（正式版）DB15∕T 2741-2022 《间接ELISA方法检测羊溶血性曼氏杆菌抗体》

152022-07-29发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件主要起草人：张月梅、赵世华、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、张帆、杨斌、刘I间接ELISA方法检测羊溶血性曼氏杆菌抗体本文件规定了应用间接ELISA检测羊溶血性曼氏杆菌抗本文件适用于羊溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原-抗体复合物，在一定底物参与下，复合物上的酶催化底辣根过氧化物酶horseradish与碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）常被用于免疫酶技术中的抗体或抗抗体的标记，而12一种作用极强的诱导剂，它可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。吐温-20tween-20一种蛋白质生物合成抑制剂，从卡那霉素链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)分离鉴定并经测序确定为溶血性曼氏杆菌的菌液制备全菌灭活抗原，并4.5碳酸盐包被液称取碳酸钠1.0g和碳酸氢钠3.0g,溶于800mL超纯水，调节pH值为9.4～9.6,用超纯水定容至调整pH值为7.4,超纯水定容至1000mL,121℃高压蒸汽灭菌15min。3量取5.0mL马血清溶于95.0mLPBS中。称取TMB200.0mg,无水乙醇(或二甲基亚砜)100mL,加超纯水至1000mL。4.11底物液B十二水合磷酸氢二钠14.60g,柠檬酸9.33g,0.75%过氧化氢6.4mL,调pH值为5.0～5.4,加超纯水至1000mL。称取胰酪胨15.0g,大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g,氯化钠5.0g,超纯水1000mL,混合，微热溶解，调节pH值为7.3,加入15.0g琼脂，加热融化后，121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却至约60℃,在无菌操作条件下倾注约20mL至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2℃~8℃称取胰酪胨15.0g,大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g,氯化钠5.0g,超纯水1000mL,混合，微热溶解，调节pH值为7.3,121℃高压蒸汽灭菌15min。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。值为7.3,121℃高压蒸汽灭菌15min。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。值为7.3,加入15.0g琼脂，加热融化后，121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却至约60℃,在无菌操作要求下倾注约20mL至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2℃~8℃保存。5.3天平：称量范围0g~500g,读数精确度0.01g。5.4恒温摇床：37℃。45.9血清稀释板(96孔一次性U型血凝板或96孔细胞培养板)。采血器室温静置2h,待血液凝固后，将其放入冰箱2℃~8℃3h后，4000r/min离心10min,用移血清样本若在一周内进行检测，可在冰箱中2℃~8℃保存，如果超过一周检测，应将样品置于-20℃保存，测试前应将样本提前恢复至室温。运输过程注意冷藏，可将采集的血清样本用冰袋、保温基中，37℃振荡培养过夜。振荡培养至0D6o为0.6,加入IPTG使其终浓度为1mmol/L,继续培养4h,离心收集菌体，将菌体沉淀悬57.2ELISA检测7.2.1包被：将目的蛋白用0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释为0.25μg/mL,按100L/孔加入至酶联反应板，置4℃冰箱过夜，次日甩掉包被液，用PBST洗涤酶联反应板3次。出后加PBST洗板3次。7.2.3加样：用PBS按体积比1:100稀释待检血清、阳性、阴性对照血清，稀释后血清100LL/孔，37℃恒温箱孵育1h,用PBST洗板3次。吸取不同血清时需要更换洗头。7.2.4加酶结合物：取稀释好的酶结合物，酶联反应板100μL/孔加注，37℃恒温箱孵育30min,洗7.2.5加底物显色：将底物液A和底物液B等体积混合制成的TMB底物显色液按100μL/孔加注，室7.2.6数据读取：用酶标仪在波长450nm处测定每孔的吸收值，每个样品每次平行2孔，取其平均