（正式版）DB15∕T 2785-2022 《食用向日葵品种纯度鉴定 SNP标记法》

152022-08-30发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定检测中心（巴彦淖尔市天赋河套质量标准检验研究中心）、本文件主要起草人：JIUHUANFENG（秀芳、侯敏、魏志恒、白君君、王祉诺、贾向春I食用向日葵品种纯度鉴定SNP标记法GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种GB/T6682分析实验室用水规格和品种在特征特性或DNA分子标记基因型方面一致性的程度。通常用供单核苷酸多态性singlenucleotidepoly124.1不同向日葵品种的基因组间存在核苷酸序列差异，其中单核苷酸(A、C、G、T)多态性(SNP)在基4.2利用一套多态性高、具良好基因型分型质量的推荐标记，检测供检样品中不同个体间的基因型差异，统计供检样品中异型个体数，从而对供检样品整体的遗传一致性程度进行测算，判——实时荧光定量PCR仪、全自动样品快速研磨仪、高速离心机、核酸浓度测定仪、微孔板离心——96孔深孔板、384孔PCR板(白色)、微量离心管、普通枪头、封板膜、钢珠等。6.1.1所用试剂至少为分析纯或分子生物学纯。试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一级水要求。 6.2.12mol/LTris-HCl溶液(pH8.0):称取Tris碱242.8g,溶于850mL水中，pH至8.0,定容至1000mL,高压灭菌。6.2.20.25mol/LEDTA溶液(pH8.0):称取84.06gNa₂EDTA·2H₂O,溶于900mL水中，加固体NaOH(约20g)调pH至8.0,加水定容至1000mL,高压灭菌。6.2.310%SDS溶液：称取100gSDS,加水定容至1000mL。6.2.4溶液I:取2mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.25mol/LEDTA溶液(pH8.0)、10%SDS各100mL,加水900mL,调pH至8.0,定容至1000mL。用时按2%(M/V)加入聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-6.2.5溶液Ⅱ:取500g醋酸铵固体，加水定容至860mL,抽滤后放4℃冰箱备用。37.1.2除供检样品外，必要时应提供对照7.1.3供检样品为种子时，重量应不低于500g。7.1.5依据需达到的品种纯度的国家规定的质量标准，试样数量应符合GB/T3543.5的规定，或通过Seedcalc8计算。比如，在95%置信水平，要达到96%、98%、9种子数应分别不少于100粒、200粒、400粒。——切取向日葵种子约1/3(通常选取非胚芽一端),或剪取叶片0.5cm~1cm大小，放入96深孔板中，每孔1个样品。放入4mm钢珠，加100μL溶液I,用全自动样品快速研磨仪50Hz研磨60s,重复2～3次，使样品完全破碎；——于4000rpm离心约3min,小心打开胶盖(注意避免样品间污染)。加500μL溶液I,盖——取上清液300μL移入新的96深孔板，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，盖上胶盖，颠倒混匀，-20℃静置10min。4000rpm离心15min,弃去上清液(勿使DNA倒掉);7.3.1总则依据检测目的，统筹考虑检测规模和成本，确定适宜的样品检测数量及标记数量。配制反应体系时，每板应同时设置2个无DNA模板阴性对照(NTC)。根据NTC信号强弱，判断最适扩增循环数。若NTC信号过高，则应降低——选择遗传多态性高、基因组上分布均匀、基因型分型——本文件优先选用了17个SNP分子标记作为推荐标记(见附录A),用于检测所有试样个体的——对于仍处于遗传分离或不稳定的标记位点应予以剔除。若17个推荐标记中，有3个以上标推荐用量(μL）2×1×Primer_AlleleXPrimer_AlleleY----8.2.3判定杂交种的品种纯度是否达到国家规定的质量标准、合同和标签标注指标要求，使用GB/T48.2.4判定亲本或原种的品种纯度是否达到国家规定的质量标准、合同和标签标注指标要求，可按照）；纯度%51GTGTAAGATGTGGTAGACG2GCATATTAACAGGCAAGAACAGCATATTAACAGGCAAGAACAGTCTGTAATGATCTTGCAGC3GAAATTCCGGTCCCGCATTCGGACTTTGGTTTTGAGGATC4GGCTTACCATCTTGACATTATGCTTACCATCTTGACATTATGGTATGGCATCAACGAGGTATCCA5CAAGGGTTGTATACAACACAAAAGGGTTGTATACAACACAAAGCAAGCTGCAAGTTTCTTTAGCA6ATGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGAGTTGTGTTATGCAAGTGAGAGACACCTTAACGATATTAACCCGA7TACGATGACGTTGTGGAACGCCTGATTTTAGATGGATCGTC8GAGAGCGAGTTCACCAACATAAAGAGCGAGTTCACCAACATA9GCATCATCAAAGAATCGAGCTACATCATCAAAGAATCGAGCAATTAAATTTCATTATGCTAGCTCAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGAAAGTTCATAACAGAGAAGATTTTCAGCGAAACCTTGTGAAACTTGTTGATCTTTGACACCACCAAACTCTAGCTTTGACACCACCAAACTCTAGTACATCCAAGGTTATGAAGAGATAATGGTTTCCCGGTCGAAGATAATGGTTTCCCGGTCGAAACCGAACCGGCTCCTCCGTGATAACGAAAGATCACACCATAACGAAAGATCACACCGGGGCCGTGAAGTTGAAGGATAGTTAGACGAAGACGATAAGGTAGACGAAGACGATAAGGTTAT