T-GDPMAA 0021-2025 缺血性脑卒中动物模型评价技术规范 第2部分：非人灵长类动物

ICS07.080CCSB44GDPMAAStandardforestablishmentofanimalmodelsforcerebralischemicstrokePart2:Nonhumanpr（本文件完成时间：2025.07.29）IT/GDPMAA0021—2025 2规范性引用文件 3术语和定义 4动物质量及饲养要求 5动物模型制备方法 5.1电凝法 5.2栓塞法 5.3光化学法 6评价方法 6.1脑损伤磁共振扫描评价 6.2神经功能评价 6.3运动功能评价 6.4延迟记忆评价 6.5组织病理诊断 7结果判定 7.1磁共振成像病变特征 7.2脑梗死体积 7.3神经功能 7.4运动功能 7.5延迟记忆 7.6组织病理 T/GDPMAA0021—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广东省生物技术研究院（广东省实验动物监测中心）提出。本文件由广东省精准医学应用学会归口。本文件起草单位：广东省生物技术研究院（广东省实验动物监测中心）、中山大学附属第一医院、广西医科大学附属第一医院、深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）。本文件主要起草人：张钰，关雅伦，范玉华，刘竞丽，黄忠强，张健，党超，叶子明，陈相任，刘尧，李韵峰，李舸，金毅，秦超，曾进胜。T/GDPMAA0021—2025缺血性脑卒中（cerebralischemicstroke,CIS），是指脑组织局部因血液循环障碍，导致缺血缺氧发生，进而引起脑组织坏死的一类疾病。流行病学调查显示，CIS是我国排名第二的致死性疾病，年发病率约为247/10万人，死亡率约为115/10万人，未来随着人口结构的老龄化，我国CIS的发病率将持续升高，高致死和致残率将给社会和家庭造成严重负担，因此，近年来CIS已经成为重大慢性非传染性疾病研究的热点方向之一。非人灵长类脑结构与人类高度相似是开展脑疾病研究最理想的模式动物。非人灵长类构建的缺血性脑卒中动物模型在国内外已被广泛应用于CIS发病机制研究和药物评价，因此，本标准将依据经典的非人灵长类CIS模型，对缺血性脑卒中动物模型制备及评价技术进行规范。1T/GDPMAA0021—2025缺血性脑卒中动物模型评价技术规范第2部分：非人灵长类动物本文件规定了非人灵长类缺血性脑卒中模型制备的动物质量和饲养要求、制备方法、评价方法和结果判定。本文件适用于非人灵长类缺血性模型的制备及应用评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物配合饲料营养成分GB14925实验动物环境及设施T/CALAS104-2021实验动物实验猴神经行为评价规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1缺血性脑卒中cerebralischemicstroke是指各种原因导致的脑组织血液供应障碍，并由此产生的缺血缺氧性坏死，进而出现神经功能障碍的一类临床综合征。3.2神经功能评价量表neurologicalfunctionassessmentscale用于评估动物模型神经功能缺损程度和恢复情况的工具，评价内容包括意识水平、感觉系统、运动系统和骨骼肌协调等。3.3运动能力评价motorfunctionassessment利用不同动物运动评价设备，如步态分析系统等，观察动物在不同情境下的运动行为变化，用于测试和评价动物的运动能力。3.4延迟记忆评价long-termmemoryassessment利用动物认知测试设备，如威斯康辛通用测试装置等，观察动物辨别物体能力以及对刺激信号的反应，用于测试和评价动物的工作记忆行为学变化。3.5核磁共振成像magneticResonanceImaging（MRI）利用原子核在磁场中产生的磁共振信号来生成动物组织器官内部结构变化的图像。4动物质量及饲养要求4.1非人灵长类质量应符合GB14922的要求。2T/GDPMAA0021—20254.2饲养环境应符合GB14925的要求。4.3饲料应符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5动物模型制备方法5.1电凝法非人灵长类动物缺血性脑卒中模型构建的常用方法，手术操作简单。通过电凝器永久性阻断实验猴的大脑中动脉，造成脑缺血损伤。具体方法如下：5.1.1术前准备非人灵长类动物术前禁食12小时，自由饮水。进行麻醉、备皮、消毒等准备工作。5.1.2麻醉术前注射麻醉剂进行诱导麻醉，术中采用呼吸麻醉机进行维持麻醉，手术过程中保温，同时给予适量的镇痛药物。5.1.3手术非人灵长类动物侧放固定在手术台上，头固定于立体定位仪上。通过开颅手术暴露大脑中动脉。使用电凝器对大脑中动脉进行电凝处理，阻断其血流，造成脑缺血损伤。电凝的位置和程度需要根据实验需求进行精确控制。术后，依次缝合肌肉和皮肤，并对伤口皮肤消毒处理。动物苏醒后，放入饲养笼中进行护理。5.1.4术后护理术后动物比较虚弱，需注射抗生素3-5天，给予流质食物。必要时，注射甘露醇降低颅内压，减少动物死亡，给予镇痛，减轻动物的疼痛和痛苦。术后6小时后可通过MRI扫描确定脑梗死情况。5.2栓塞法非人灵长类动物缺血再灌注模型构建的常用方法。利用X射线成像设备或数字减影血管造影设备的精确成像能力，结合微导管技术，将栓塞材料精准地送入目标血管（如大脑中动脉从而实现血管的闭塞。具体方法如下：5.2.1术前准备非人灵长类动物术前禁食12小时，自由饮水。进行麻醉、备皮、消毒等准备工作。5.2.2麻醉术前注射麻醉剂进行诱导麻醉，术中采用呼吸麻醉机进行维持麻醉，手术过程中需保温，同时给予适量的镇痛药物。5.2.3手术非人灵长类动物仰卧固定在手术台上，通过X射线成像设备或数字减影血管造影设备对脑血管进行造影检查，明确大脑中动脉的位置、形态及血流情况。根据动物血管大小选择合适的导管，在X射线成像设备或数字减影血管造影设备的引导下，将微导管经股动脉穿刺置入，并引导至大脑中动脉的预定位置。通过微导管向大脑中动脉注入栓塞材料（如自体血栓凝块、弹簧圈、球囊等观察成像图像以确认栓塞效果。缺血60分钟后撤除球囊、弹簧等实现再灌注模型制备。手术过程中去除部分颅瓣降低颅内压，减少动物死亡。5.2.4术后护理术后动物比较虚弱，需注射抗生素3-5天，给予流质食物。必要时，注射甘露醇降低颅内压，减少动物死亡，给予镇痛，减轻动物的疼痛和痛苦。术后6小时后可通过MRI扫描确定脑梗死情况。5.3光化学法3T/GDPMAA0021—2025非人灵长类缺血性脑卒中模型构建的常用方法，创伤面小，可精准定位。利用光敏剂（如玫瑰红）在特定强度光照下发生光化学反应，在大脑的照射局部产生脑水肿和血小板微血栓，进而形成局灶性脑梗死。具体方法如下：5.3.1术前准备非人灵长类动物术前禁食12小时，自由饮水。进行麻醉、备皮、消毒等准备工作。5.3.2麻醉术前注射麻醉剂进行诱导麻醉，术中采用呼吸麻醉机进行维持麻醉，手术过程中需保温，同时给予适量的镇痛药物。5.3.3手术选定大脑中动脉远端或其他需要模拟卒中的脑区作为照射部位，插入光纤，静脉注射玫瑰红（35mg/kg）3分钟，使用激光（15mW）光源对选定的部位进行连续照射30分钟，移去光源，缝合骨膜、皮肤，并对伤口皮肤消毒处理。5.3.4术后护理术后动物比较虚弱，需注射抗生素3-5天，给予流质食物。必要时，注射甘露醇降低颅内压，减少动物死亡，给予镇痛，减轻动物的疼痛和痛苦。术后6小时后可通过MRI扫描确定脑梗死情况。6评价方法6.1脑损伤磁共振扫描评价6.1.1非人灵长类脑缺血性卒中模型可分为4期，超急性期（0-6小时），急性期（6-72小时），亚急性期（3-10天），慢性期（10天以后）。6.1.2检测脑水肿变化可采用弥散加权成像。6.1.3检测脑梗死损伤变化可采用扫描T1加权成像和T2加权成像。6.1.4检测脑梗死体积可采用T2加权成像图像测量，在每个脑冠状切片上圈选出脑梗死灶边界及对侧正常半脑边界，利用ImageJ软件计算梗死面积，将所有切面梗死灶面积和对侧正常半脑面积相加后乘以切片厚度，得到梗死灶体积及对侧正常半脑体积。式中：CIVR——Cerebralinfarctionvolumeratio，脑梗死体积比；IIV——Ipsilateralhemisphereinfarctzonevolume，患侧半脑梗死组织体积；CBV——Contralateralhemispherebrainvolume，对侧正常半脑体积。6.2神经功能评价参照T/CALAS104-2021中6.1和7.1进行。6.3运动功能评价6.3.1利用步态分析设备评价动物四肢行走及协调能力。实验应在独立安静的环境中开展，测试前动物需禁食。造模前对动物进行训练，确保动物在匀速运动的跑步机上正常行走。造模后动物可以正常饮食和运动后，连续3天对动物进行步态视频录制，录制时长不少于10s。利用运动轨迹分析软件，对录制视频中动物各个标记关节进行分析，获得动物行走过程中的步频、步幅、步长、步间隔等数据，评价动物的运动功能。6.3.2运动感知行为评价参照T/CALAS104-2021中6.4和7.4进行。6.4延迟记忆评价参照T/CALAS104-2021中6.2和7.2进行。4T/GDPMAA0021—20256.5组织病理诊断动物安乐死后，对脑组织进行灌注固定，分离脑组织，在4%多聚甲醛中进行固定保存，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋制成蜡块，切成4μm厚度切片，然后结合评价需要，选择进行苏木素-伊红、尼氏或Fluoro-JadeC等染色并封片。组织切片应包含梗死灶及周边半暗带组织，观察梗死灶和半暗带组织神经元坏死及炎症细胞活化情况。7结果判定7.1磁共振成像病变特征脑缺血后的磁共振成像病变特征包括：超急性期、急性期、亚急性期、慢性期。7.1.1超急性期在梗死区域弥散加权成像可显示明显的高信号，病变区表现为脑回部肿胀、脑沟部变浅、灰白质界限不清晰。7.1.2急性期T1加权成像呈低信号、T2加权成像呈高信号、弥散加权成像高信号，脑室由于受压会出现变形、移位，中线结构向对侧移位，表现为局部的脑沟和脑裂消失。7.1.3亚急性期表现T1加权成像低信号、T2加权成像高信号、梗死区弥散加权成像低信号。增强扫描可出现脑回状强化，显影逐渐变淡。7.1.4慢性期病灶逐渐液化，周边胶质增生带呈高信号、弥散加权成像呈低信号。梗死区域局灶性脑萎缩，形成软化灶，类似于脑脊液的信号。7.2脑梗死体积磁共振成像计算动物脑梗死体积比，评价造模后梗死体积大小。7.3神经功能神经功能评分由意识水平（0-28分），感觉系统（0-22分），运动系统（0-32分），骨骼肌协调性（0-18分）组成，总分越高表明神经功能损伤越严重。7.4运动功能7.4.1利用步态分析设备进行步态评价，连续3天评价的平均数作为实验结果，造模后的各肢体采集数据与造模前相比出现统计学上的显著性差异时可判定动物出现四肢行走及协调功能损伤。7.4.2利