检测方法符合农药残留检测规定的要求。表2.44个偶合物和氟虫腈的添加回收试验结果偶合物1偶合物2偶合物3偶合物4氟虫腈样品添加浓度mg/kg平均回收率%变异系数RSD%平均回收率%变异系数RSD%平均回收率%变异系数RSD%平均回收率%变异系数RSD%平均回收率%变异系数RSD%施药叶片581.63.397.55.488.75.588.35.785.55.491.54.381.36.56.299.85.884.27.693.46.090.63.1顶芽585.61.287.84.289.05.493.25.488.73．189.91.390.13.293.95.689.65.090.53.292.24.395.64.788.45.0根部590.55.689.75.587，96.43.40.593.26.889.64.689.56.586.75.195．5.96.387.66.089.52.3标样1标样1空白叶1添加叶1图1偶合物1标样及空白叶和添加叶色谱图标样标样2空白叶2添加叶2图2偶合物2标样及叶片和添加叶色谱图标样3标样3空白叶3添加叶3图3偶合物3标样及叶片和添加叶色谱图标样标样4空白叶4添加叶4图4偶合物4标样叶片和添加叶色谱图添加叶添加叶空白叶标样图5氟虫腈标样叶片和添加叶色谱图2.3施药后48小时偶合物在烟草植株各个部位的分布 施药样品检测结果数据见表2.5，由此可知偶合物1在烟草植株中不具输导性，只在涂药叶片上检测到；偶合物2和3在烟草中具有明显的向顶部幼嫩部分和根部输导的特点，但偶合物2主要向顶部幼嫩部分，而偶合物3主要向根部输导；偶合物4则只向下输导到根部；氟虫腈在烟草中具有一定向顶端输导性。表2.5施药后48小时偶合物在烟草植株各个部位的分布（单位：mg/kg）药剂涂药叶顶端幼嫩部位根部偶合物12.5052NDND化和物20.72651.15880.9941偶合物30.81870.99141.4886偶合物40.9665ND2.8113氟虫腈1.640.4233ND3讨论由研究结果可知偶合物1、2和3对重要代表性螟虫类害虫亚洲玉米螟具有较好活性，表明氟虫腈偶联葡萄糖后对鳞翅目害虫活性降低不大。氟虫腈偶联葡萄糖后，其中三个偶合物具备了明显的累积性，但不同的偶合物输导性存在差异。而研究报道已经明确糖在植物体内可以被转运蛋白介导运输，本研究中合成的偶合物是糖基修饰的化合物，推测可能被植物体内的糖转运蛋白运输。可能由于转运蛋白的结构对底物有一定的选择性，因此不同的偶合物在烟草中的输导性有差异。由偶合物的结构可知，由于三唑环可以增加化合物的极性，同时在糖基中有乙酰基保护的比脱保护后为羟基的偶合物极性小，因此四个偶合物的极性由大到小依次为偶合物4、偶合物3、偶合物2和偶合物1。推测在烟草中偶合物可能随着光合同化产物在韧皮部液流中被运输，而由于结构和极性的差异，可能受不同的转运蛋白的介导，因此偶合物在烟草中的输导积累性有差异。极性最大的偶合物4主要向根部运输，而中间极性的偶合物2和3可以双向输导，极性最小的偶合物1不能输导；另外偶合物2主要输导到顶端幼嫩组织而偶合物3主要输导到根部，这可能是由糖基和三唑环两者协同作用的结果。糖基修饰化合物的性质对其在植物体内借助糖转运蛋白定向运输的影响有待进一步研究。利用植物生理学对糖转运蛋白功能结构的深入研究，将其应用到农药分子的开发设计中，合成可以借助糖转运蛋白定向运输到植物中害虫为害部位的新化合物，通过局部施药降低农药使用量，减轻其对环境的污染以及食品安全方面将起着举足轻重的作用。3结论本研究合成了四个糖基氟虫腈偶合物，经生测和导向性研究，筛选出了具有良好活性和导向性的偶合物，改善了氟虫腈在植物体内的输导性、使其在植物体内向特定部位积累，提高其靶向性，从而提高药剂有效利用率、降低农药用量及用药成本、提高农药的应用安全性。偶合物在植物体内降解情况还需要进一步研究，如果能在植物体内解偶联，生成高活性的氟虫腈，将达到最理想的效果。顶端累积对保护生长点，防治鳞翅目害虫有重要意义。根部累积性对防治根部有害生物更是意义重大。[参考文献]陈万义主编.新农药研究与开发.1996:28徐汉虹,张志祥,程东美,等.导向农药[J].世界农药,2004,26(5):3～10.李俊凯,徐汉虹,江定心等.吲哚乙酸引导下三唑醇的传导与积累研究初报[J].农药学学报,2005,7（3）:259～63.李俊凯.氨基酸和生长素介导的杀菌剂定向积累[D].华南农业大学博士论文,2006.江定心.氨基酸和生长素介导的杀虫剂传导与积累[D].华南农业大学博士论文,2006.杨路旭.伤诱导导向农药荧光导向载体的构建与表达[M].华南农业大学硕士论文,2007.龚月桦,高俊凤.高等植物光合同化物的运输与分配.西北植物学报,1999,19(3):564～570陈俊伟,张上隆,张良诚.果实中糖的运输、代谢与积累及其调控[J].植物生理与分子生物学学报,2004,30(1):1～10吴楚,朱能斌.植物中糖转运途径糖转运蛋白及其生理功能[J].20004,24(4):294～301陈俊伟,张上隆,张良诚.植物运输蛋白及其功能[J].浙江农业学报,2001,13(2):110～116曹义植,杨素铀.植物原生质膜的糖转运蛋白[J].植物生理学通讯讯,2000,36(2):153～157.Antony,Edna;Taybi,Tahar;Courbot,Mikaeletal.Cloning,localizationandexpressionanalysisofvacuolarsugartransportersintheCAMplantAnanasosus(pineapple)[J].JournalofExperimentalBotany(2008),59(7),18951908.Aluri,Sirisha;Buettner,Michael.DentificationandfunctionalexpressionoftheArabidopsisthalianavacuolarglucosetransporter1anditsroleinseedgerminationandflowering[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica(2007),104(7),25372542.WilliamsLE;LemoineR;SauerN.Sugartransportersinhigherplantsadiversityofrolesandplexregulation[J].Trendsinplantscience(2000),5(7),28390Reyes,Francisca;Marchant,Lorena;Norambuena,Lorenaetal.AtUTr1,aUDPglucose/UDPgalactoseTransporterfromArabidopsisthaliana,IsLocatedintheEndoplasmicReticulumandUpregulatedbytheUnfoldedProteinResponse[J].JournalofBiologicalChemistry(2006),281(14),91459151.FrancisC.Hsu,KingmoSun,DanielA.Kleier,etal.PhloemMobilityofXenobioticsVI.AphloemMobilePronematicideBasedonOxamylExhibitingRootSpecificActivationinTransgenicTobacco[J].Pestic.Sic.1995,44,9~19.马文荷,刘奎彬.青椒对外源糖的吸收与分配规律研究[J].河北农业大学学报,2000,23(1):37～39.刘奎彬,马文荷,安志信.黄瓜对外源糖吸收和运转的研究[J].华北农学报,1998,4,104～107.安志信,刘奎彬,马文荷,闻凤英;黄瓜、青椒对外源糖吸收、运转与分布研究[J].北方园艺,2001,3,13～14.CholletJF,RocherF,JousseC,etal.Synthsisandphloemmobilityofacidicderivativesofthefungicidefenpiclonil.PestManagementScience[J],2004,10:906~915.OsbornH.M.I..BestSyntheticMethods:Carbohydrates.Academicpress,2003,1～8.CholletJF,RocherF,JousseC,etal.Synthsisandphloemmobilityofacidicderivativesofthefungicidefenpiclonil[J].PestManagementScience,2004,10:906~915.黄思玲,凌沛学.糖生物学概述[J].食品与药品,2005,7(7):61～64.付新梅,江涛,王奎旗等.糖类对先导化合物的化学修饰及其在药学中的应用[J].中国海洋药物,2001,81(3):54～62.沈寅初.农用抗生素的新进展[J].农药译丛,1993,15(6):5～10.刘铁梅.糖基化芳香族氮芥衍生物的合成及抗肿瘤活性的研究[D].东北师范大学博士论文,2007.李研,巨勇,赵玉芬.氮杂唑合成反应在生物缀合物研究中的应用[J],有机化学,2006,26(12):1640～1646.陈茹玉,陈小茹.N异丙基O芳基O半乳吡喃糖基硫代磷酰胺酯的合成、结构及生物活性[J].高等学校化学学报,1994,15(11):1643～1646.曹玲华,周传健.N,N’二(糖基硫代亚脲基)芳基硫代膦酰二胺的合成.应用化学[J],2004,21（3）：239～242.孔繁祚.寡糖类农药的研制[J].环境化学,2000,19(4):293～299.王小明,朱涛,郑良玉等.βD吡喃型糖基取硫脲合成及生物活性研究.有机化学[J],2006,26(5）：660～666.董卫莉,赵卫光,李玉新等.“链接”化学及其应用[J].有机化学,2006,26(3):271～277.SrinivasChittaboina,FangXieandQianWang.Onepotsynthesisoftriazolelinkedglycoconjugates[J].TetrahedronLetters,

2005,46(13):2331~2336.AshleeMcCaskillandRobertTurgeon.PhloemloadinginVerbascumphoeniceumL.dependsonthesynthesisofraffinosefamilyoligosaccharides[J].PNAS,2007104(49):19619~19624.HartmuthC.Kolb,M.G.Finn,K.BarrySharpless.