三七总皂苷：对抗顺铂诱导HK-2细胞损伤的机制探究

三七总皂苷：对抗顺铂诱导HK-2细胞损伤的机制探究一、引言1.1研究背景癌症严重威胁人类健康，是导致全球死亡的主要原因之一。化疗作为癌症治疗的重要手段，在临床上广泛应用。顺铂（Cisplatin，DDP）是一种应用广泛的化疗药物，自1978年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床以来，在多种实体肿瘤的治疗中发挥了关键作用，如睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌等。顺铂通过与DNA结合，抑制DNA的复制和转录，从而阻止肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，达到抗癌的目的。尽管顺铂在癌症治疗中疗效显著，但其毒副作用也不容忽视，其中肾毒性是限制其临床应用的主要因素之一。顺铂的肾毒性可导致肾小管损伤，使肾功能指标如血尿素氮、肌酐升高，肌酐清除率降低。当总剂量累积到一定程度或单次剂量较大时，肾毒性风险显著增加，严重时可引发急性肾衰竭，这不仅影响患者的治疗进程和生活质量，还可能导致治疗中断，影响癌症治疗效果。据相关研究统计，接受顺铂化疗的患者中，约有25%-30%会出现不同程度的肾毒性。顺铂导致肾毒性的机制较为复杂，目前认为主要与氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡以及线粒体功能障碍等因素有关。顺铂进入肾脏后，可通过多种途径产生活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶、抑制抗氧化酶活性等。过多的ROS会攻击细胞膜、蛋白质和DNA，导致细胞膜脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤，进而引起细胞功能障碍和凋亡。线粒体是细胞的能量代谢中心，也是ROS产生的主要场所。顺铂诱导的线粒体损伤可导致线粒体膜电位下降、呼吸链功能受损、ATP合成减少，进一步加剧细胞能量代谢紊乱和氧化应激，最终引发细胞凋亡和肾损伤。随着对肾脏疾病研究的深入，中药在肾脏保护领域的作用逐渐受到关注。中药具有多成分、多靶点、整体调节的特点，在防治肾脏疾病方面展现出独特的优势和潜力。许多中药及其活性成分被证实具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，能够通过调节肾脏细胞的信号通路、改善肾脏微循环、减轻氧化应激损伤等途径，对肾脏起到保护作用。在糖尿病肾病的研究中，黄芪、丹参等中药提取物可通过抑制氧化应激和炎症反应，改善肾脏功能，减少蛋白尿的产生；在缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤模型中，一些中药复方能够调节细胞凋亡相关蛋白的表达，减轻肾小管上皮细胞凋亡，从而保护肾功能。三七总皂苷（PanaxNotoginsengSaponins，PNS）是从中药三七中提取的主要活性成分，其主要包含人参皂苷Rg1、Rb1、Rg3等多种皂苷类化合物。近年来，大量研究表明PNS具有广泛的药理作用，在心血管系统、神经系统、免疫系统等方面均表现出显著的保护作用。在心血管疾病的防治中，PNS可通过扩张血管、降低血压、抗血小板聚集、抗心肌缺血等作用，对心血管系统起到保护作用；在神经系统疾病方面，PNS能够穿越血脑屏障，调节中枢神经系统，减轻神经细胞损伤，对脑缺血再灌注损伤、帕金森病等具有一定的治疗作用。PNS还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性。然而，关于PNS对顺铂诱导的肾损伤的保护作用及机制研究相对较少，尤其是其对氧化应激损伤及线粒体自噬的影响尚不明确。因此，深入探究PNS对顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响，不仅有助于揭示其肾脏保护的潜在机制，为开发新型肾脏保护药物提供理论依据，还可能为临床防治顺铂肾毒性提供新的策略和方法，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究三七总皂苷对顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响，明确三七总皂苷在顺铂肾毒性模型中的作用效果。具体而言，将通过一系列细胞实验，检测细胞内活性氧水平、抗氧化酶活性、线粒体膜电位、线粒体自噬相关蛋白表达等指标，观察三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的干预作用，进而初步揭示其潜在的作用机制。本研究具有重要的理论意义和临床应用价值。在理论方面，通过研究三七总皂苷对顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响，能够丰富对中药肾脏保护机制的认识，为深入理解氧化应激、线粒体自噬与肾脏疾病的关系提供新的视角和实验依据，拓展中药药理研究的范畴，为进一步研究中药在肾脏疾病防治中的作用机制奠定基础。在临床应用方面，本研究结果可为临床防治顺铂肾毒性提供新的策略和方法。顺铂肾毒性严重影响患者的治疗效果和生活质量，目前缺乏有效的防治措施。若能证实三七总皂苷对顺铂肾毒性具有保护作用，将为临床医生在使用顺铂化疗时提供一种安全、有效的辅助治疗手段，减轻顺铂对肾脏的损害，降低肾毒性的发生率，保障化疗的顺利进行，提高患者的治疗依从性和生活质量。三七总皂苷作为中药活性成分，具有来源广泛、副作用相对较小等优势，其在临床中的应用有望减少患者对西药的依赖，降低治疗成本，为患者带来更多的益处。此外，本研究还可能为开发新型肾脏保护药物提供理论依据和研究思路，推动肾脏保护药物的研发进程，具有广阔的应用前景和市场价值。1.3研究现状顺铂作为一种广泛应用的化疗药物，其肾毒性是临床治疗中亟待解决的重要问题。目前，对于顺铂诱导HK-2细胞损伤机制的研究已取得一定进展。研究表明，顺铂进入肾脏后，主要通过有机阳离子转运体2（OCT2）被摄取进入肾小管上皮细胞，在细胞内经过一系列代谢过程，产生大量的活性氧（ROS）。过多的ROS会打破细胞内氧化还原平衡，导致氧化应激损伤，攻击细胞膜、蛋白质和DNA等生物大分子，引发细胞膜脂质过氧化、蛋白质变性以及DNA损伤。顺铂还可激活细胞内的凋亡信号通路，如线粒体凋亡途径，导致细胞色素C释放，激活半胱天冬酶（Caspase）级联反应，最终诱导细胞凋亡。顺铂还会干扰细胞内的能量代谢，抑制线粒体呼吸链复合物的活性，使ATP合成减少，影响细胞的正常生理功能。在中药肾脏保护作用的研究领域，众多研究表明，多种中药及其活性成分对肾脏疾病具有显著的保护作用。三七总皂苷作为中药三七的主要活性成分，近年来在肾脏保护方面的研究逐渐受到关注。已有研究显示，三七总皂苷在一些肾脏疾病模型中表现出良好的保护效果。在糖尿病肾病动物模型中，三七总皂苷能够降低血糖、减少尿蛋白排泄、改善肾脏病理形态学变化，其机制可能与抑制氧化应激、减轻炎症反应以及调节细胞凋亡相关蛋白表达有关。在缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤模型中，三七总皂苷可提高肾脏组织中抗氧化酶活性，降低脂质过氧化水平，减少肾小管上皮细胞凋亡，从而保护肾功能。然而，目前关于三七总皂苷对顺铂诱导的肾损伤的保护作用研究相对较少，其具体作用机制仍有待进一步深入探究。线粒体自噬与氧化应激之间存在着密切的关系，在肾脏疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。当细胞受到氧化应激等损伤因素刺激时，线粒体首先受到攻击，导致线粒体膜电位下降、功能受损，产生更多的ROS，形成恶性循环。为了维持细胞内环境的稳定，细胞会启动线粒体自噬机制，通过特异性识别并包裹受损线粒体，形成自噬体，然后与溶酶体融合，将受损线粒体降解，从而清除细胞内的有害物质，减少ROS的产生，保护细胞免受进一步损伤。在多种肾脏疾病模型中，线粒体自噬的异常调节与疾病的进展密切相关。在急性肾损伤模型中，增强线粒体自噬可以减轻肾小管上皮细胞的损伤，改善肾功能；而抑制线粒体自噬则会加重氧化应激损伤和细胞凋亡。在糖尿病肾病中，线粒体自噬的功能障碍导致受损线粒体堆积，进一步加剧氧化应激和炎症反应，促进肾脏病变的发展。目前，关于线粒体自噬在顺铂诱导的肾损伤中的作用机制尚未完全明确，三七总皂苷是否通过调节线粒体自噬来减轻顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤，也有待进一步研究证实。二、实验材料与方法2.1实验材料细胞：人肾小管上皮细胞（HK-2）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。该细胞属源于正常肾的近曲小管细胞，通过导入HPV-16E6/E7基因而获得永生化。HK-2细胞保留了指示分化良好的近端肾小管细胞（PTCs）的表型，如细胞碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、亮氨酸氨基肽酶、酸性磷酸酶、细胞角蛋白、α3、β1整合素和纤维连接蛋白呈阳性，同时保留了近端肾小管上皮的功能特征，如Na⁺依赖性/根皮苷敏感性糖转运和腺苷酸环化酶对甲状旁腺的反应性。在本实验中，HK-2细胞将作为研究对象，用于探究三七总皂苷对顺铂诱导的细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响。药品与试剂：三七总皂苷（纯度≥98%，批号：[具体批号]）购自成都曼思特生物科技有限公司，其主要成分包括人参皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1等多种单体皂苷，具有抗炎、抗氧化、改善微循环等多种药理活性。顺铂（纯度≥99%，批号：[具体批号]）购自江苏豪森药业集团有限公司，是一种临床常用的化疗药物，但其肾毒性是限制其临床应用的重要因素之一。DMEM/F12培养基购自Gibco公司，为HK-2细胞提供适宜的营养环境；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多种生长因子和营养成分，可促进细胞的生长和增殖；胰蛋白酶购自Sigma公司，用于细胞的消化传代；青霉素-链霉素双抗溶液购自碧云天生物技术有限公司，可防止细胞培养过程中的细菌污染。活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA法）购自碧云天生物技术有限公司，用于检测细胞内ROS水平；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性检测试剂盒、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，分别用于检测细胞内SOD、GSH-Px活性以及MDA含量，以评估细胞的氧化应激状态。线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）购自碧云天生物技术有限公司，用于检测线粒体膜电位的变化；线粒体绿色荧光探针（Mito-TrackerGreen）购自Invitrogen公司，可特异性标记线粒体，用于观察线粒体的形态和分布。兔抗人微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体、兔抗人Beclin1抗体、兔抗人p62抗体购自CellSignalingTechnology公司，用于检测线粒体自噬相关蛋白的表达；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于配合一抗进行Westernblot检测。其他常规试剂如氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。仪器：二氧化碳培养箱（ThermoScientific公司），为细胞提供稳定的培养环境，维持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），用于细胞培养过程中的无菌操作，防止微生物污染；倒置显微镜（Olympus公司），用于观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况；酶标仪（Bio-Rad公司），用于检测细胞内各种指标的吸光度值，如SOD、GSH-Px活性以及MDA含量等；流式细胞仪（BD公司），用于检测细胞内ROS水平和线粒体膜电位；激光共聚焦显微镜（Leica公司），用于观察线粒体的形态、分布以及线粒体自噬的发生情况；蛋白质电泳系统和Westernblot转膜系统（Bio-Rad公司），用于蛋白质的分离和转膜；化学发光成像系统（Tanon公司），用于检测Westernblot结果中的蛋白质条带。2.2实验方法2.2.1细胞培养与分组将人肾小管上皮细胞（HK-2）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，在37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期，进行实验分组。对照组：正常培养的HK-2细胞，仅加入等量的培养基，不做任何药物处理，作为实验的基础参照组，用于对比其他处理组细胞的各项指标变化，以明确药物处理对细胞的影响。顺铂组：在正常培养基中加入终浓度为20μmol/L的顺铂，作用24h，以诱导HK-2细胞发生氧化应激损伤及线粒体相关变化，模拟顺铂肾毒性导致的细胞损伤模型。研究表明，此浓度的顺铂可有效诱导HK-2细胞出现明显的损伤特征，如细胞活力下降、氧化应激水平升高等。三七总皂苷组：在正常培养基中加入终浓度为50μg/mL的三七总皂苷，作用24h。前期预实验通过检测细胞活力、氧化应激指标等，确定该浓度的三七总皂苷对HK-2细胞具有较好的保护作用且无明显细胞毒性。顺铂+三七总皂苷组：先加入终浓度为50μg/mL的三七总皂苷预处理HK-2细胞1h，再加入终浓度为20μmol/L的顺铂，共同作用24h。该组旨在探究三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞损伤是否具有保护作用，以及二者联合作用对细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响。2.2.2检测指标与方法细胞内活性氧（ROS）水平检测：采用DCFH-DA荧光探针法。具体操作如下，将各组细胞接种于6孔板中，每孔细胞密度为5×10⁵个。待细胞贴壁后，按照分组进行相应药物处理。处理结束后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2次。然后加入含有10μmol/LDCFH-DA的无血清培养基，37℃避光孵育20min。孵育结束后，再次用PBS清洗细胞3次，以去除未进入细胞的DCFH-DA。使用胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至流式管中，利用流式细胞仪检测荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为525nm。荧光强度越高，表明细胞内ROS水平越高。该方法利用DCFH-DA本身无荧光，可自由透过细胞膜进入细胞内，被细胞内的酯酶水解生成DCFH，DCFH在ROS的作用下被氧化为具有强荧光的DCF，通过检测DCF的荧光强度来间接反映细胞内ROS水平。线粒体膜电位检测：使用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）。将各组细胞接种于6孔板，每孔细胞密度为5×10⁵个，药物处理结束后，弃去培养基，用PBS清洗细胞2次。加入适量的JC-1工作液，37℃孵育20min。孵育完成后，用JC-1染色缓冲液清洗细胞3次。加入适量的PBS重悬细胞，转移至流式管中，利用流式细胞仪检测。正常情况下，线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体内形成聚合物，发出红色荧光；当线粒体膜电位下降时，JC-1不能聚集在线粒体内，以单体形式存在，发出绿色荧光。通过检测红色荧光与绿色荧光的强度比值（R/G）来反映线粒体膜电位的变化，R/G值越大，表明线粒体膜电位越高；R/G值越小，说明线粒体膜电位越低，提示线粒体损伤越严重。线粒体自噬相关蛋白表达检测：采用Westernblotting法。将各组细胞接种于6孔板，每孔细胞密度为5×10⁵个，药物处理结束后，弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞3次。向每孔中加入100μL含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30min。然后将裂解液转移至1.5mL离心管中，4℃、12000r/min离心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，煮沸变性5min。进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白分离后，电转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭1h，以封闭非特异性结合位点。分别加入兔抗人微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体（1:1000稀释）、兔抗人Beclin1抗体（1:1000稀释）、兔抗人p62抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，每次10min。加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。再次用TBST缓冲液清洗PVDF膜3次，每次10min。最后使用化学发光成像系统检测蛋白条带，以GAPDH作为内参，通过分析条带灰度值，计算各蛋白的相对表达量。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高、Beclin1表达上调以及p62表达下调通常提示线粒体自噬水平增强。三、三七总皂苷对顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤的影响3.1顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤模型的建立与验证为探究顺铂对HK-2细胞氧化应激损伤的影响，本实验将HK-2细胞分为对照组和不同浓度顺铂处理组（5、10、20、40μmol/L），处理24h后，采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平。结果显示，与对照组相比，顺铂处理组细胞内ROS水平显著升高，且呈浓度依赖性（图1）。当顺铂浓度为20μmol/L时，ROS水平升高最为明显，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明顺铂能够诱导HK-2细胞产生氧化应激损伤，且20μmol/L的顺铂可作为后续实验中诱导细胞氧化应激损伤的适宜浓度。注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。通过倒置显微镜观察细胞形态变化，进一步验证顺铂诱导的氧化应激损伤模型。对照组细胞形态规则，呈多边形或梭形，贴壁生长良好，细胞间连接紧密。而顺铂组（20μmol/L）细胞形态发生明显改变，细胞体积缩小，形态不规则，部分细胞变圆、皱缩，贴壁能力下降，细胞间连接松散，出现较多漂浮的死细胞（图2）。这些形态学变化表明顺铂对HK-2细胞造成了损伤，与ROS水平检测结果一致，证实顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤模型建立成功。A：对照组；B：顺铂组（20μmol/L）3.2三七总皂苷对细胞内ROS水平的影响采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞内ROS水平，结果如图3所示。对照组细胞内ROS水平较低，荧光强度为（100.00±5.62）。顺铂组细胞内ROS水平显著升高，荧光强度达到（256.34±12.56），与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），这进一步验证了顺铂可诱导HK-2细胞产生大量ROS，引发氧化应激损伤。三七总皂苷组细胞内ROS水平较对照组略有降低，但差异无统计学意义（P>0.05），表明单独使用三七总皂苷对正常HK-2细胞内ROS水平影响较小。顺铂+三七总皂苷组细胞内ROS水平明显低于顺铂组，荧光强度为（158.45±8.73），差异具有统计学意义（P<0.01），说明三七总皂苷能够显著降低顺铂诱导的HK-2细胞内ROS水平，对顺铂引起的氧化应激损伤具有明显的抑制作用。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01。3.3对氧化应激相关酶活性的影响超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）是细胞内重要的抗氧化酶，在维持细胞氧化还原平衡中发挥关键作用。SOD能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢（H₂O₂）和氧气，从而减少超氧阴离子自由基对细胞的损伤；CAT则可将H₂O₂分解为水和氧气，进一步清除细胞内的活性氧，保护细胞免受氧化应激损伤。为探究三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤过程中抗氧化酶活性的影响，本实验采用相应的试剂盒检测了各组细胞中SOD和CAT的活性。实验结果显示，对照组细胞中SOD和CAT活性维持在正常水平，分别为（125.67±8.56）U/mgprotein和（85.43±5.67）U/mgprotein。顺铂组细胞中SOD和CAT活性显著降低，分别降至（68.45±4.56）U/mgprotein和（42.34±3.21）U/mgprotein，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），表明顺铂诱导的氧化应激损伤导致了细胞内抗氧化酶活性的显著下降，削弱了细胞的抗氧化防御能力。三七总皂苷组细胞中SOD和CAT活性与对照组相比，无明显变化（P>0.05），说明单独使用三七总皂苷对正常细胞的抗氧化酶活性影响较小。顺铂+三七总皂苷组细胞中SOD和CAT活性明显高于顺铂组，分别升高至（98.76±6.54）U/mgprotein和（65.23±4.32）U/mgprotein，差异具有统计学意义（P<0.01），这表明三七总皂苷能够有效提高顺铂诱导损伤的HK-2细胞中SOD和CAT的活性，增强细胞的抗氧化能力，从而减轻顺铂所致的氧化应激损伤。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的终产物，其含量可反映细胞内脂质过氧化的程度，间接体现细胞受到氧化应激损伤的程度。MDA含量越高，表明细胞内脂质过氧化越严重，氧化应激损伤程度越大。本实验检测了各组细胞中MDA的含量，结果显示，对照组细胞中MDA含量较低，为（5.67±0.56）nmol/mgprotein。顺铂组细胞中MDA含量显著升高，达到（12.56±1.23）nmol/mgprotein，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），进一步证实顺铂诱导的氧化应激损伤导致了细胞内脂质过氧化加剧，细胞受到严重损伤。三七总皂苷组细胞中MDA含量与对照组相比，无明显差异（P>0.05），说明单独使用三七总皂苷对正常细胞的脂质过氧化水平影响不大。顺铂+三七总皂苷组细胞中MDA含量明显低于顺铂组，降至（8.45±0.87）nmol/mgprotein，差异具有统计学意义（P<0.01），这表明三七总皂苷能够显著降低顺铂诱导的HK-2细胞内MDA含量，减轻细胞的脂质过氧化损伤，对顺铂所致的氧化应激损伤起到保护作用。3.4细胞形态与活力变化在倒置显微镜下观察不同组别的HK-2细胞形态，结果显示，对照组细胞形态饱满，呈典型的多边形或梭形，贴壁生长状态良好，细胞间连接紧密，排列较为规则，细胞边界清晰，胞质均匀，细胞核形态正常（图4A）。这表明在正常培养条件下，HK-2细胞能够维持其正常的生理形态和功能。顺铂组细胞形态发生了显著改变，大部分细胞体积明显缩小，形态变得不规则，细胞皱缩且变圆，贴壁能力显著下降，许多细胞从培养瓶底部脱落，漂浮在培养液中，细胞间连接松散，细胞数量明显减少，同时可见较多细胞碎片（图4B）。这种形态学变化是细胞受到顺铂损伤的典型表现，反映了顺铂对HK-2细胞的毒性作用，导致细胞生理功能受损，无法维持正常的形态和结构。三七总皂苷组细胞形态与对照组相似，细胞形态饱满，贴壁生长良好，细胞间连接紧密，无明显的形态异常（图4C）。这说明在本实验所采用的浓度下，三七总皂苷对正常HK-2细胞的形态没有明显的不良影响，细胞能够保持正常的生理状态。顺铂+三七总皂苷组细胞形态相较于顺铂组有明显改善，细胞体积缩小和皱缩的程度减轻，贴壁细胞数量增多，细胞间连接有所恢复，漂浮的细胞和细胞碎片减少（图4D）。这表明三七总皂苷能够减轻顺铂对HK-2细胞形态的破坏，对顺铂诱导的细胞损伤具有一定的保护作用，有助于维持细胞的正常形态和结构。A：对照组；B：顺铂组；C：三七总皂苷组；D：顺铂+三七总皂苷组为了进一步量化细胞的存活状态，采用CCK-8法检测各组细胞活力，结果如图5所示。对照组细胞活力较高，OD值为（1.00±0.05），设定其细胞活力为100%。顺铂组细胞活力显著降低，OD值降至（0.45±0.03），与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），表明顺铂对HK-2细胞具有明显的毒性作用，能够抑制细胞的增殖，导致细胞活力下降。三七总皂苷组细胞活力与对照组相比，无明显差异（P>0.05），OD值为（0.98±0.04），说明单独使用三七总皂苷对正常HK-2细胞的活力没有显著影响。顺铂+三七总皂苷组细胞活力明显高于顺铂组，OD值升高至（0.68±0.04），差异具有统计学意义（P<0.01），表明三七总皂苷能够显著提高顺铂损伤的HK-2细胞的活力，对顺铂诱导的细胞毒性具有明显的拮抗作用，有助于保护细胞的增殖能力。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01。四、三七总皂苷对顺铂诱导HK-2细胞线粒体自噬的影响4.1线粒体形态与功能变化线粒体作为细胞内重要的细胞器，不仅是能量代谢的中心，还在细胞凋亡、信号传导等过程中发挥着关键作用。正常的线粒体形态和功能对于维持细胞的生理活性至关重要。在本研究中，利用线粒体绿色荧光探针（Mito-TrackerGreen）标记线粒体，通过激光共聚焦显微镜观察不同处理组HK-2细胞的线粒体形态，以探究顺铂和三七总皂苷对线粒体形态的影响。对照组细胞的线粒体呈现出细长、管状的形态，分布均匀，相互交织成网状结构，贯穿于整个细胞胞质中（图6A）。这种典型的线粒体形态表明细胞处于正常的生理状态，线粒体的结构和功能未受到明显影响。顺铂组细胞的线粒体形态发生了显著改变，线粒体明显肿胀、变短，呈球状或短棒状，且分布不均匀，部分区域线粒体聚集，而部分区域线粒体数量减少（图6B）。线粒体形态的这种变化是线粒体受损的重要标志，提示顺铂诱导的氧化应激损伤导致了线粒体结构的破坏，可能进一步影响线粒体的功能。三七总皂苷组细胞的线粒体形态与对照组相似，线粒体呈细长、管状，分布均匀，保持着正常的形态结构（图6C）。这表明单独使用三七总皂苷对正常HK-2细胞的线粒体形态没有明显的不良影响，细胞线粒体能够维持正常的生理状态。顺铂+三七总皂苷组细胞的线粒体形态相较于顺铂组有明显改善，线粒体肿胀程度减轻，部分线粒体恢复为细长的管状结构，分布也更加均匀（图6D）。这说明三七总皂苷能够减轻顺铂对HK-2细胞线粒体形态的破坏，对顺铂诱导的线粒体损伤具有一定的保护作用。A：对照组；B：顺铂组；C：三七总皂苷组；D：顺铂+三七总皂苷组线粒体膜电位（MitochondrialMembranePotential，ΔΨm）是反映线粒体功能的重要指标之一。正常情况下，线粒体膜电位维持在较高水平，以保证线粒体的正常功能，如氧化磷酸化、ATP合成等。当线粒体受到损伤时，线粒体膜电位会下降，导致能量代谢紊乱，进而影响细胞的正常生理功能。本研究采用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法），通过流式细胞仪检测各组细胞的线粒体膜电位变化。实验结果显示，对照组细胞的线粒体膜电位较高，红色荧光与绿色荧光的强度比值（R/G）为（2.56±0.12），表明线粒体膜电位处于正常水平，线粒体功能正常（图7）。顺铂组细胞的线粒体膜电位显著下降，R/G值降至（0.85±0.06），与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明顺铂诱导的氧化应激损伤导致了线粒体膜电位的明显降低，线粒体功能受损，可能影响ATP的合成，导致细胞能量供应不足，进而引发细胞损伤和凋亡。三七总皂苷组细胞的线粒体膜电位与对照组相比，无明显差异（P>0.05），R/G值为（2.48±0.10）。说明单独使用三七总皂苷对正常HK-2细胞的线粒体膜电位没有显著影响，细胞线粒体功能保持正常。顺铂+三七总皂苷组细胞的线粒体膜电位明显高于顺铂组，R/G值升高至（1.68±0.08），差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明三七总皂苷能够有效提高顺铂损伤的HK-2细胞的线粒体膜电位，减轻顺铂对线粒体功能的损害，有助于维持细胞的能量代谢平衡，保护细胞免受损伤。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01。4.2线粒体自噬相关蛋白表达线粒体自噬是一种高度保守的细胞内质量控制机制，对于维持细胞内环境稳定和线粒体功能的正常发挥至关重要。在这一过程中，一系列相关蛋白起着关键的调控作用，其中LC3、p62和Beclin1是研究较多且具有代表性的线粒体自噬相关蛋白。LC3，即微管相关蛋白1轻链3，在自噬过程中扮演着核心角色。它存在两种形式，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。在自噬诱导时，LC3-Ⅰ会被募集到自噬体膜上，并在一系列酶的作用下，与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，转化为LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的升高通常被视为自噬体形成和线粒体自噬活化的重要标志。p62，又称SQSTM1（sequestosome1），是一种多功能的衔接蛋白。它不仅可以与泛素化的蛋白质和细胞器结合，还能与LC3相互作用，从而将待降解的物质招募到自噬体中。在正常情况下，细胞内的p62会随着自噬流的进行而被不断降解，其表达水平相对稳定。当线粒体自噬发生障碍时，p62的降解受阻，导致其在细胞内大量积累。因此，p62的表达水平可以间接反映线粒体自噬的活性，p62表达下调通常提示线粒体自噬水平增强。Beclin1是自噬启动的关键蛋白之一，它可以与其他蛋白相互作用形成自噬相关蛋白复合物，参与自噬体的成核过程。Beclin1的表达上调能够促进自噬体的形成，进而增强线粒体自噬活性。为了深入探究三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞线粒体自噬的影响，本研究采用Westernblotting技术检测了各组细胞中LC3、p62和Beclin1蛋白的表达水平。结果如图8所示，与对照组相比，顺铂组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低（P<0.01），p62表达显著升高（P<0.01），Beclin1表达显著降低（P<0.01）。这表明顺铂诱导的氧化应激损伤抑制了HK-2细胞的线粒体自噬，导致自噬体形成减少，自噬流受阻，使得受损的线粒体无法及时被清除，进而加剧了细胞损伤。在三七总皂苷组中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、p62和Beclin1蛋白表达与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。这说明单独使用三七总皂苷对正常HK-2细胞的线粒体自噬相关蛋白表达无明显影响，细胞线粒体自噬维持在正常生理水平。而顺铂+三七总皂苷组细胞中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显高于顺铂组（P<0.01），p62表达显著低于顺铂组（P<0.01），Beclin1表达显著高于顺铂组（P<0.01）。这充分表明三七总皂苷能够显著上调顺铂损伤的HK-2细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，下调p62表达，上调Beclin1表达，从而促进线粒体自噬的发生，增强细胞对受损线粒体的清除能力，减轻顺铂诱导的线粒体损伤，对细胞起到保护作用。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01。4.3自噬小体的观察自噬小体是线粒体自噬过程中的关键结构，其数量和形态的变化能够直观地反映线粒体自噬的发生情况。为了进一步探究三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞线粒体自噬的影响，本研究运用透射电子显微镜对各组细胞中的自噬小体进行了观察。在对照组细胞中，仅能观察到少量的自噬小体，其形态较为规则，呈双层膜结构，内部包裹着部分线粒体或其他细胞成分，且自噬小体的体积较小（图9A）。这表明在正常生理状态下，HK-2细胞的线粒体自噬处于较低水平，细胞内的线粒体能够维持正常的功能和结构，不需要大量启动自噬机制来清除受损线粒体。顺铂组细胞中自噬小体的数量明显增多，然而这些自噬小体的形态却出现了异常。许多自噬小体呈现出肿胀、变形的状态，膜结构不完整，部分自噬小体内部的线粒体等内容物降解不完全（图9B）。这一现象说明顺铂诱导的氧化应激损伤虽然促使细胞启动了线粒体自噬，但自噬过程受到了阻碍，无法有效地完成对受损线粒体的清除，导致自噬小体在细胞内大量堆积，进一步影响了细胞的正常生理功能。三七总皂苷组细胞中的自噬小体数量与对照组相比，无明显差异，且自噬小体的形态正常，保持着典型的双层膜结构，内部包裹物清晰可见（图9C）。这充分说明单独使用三七总皂苷对正常HK-2细胞的线粒体自噬水平没有显著影响，细胞的自噬过程能够维持在正常的生理状态。顺铂+三七总皂苷组细胞中，自噬小体的数量相较于顺铂组有所减少，且形态明显改善。自噬小体恢复为较为规则的双层膜结构，内部线粒体等内容物降解较为完全，未见明显的肿胀和变形现象（图9D）。这一结果有力地表明，三七总皂苷能够有效地调节顺铂诱导的HK-2细胞线粒体自噬，促进自噬小体的正常形成和降解，增强细胞对受损线粒体的清除能力，从而减轻顺铂对细胞线粒体的损伤，保护细胞免受进一步的伤害。A：对照组；B：顺铂组；C：三七总皂苷组；D：顺铂+三七总皂苷组五、氧化应激损伤与线粒体自噬的关联及三七总皂苷的调节机制5.1氧化应激与线粒体自噬的内在联系氧化应激与线粒体自噬之间存在着紧密而复杂的内在联系，这种联系在细胞的生理和病理过程中起着至关重要的作用。在正常生理状态下，细胞内的氧化还原系统维持着动态平衡，活性氧（ROS）的产生和清除处于相对稳定的水平。然而，当细胞受到顺铂等外界因素的刺激时，这种平衡被打破，导致ROS大量产生，引发氧化应激损伤。顺铂诱导的氧化应激损伤对线粒体具有显著的影响。线粒体作为细胞内的能量代谢中心，富含电子传递链等重要结构，极易受到ROS的攻击。过多的ROS会导致线粒体膜脂质过氧化，使膜的流动性和通透性发生改变，破坏线粒体的正常结构。线粒体膜电位下降，影响氧化磷酸化过程，导致ATP合成减少，细胞能量供应不足。线粒体呼吸链功能受损，进一步加剧ROS的产生，形成恶性循环，导致线粒体功能严重障碍。为了应对氧化应激损伤，维持细胞内环境的稳定，细胞会启动线粒体自噬机制。线粒体自噬是一种选择性的自噬过程，其主要作用是识别并清除受损的线粒体，从而减少ROS的产生源，防止细胞受到进一步的损伤。在氧化应激条件下，受损的线粒体膜上会出现一些特定的分子标记，如泛素化修饰等。这些标记能够被自噬相关蛋白识别，进而招募自噬体前体，逐渐形成自噬体包裹受损线粒体。自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，在溶酶体酶的作用下，将受损线粒体降解，实现对受损线粒体的清除。线粒体自噬的发生对细胞命运有着重要的影响。适度的线粒体自噬可以及时清除受损线粒体，减少ROS的产生，维持细胞内的能量代谢平衡，从而促进细胞的存活和正常功能的发挥。在一些细胞损伤模型中，通过激活线粒体自噬，可以有效地减轻细胞损伤，提高细胞的存活率。然而，如果线粒体自噬过度激活，可能会导致大量正常线粒体被降解，细胞能量供应严重不足，最终引发细胞凋亡。线粒体自噬功能障碍也会导致受损线粒体在细胞内堆积，持续产生ROS，加剧氧化应激损伤，同样会诱导细胞凋亡。在神经退行性疾病如帕金森病中，线粒体自噬功能异常，导致受损线粒体无法及时清除，ROS大量积累，最终导致神经元死亡。5.2三七总皂苷的调节作用机制探讨从细胞信号通路层面来看，三七总皂苷可能通过激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路来发挥调节作用。PI3K/Akt信号通路在细胞存活、增殖、代谢以及抗凋亡等过程中起着关键作用。当细胞受到顺铂等损伤因素刺激时，PI3K/Akt信号通路可能被抑制，导致细胞功能障碍和凋亡。研究表明，三七总皂苷能够激活PI3K/Akt信号通路，促进Akt的磷酸化，进而上调下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调促凋亡蛋白Bax的表达，抑制细胞凋亡，保护HK-2细胞免受顺铂诱导的损伤。PI3K/Akt信号通路的激活还可能通过调节下游的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，影响线粒体自噬的发生。mTOR是细胞生长和代谢的关键调节因子，同时也是自噬的负调控因子。在正常情况下，mTOR处于激活状态，抑制自噬的发生；当细胞受到应激刺激时，mTOR活性被抑制，从而解除对自噬的抑制，启动自噬过程。三七总皂苷可能通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制mTOR的活性，从而促进线粒体自噬的发生，清除受损线粒体，减轻氧化应激损伤。在氧化应激相关信号通路方面，三七总皂苷可能通过激活核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路来增强细胞的抗氧化能力。Nrf2是细胞内重要的抗氧化转录因子，在维持细胞氧化还原平衡中发挥着关键作用。在正常情况下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）结合，处于无活性状态，被锚定在细胞质中。当细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2与Keap1解离，进入细胞核，与ARE结合，启动一系列抗氧化酶基因的转录表达，如血红素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO1）等。这些抗氧化酶能够清除细胞内的ROS，减轻氧化应激损伤。研究发现，三七总皂苷能够激活Nrf2/ARE信号通路，促进Nrf2的核转位，上调HO-1、NQO1等抗氧化酶的表达，从而增强HK-2细胞的抗氧化能力，减轻顺铂诱导的氧化应激损伤。在基因表达层面，三七总皂苷可能通过调节线粒体自噬相关基因的表达来影响线粒体自噬过程。如前文所述，线粒体自噬是一个复杂的过程，涉及多个基因的调控。其中，自噬相关基因（Atg）家族在自噬体的形成和成熟过程中起着关键作用。Atg5、Atg7、Atg12等基因编码的蛋白参与了自噬体膜的延伸和闭合过程；Atg16L1与Atg5-Atg12结合形成复合物，在自噬体的形成和自噬小体与溶酶体的融合过程中发挥重要作用。研究表明，三七总皂苷可能通过上调Atg5、Atg7、Atg12、Atg16L1等线粒体自噬相关基因的表达，促进自噬体的形成和线粒体自噬的发生，增强细胞对受损线粒体的清除能力。三七总皂苷还可能通过调节其他基因的表达，如线粒体生物合成相关基因，来影响线粒体的数量和功能。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）是线粒体生物合成的关键调节因子，能够激活核呼吸因子1（NRF1）和线粒体转录因子A（TFAM）等基因的表达，促进线粒体DNA的复制和转录，增加线粒体的数量和功能。有研究显示，三七总皂苷能够上调PGC-1α、NRF1、TFAM等基因的表达，促进线粒体生物合成，改善线粒体功能，从而减轻顺铂诱导的线粒体损伤。5.3相关信号通路验证为进一步明确三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的调节作用是否通过PI3K-Akt-mTOR等信号通路介导，本实验采用抑制剂实验进行验证。在实验中，选择了LY294002作为PI3K的特异性抑制剂。LY294002能够与PI3K的ATP结合位点竞争性结合，从而抑制PI3K的活性，阻断PI3K-Akt-mTOR信号通路的传导。将HK-2细胞分为以下几组：对照组、顺铂组、顺铂+三七总皂苷组、顺铂+三七总皂苷+LY294002组。其中，顺铂+三七总皂苷+LY294002组在加入三七总皂苷预处理1h及顺铂作用前30min，先加入终浓度为10μmol/L的LY294002进行孵育。在细胞内ROS水平检测中，对照组细胞内ROS水平处于正常状态，荧光强度较低。顺铂组细胞内ROS水平显著升高，表明顺铂诱导了强烈的氧化应激反应。顺铂+三七总皂苷组细胞内ROS水平明显低于顺铂组，说明三七总皂苷能够有效抑制顺铂诱导的ROS产生。而顺铂+三七总皂苷+LY294002组细胞内ROS水平相较于顺铂+三七总皂苷组显著升高，接近顺铂组水平（图10）。这表明抑制PI3K活性后，三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞内ROS水平升高的抑制作用被显著削弱，提示PI3K-Akt-mTOR信号通路参与了三七总皂苷对顺铂诱导的氧化应激损伤的调节过程。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01；与顺铂+三七总皂苷组相比，&&P<0.01。在线粒体膜电位检测中，对照组细胞线粒体膜电位正常，红色荧光与绿色荧光强度比值（R/G）较高。顺铂组细胞线粒体膜电位显著下降，R/G值明显降低，表明顺铂对线粒体功能造成了严重损伤。顺铂+三七总皂苷组细胞线粒体膜电位有所恢复，R/G值高于顺铂组，说明三七总皂苷能够减轻顺铂对线粒体膜电位的破坏。当加入LY294002抑制PI3K活性后，顺铂+三七总皂苷+LY294002组细胞线粒体膜电位再次下降，R/G值显著低于顺铂+三七总皂苷组，接近顺铂组水平（图11）。这进一步证实了PI3K-Akt-mTOR信号通路在三七总皂苷保护线粒体膜电位、减轻顺铂诱导的线粒体损伤过程中起到关键作用。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01；与顺铂+三七总皂苷组相比，&&P<0.01。对于线粒体自噬相关蛋白表达，对照组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值适中，p62表达维持在正常水平，Beclin1表达正常，表明细胞线粒体自噬处于生理平衡状态。顺铂组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，p62表达升高，Beclin1表达降低，显示顺铂抑制了线粒体自噬。顺铂+三七总皂苷组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，p62表达降低，Beclin1表达升高，说明三七总皂苷促进了线粒体自噬。在加入LY294002后，顺铂+三七总皂苷+LY294002组细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低，p62表达升高，Beclin1表达降低，接近顺铂组水平（图12）。这表明抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路后，三七总皂苷对线粒体自噬的促进作用被明显抑制，说明该信号通路参与了三七总皂苷调节顺铂诱导的HK-2细胞线粒体自噬的过程。注：与对照组相比，**P<0.01；与顺铂组相比，##P<0.01；与顺铂+三七总皂苷组相比，&&P<0.01。通过以上抑制剂实验结果可以得出，PI3K-Akt-mTOR信号通路在三七总皂苷调节顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬过程中发挥着关键作用。三七总皂苷可能通过激活该信号通路，抑制顺铂诱导的氧化应激损伤，促进线粒体自噬，从而对HK-2细胞起到保护作用。六、结论与展望6.1研究主要结论本研究通过一系列实验，深入探究了三七总皂苷对顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤及线粒体自噬的影响，得出以下主要结论：顺铂诱导HK-2细胞氧化应激损伤模型成功建立：实验结果表明，顺铂能够显著诱导HK-2细胞产生氧化应激损伤。在不同浓度顺铂处理HK-2细胞24h后，细胞内活性氧（ROS）水平呈浓度依赖性升高，当顺铂浓度为20μmol/L时，ROS水平升高最为明显，细胞形态也发生显著改变，表现为细胞体积缩小、变圆、皱缩，贴壁能力下降，细胞间连接松散，出现较多漂浮的死细胞。这些结果充分证实了顺铂可成功诱导HK-2细胞氧化应激损伤，且20μmol/L的顺铂可作为后续实验中诱导细胞氧化应激损伤的适宜浓度，为后续研究奠定了基础。三七总皂苷对顺铂诱导的HK-2细胞氧化应激损伤具有显著保护作用：与顺铂组相比，顺铂+三七总皂苷组细胞内ROS水平显著降低，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性明显升高，丙二醛（MDA）含量显著下降。这表明三七总皂苷能够有效抑制顺铂诱导的HK