《无菌操作技术实践》复习学案

7/7第一章无菌操作技术实践一、无菌技术1.概念：无菌技术不仅能防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。2.消毒与灭菌的区别与联系消毒是指使用____________的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌则是指使用________________杀死物体内外____________，包括__________和________。消毒属于部分________。消毒灭菌的方法有：（1）煮沸消毒法；（2）灼烧灭菌；（3）干热灭菌；（4）高压蒸汽灭菌；（5）紫外线灭菌；（6）化学消毒法。其中常用消毒灭菌方法参见下表：种类主要方法应用范围酒精灯火焰灼烧微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或三角瓶口等电热鼓风干燥箱160℃～170℃玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等，凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品60℃～85牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体100℃含有葡萄糖或氨基酸等不耐高温药品的培养基等100℃微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备121℃培养基及多种器材、物品30W紫外灯照射30min接种室空气用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等【训练1】下列为某同学在培养金黄色葡萄球菌实验中的部分操作步骤，其中正确的是（）A.培养基中蛋白胨、牛肉膏溶化后，直接补充蒸馏水至100mLB.培养基配制完毕可直接使用C.加压至100kPa之前，要彻底排出锅内的冷空气D.将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，灭菌后立即伸入菌液试管内挑取少量菌种二、测定微生物数目实验中几个问题讨论问题1：两位同学用涂抹平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106培养基中，第一位同学在该浓度下涂布一个平板，统计的菌落数为230；第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的实验如何改进？给我们什么启示？问题2：在做本实验时，甲同学筛选出的菌落与其他同学不同，并且没有设置对照。你认为甲同学的结果产生的原因可能有哪些？请你帮助甲同学排除可能影响实验结果的因素。由此你得到的启示是什么？【训练2】请根据所学知识回答以下问题：（1）有2位同学用涂抹平板法测定同一土壤样品的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，并且取平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的合理性。①甲同学________，原因是____________________________________________。②乙同学________，原因是_____________________________________________。③正确做法是_____________________________________________________________________________________________________________________________。④涂抹平板法所用培养基按物理性质划分属于________培养基。⑤倒平板前保证培养基无菌的常用方法是______________________。（2）生物工程常需分离酵母菌和Taq耐热菌，分离方法常用选择培养基。如用加高浓度食盐的适宜培养基，分离金黄色葡萄球菌。请提出从含细菌、酵母菌和Taq耐热菌的培养液中分离酵母菌和Taq耐热菌的方案。①分离酵母菌：______________________________________________________。②分离Taq耐热菌：_____________________________________。三、外源激素的种类和浓度常用于植物组织培养的植物激素有两大类：________类和________________类。生长素类的主要作用是重新启动____________，使已停止分裂的植物细胞_____。常用的生长素类似物有2,4—二氯苯氧乙酸（2,4－D）、萘乙酸（NNA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。植物生长素通常被用来诱导__________________。不同植物种类对生长素浓度的反应不同，对多数植物材料的离体培养而言，2,4－D是生长素类中诱导愈伤组织形成和实现细胞悬浮培养的最有效的物质，常用浓度为0.2～2.0mg/L，较高浓度的2,4－D溶液对组织培养中再生芽和再生根的诱导非常有效。植物的生根多数是用生长素单独实现的。适宜浓度的脱落酸可抑制不正常胚状体的形成，防止胚状体过早萌发。细胞分裂素类的主要作用是________________________，能使茎增粗，但抑制茎伸长，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长。常用的细胞分裂素有激动素（KT）、6—苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）等。细胞分裂素在诱导愈伤组织时，一般要和生长素配合使用，增加生长素的诱导作用效果。当诱导出胚性愈伤组织之后，进行愈伤组织的增殖（继代）、分化再生植株或诱导形成体细胞胚时，细胞分裂素的独特作用就得到了体现，因为此时培养基中生长素的浓度一般要降低甚至除去。在愈伤组织的诱导、器官发生和细胞增殖过程中，细胞分裂素和生长素的含量比例是非常重要的。当细胞分裂素与生长素的含量比值________时，产生不定芽；反之，产生________；比值适中时，促进____________的生长。【训练3】在植物组织培养过程中要使用植物激素，但不同的植物激素的浓度以及使用的先后顺序和用量的比例都影响细胞的分裂、分化。下列叙述中错误的是（）A.先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化B.先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化C.生长素与细胞分裂素用量比值低，有利于芽的分化，抑制根的形成D.不使用植物激素，有利于愈伤组织的形成四、无土栽培技术与植物组织培养技术的比较1.无土栽培（1）原理：利用溶液培养法。（2）含义：把植物生长发育过程中所需要的各种矿质元素，按照一定比例配成营养液，营养液中不含有机物及植物激素。把植物栽种于营养液中，并放在适宜条件下培养。2.植物组织培养（1）含义：是在无菌条件下，把植物器官或组织片段切下来，接种在适当的培养基中进行离体培养，经脱分化形成愈伤组织，再分化发育成植物体。（2）过程：培养基的________、________（包括接种室、接种箱、操作者、外植体消毒灭菌）、________、____________等。其培养基包括矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物。（3）培养过程中的注意点：培养过程中更换培养基，调节植物生长调节剂（植物激素）的种类及比例，一般先诱导生芽，然后诱导生根，最后移栽发育成植株。提醒：无土栽培技术不需要保证无菌的条件，而植物组织培养技术要求严格的无菌条件。【训练4】无土栽培与植物组织培养培养液相比，不含有的成分是（）A.矿质元素B.水C.植物激素D.微量元素

参考答案一、2.较为温和强烈的理化因素所有的微生物芽孢孢子灭菌灼烧灭菌干热灭菌巴氏消毒法间歇灭菌法蒸汽持续灭菌法高压蒸汽灭菌法紫外线消毒化学药物消毒训练1C[培养基的配制应该先加水，后加热溶化，否则培养基会被烧焦；培养基配制完毕要经过灭菌后才能使用；在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，当压力上升到100kPa时，锅内的温度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底；接种时，接种环放到酒精灯火焰上灼烧灭菌是应该的，但不能立即伸入菌种试管内，否则会将菌种烫死。]二、问题1第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实验例示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。问题2甲同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由 于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种：一种方案是可以由其他同学用与甲同学一样的土样进行实验，如果结果与甲同学一致，则证明甲无误；如果结果不同，则证明甲同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。训练2（1）①不合理没有设置重复组，结果不具有说服力②不合理其中1个计数结果与另2个相差太远（或在操作过程中可能出现错误，或只简单地计算了平均值）③在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否相当，结果差距太大，意味着操作有误，需要重新实验④固体⑤高压蒸汽灭菌法（2）①用加抗生素的选择培养基分离酵母菌②用高温培养条件